Десмоидные фибромы (ДФ) — гетерогенные доброкачественные опухоли, возникающие из глубоких мышечно-апоневротических структур. Они инфильтрируют окружающие мягкие ткани, но не метастазируют. ДФ состоят из веретеновидных клеток (фиброцитоподобных) и избыточного количества коллагеновых волокон. Опухоль лишена капсулы и по периферии глубоко проникает в виде тяжей между мышечными волокнами, приводя к их атрофии. Помимо этого, десмоиды способны распространяться на значительные расстояния от основной опухоли в виде узких тяжей, длина которых иногда достигает 20–30 см.
ДФ могут развиваться практически в любой анатомической части тела. В зависимости от локализации их подразделяют на экстраабдоминальные (брюшная стенка, грудная клетка, конечности, шея, область малого таза) и интраабдоминальные (брыжейка, забрюшинное пространство). В связи с тем, что ДФ не метастазируют, формально их следовало бы отнести к доброкачественным новообразованиям. Но из-за присущего им агрессивного роста и склонности к многократным рецидивам после хирургического лечения они более соответствуют злокачественным опухолям [1].
ДФ могут достигать огромных размеров и при ряде локализаций приводят к летальному исходу. Частота ДФ в популяции составляет 2–4 случая на 1 млн человек в год [2]. Эффективное лечение ДФ остается сложной клинической проблемой из-за инфильтративного роста и локального агрессивного поведения. Традиционно методом выбора является хирургический. Однако частота рецидивов после операций варьирует от 45 до 90% [3].

Десмоидные опухоли возникают спорадически, а также могут быть связанными с семейным аденоматозным полипозом (САП) — наследственным заболеванием толстого кишечника, приводящим к развитию рака толстой кишки. Наибольшая доля случаев возникновения САП является следствием мутаций в гене, отвечающем за развитие полипоза толстого кишечника, или АРС (adenomatous polyposis coli gene). В 10–15% случаев у пациентов с САП обнаруживают ДФ. Риск развития ДФ у пациентов с САП составляет 2,56 случаев на 1000 пациентов в год, что в 852 раза выше, чем в общей популяции [2]. В отличие от спорадических ДФ, САП-ассоциированные ДФ в 80% случаев интраабдоминальные. Десмоидный фиброматоз преимущественно встречается у женщин и может манифестировать в любом возрасте, но чаще ДФ развиваются в возрасте 30–40 лет. В большинстве случаев САП-ассоциированные ДФ возникают в течение 5 лет после перенесенной операции [4].

Природа возникновения спорадических ДФ неясна. У пациентов с этим заболеванием были описаны случаи выявления соматических мутаций в гене APC, но чаще всего такие мутации обнаруживают в гене β-катенина [5–6], который задействован в Wnt-сигнальном пути. Мутации в гене CTNNB1 (ген β-катенина) приводят к накоплению продукта этого гена в ядре фибробластов, что, в свою очередь, нарушает путь дифференцировки клетки и межклеточные взаимосвязи [7].
Генетические причины возникновения ДФ и их связь с клиническими проявлениями этого заболевания в настоящее время недостаточно изучены. Поскольку ДФ с высокой частотой возникают при САП, естественным кандидатом, обусловливающим предрасположенность и к спорадическим случаям ДФ, выступает ген АРС. Однако данные мировой литературы по исследованию герминальных мутаций в гене АРС при спорадических случаях ДФ пока немногочисленны [8, 9].
Целью работы было изучить выборку пациентов со спорадическими случаями ДФ, не имевших признаков аденоматозного полипоза и родственников, страдающих САП и ДФ, и определить возможную значимость герминальных мутаций гена АРС у таких пациентов. Для сравнения было решено отдельно исследовать молекулярные характеристики гена АРС среди пациентов с ДФ при САП.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили в лаборатории молекулярной генетики СНЗ ФГБНУ «МГНЦ им. Н. П. Бочкова» с 2012 по 2017 г. Изучали две выборки пациентов. Первая выборка состояла из 51 человека с ДФ (21 мужчина, 30 женщин) в возрасте от месяца до 60 лет (рисунок); медиана составила 16,8 лет. Образцы крови получили от пациентов, обратившихся в МНИОИ им. П. А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Критерии включения пациентов в исследование: наличие основного диагноза ДФ; отсутствие на момент проведения исследования характерных жалоб со стороны желудочно-кишечного тракта, позволяющих заподозрить диффузный полипоз толстой кишки; отсутствие семейной истории САП; отсутствие случаев возникновения ДФ у родственников. Таким образом, все случаи ДФ в этой выборке рассматривали как спорадические.
Десмоидные опухоли имели различную локализацию (на спине, в области грудной и брюшной стенок, на конечностях, интраабдоминально). У 11 пациентов наблюдали мультифокальный рост ДФ (см. раздел «Результаты исследования»). У части пациентов ДФ рецидивировали.

При исследовании 65 пациентов с САП (образцы крови получили из Государственного научного центра колопроктологии им. А. Н. Рыжих) была сформирована вторая выборка, в которую вошли 12 человек: 2 мужчин и 10 женщин. Возраст возникновения ДФ у больных варьировал от 24 до 57 лет; медиана составила 32,5 лет. Критерии включения в исследование: наличие полипоза толстой кишки; наличие ДФ. Наследственность по САП отягощена у 8 человек. У четверых пациентов семейная история не прослежена. Все ДФ возникли после проведения оперативного вмешательства и были локализованы на передней брюшной стенке или интраабдоминально, преимущественно являлись единичными.

Определение мутаций в гене АРС проводили в ДНК, выделенной из периферической крови больных. ДНК получали из лейкоцитов периферической крови стандартным фенол-хлороформным методом [10]. Анализ гена АРС на наличие мутаций проводили согласно литературным данным [11]. Кодирующие экзоны гена АРС амплифицировали при помощи экзон-специфичных праймеров. ПЦР-продукты исследовали конформационно-чувствительным электрофорезом в полиакриламидном геле (окрашивание серебром). Изменение первичной структуры гена дополнительно исследовали секвенированием по Сэнгеру с использованием набора Big DyeTM Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing и ДНК-анализатора ABI Prism 3130x1 (Applied Biosystems; США). Хроматограммы интерпретировали при помощи ChromasPro и интернет-ресурсов NCBI BLAST и Ensembl genome browser 91. В качестве образца сравнения использовали референсную последовательность гена АРС NM_000038.6.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0 (StatSoft; USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Молекулярный анализ гена АРС проводили у 51 пациента со спорадическими ДФ. В 6 случаях (12%) выявлены герминальные мутации в гене АРС. Обнаруженные мутации в гене АРС, возраст пациентов на момент постановки диагноза, количество (единичные, мультифокальные) и локализация ДФ представлены в табл. 1
Из 6 выявленных нами мутаций 2 мутации являются новыми: c.4386-4390 delGAGAG (1462delGAGAG) и c.4575insT (1525insT). Обе указанные новые мутации приводят к сдвигу рамки считывания с преждевременным образованием стоп-кодона и, следовательно, являются патогенными.
Мутация c.4575insT обнаружена у пациентки № 1 (табл. 1).

По клиническим данным отмечали тяжелое течение ДФ с ранней манифестацией (9 лет) и мультифокальным ростом ДФ. В возрасте 19 лет при эндоскопическом обследовании толстой кишки полипоз не выявлен.

Пациент № 2 имеет мутацию c.4386-4390 delGAGAG (табл. 1). Манифестация заболевания у него была отмечена в возрасте 1 месяц. С раннего детства наблюдали мультифокальный рост ДФ грудной стенки. К возрасту 18 лет пациент перенес 5 операций, курсы химиотерапии, гормональной и лучевой терапии без стабилизации процесса. Таким образом, заболевание можно охарактеризовать крайне тяжелым течением и устойчивостью к терапии. Мутация c.4386-4390 delGAGAG (1462delGAGAG) не выявлена в других популяциях [12– 14]. Мутация возникла de novo, так как в крови матери и отца пациента не была обнаружена. Чувствительность использованного метода определения мутаций позволяет выявить 1–5% мутантных аллелей, что указывает на малую вероятность мозаицизма у одного из родителей [15].

У 3 пациентов, не являющихся родственниками, была обнаружена одна и та же мутация — c.4393-4394 delAG (1465delAG). Несмотря на идентичность нарушения на уровне ДНК, клиническая картина имела различия. Среди этих пациентов — молодая женщина (28 лет) с дебютом заболевания в 17 лет. Отмечалось мультифокальное поражение грудной и брюшной стенок и интраабдоминальный рост ДФ. Признаков полипоза толстой кишки к возрасту 28 лет по результатам колоноскопии не обнаружено. Ту же самую мутацию имели еще 2 пациента: мальчик, у которого в области грудной стенки и поясницы были обнаружены множественные десмоиды при рождении, и девочка, у которой в возрасте 2 лет на спине развилась единичная ДФ. Обращает на себя внимание, что при одной мутации возраст начала заболевания, локализация и количество ДФ у всех 3 больных были различными. Различия в локализации ДФ, возможно, обусловлены разницей в возрасте больных, и, по мере взросления, не исключена вероятность развития мультифокального поражения грудной и брюшной стенок у всех больных с этой мутацией. Не исключено также, что на течение заболевания, обусловленного одной и той же мутацией, оказывают влияние факторы окружающей среды и различие генотипов больных.
У пациента с мутацией c.4348С/T; p.R1450X был отмечен мультифокальный рост ДФ с 15-летнего возраста. После неоднократного хирургического лечения и курсов химио- и гормональной терапии была достигнута стабилизация процесса.

У всех 6 пациентов этой группы была отмечена ранняя манифестация заболевания. Основное число больных (5 из 6) имели характерный фенотип в виде множественного роста узлов опухоли, плохо поддающихся лечению. Несмотря на проводившуюся терапию у 3 пациентов группы (50%) прогноз был неблагоприятным. Из 6 пациентов с мутацией в гене АРС у 3 наблюдали тяжелое течение заболевания, что чаще, чем среди пациентов без герминальной мутации в этом гене (2 из 45). Это различие статистически значимо (р = 0,01).

Возраст возникновения ДФ среди пациентов с мутацией в гене АРС варьировал от месяца до 17 лет (табл. 1); медиана составила 5,8 года. В то же время у пациентов без мутаций этот возраст варьировал от 1 месяца до 60 лет (см. :media_ 1;); медиана — 19 лет. Различие значений медиан статистически значимо (р = 0,022; U-тест). Все мутации в гене APC были обнаружены у больных с локализацией ДФ на туловище (6 пациентов с мутацией из 26 пациентов с локализацией ДФ на туловище, что составляет 23%) и отсутствовали при других локализациях ДФ (табл. 2). Частота мутаций в гене APC при локализации опухоли на туловище значимо выше, чем при других локализациях ДФ (р = 0,023). Этот феномен не обусловлен преимущественным накоплением множественных ДФ на туловище в целом (что могло бы указывать на случайное накопление при мутациях), так как их частота на туловище не была значимо выше по отношению к другим локализациям ДФ (табл. 2; р = 0,17).

Из 51 пациента множественные ДФ имели 11 человек. У пяти из них обнаружены герминальные мутации в гене АРС, что составило 45% (табл. 2). В группе пациентов без мультифокального роста ДФ (40 человек) был обнаружен только один случай с мутацией в гене АРС (1/40, или 2,5%). Различие этих частот статистически значимо (р = 0,001). На ассоциацию мутаций с множественными ДФ указывает также значение отношения шансов (OR = 32,5; 95% CI: 3,22–326,31). Следовательно, мутации в этом гене преимущественно встречаются у пациентов с множественными ДФ.
Таким образом, мутации в гене АРС были связаны с локализацией ДФ на туловище и их преимущественно мультифокальным ростом (табл. 2).

Столь значительное количество мутаций (12%) среди спорадических случаев ДФ без признаков и (или) семейной истории САП ставит вопрос о возможном различии мутаций в гене АРС при САП и при спорадических ДФ. Все выявленные мутации в группе пациентов со спорадическими ДФ были локализованы на 3'-конце от кодона 1444 гена АРС.
В связи с этим была изучена выборка пациентов с САП и ДФ. Из 65 пациентов с САП у 12 человек полипоз толстого кишечника сопровождали ДФ. Герминальные мутации в гене АРС были обнаружены у 6 человек из 12 пациентов с САП и ДФ (табл. 3).
Различий в клинической картине фиброматоза у пациентов с САП при мутациях и без мутаций в гене АРС выявлено не было. Возраст возникновения ДФ среди пациентов с САП и мутацией в гене АРС варьировал от 28 до 57 лет (табл. 3), медиана составила 35,5 года, что не отличается значимо от среднего значения у пациентов без мутаций — 29 лет (диапазон 24–36 лет).

Ни один пациент с САП и ДФ не имел мутацию в гене АРС на 3'-конце от кодона 1444 гена АРС (табл. 3) При спорадических случаях ДФ все найденные мутации располагались ближе к 3'-концу от кодона 1444 (табл. 1). Различие в локализации мутаций при спорадических и связанных с САП ДФ статистически значимо (р = 0,0022, OR = 144; 95% CI: 2,43–8517,50), т. е. для спорадических случаев ДФ характерно более частое расположение мутаций на 3'-конце гена АРС по сравнению с ДФ при САП.
Следует отметить более ранний возраст начала заболевания при мутациях в гене АРС среди спорадических ДФ по отношению к ДФ при САП — медианы 5,8 года и 35,5 года соответственно (р = 0,004; U-тест). Статистически значимых различий в возрасте манифестации заболевания у пациентов без мутаций при спорадических и ассоциированных с САП ДФ выявлено не было (р = 0,09).
Случаи мультифокального ДФ у больных с мутацией в гене АРС чаще выявлены среди пациентов со спорадическим ДФ (5/6), нежели у пациентов с САП (0/6) — OR = 60; 95% CI: 1,64–2187,79; p = 0,015.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе изучены герминальные мутации в гене АРС у 51 пациента со спорадическим десмоидным фиброматозом. У всех пациентов выборки отсутствовали симптомы и семейный анамнез САП. У 6 человек (12%) из этой выборки впервые были найдены патогенные мутации, две из которых (1525insT и 1462delGAGAG) до настоящего времени не были описаны. Ранее мутации в гене АРС анализировали на выборках, включавших как спорадические ДФ, так и ассоциированные с САП. Мутации были выявлены только у больных с САП; среди пациентов со спорадическим ДФ мутации не были обнаружены. Это может быть связано как с задачами исследования, так и с характерными особенностями выборки. Так, в одном из исследований присутствовал только один случай множественных ДФ [16].
Ранняя манифестация десмоидного фиброматоза встречается во врачебной практике очень редко и в литературе ее обсуждают в основном как клинический случай [17, 18]. В нашей выборке пациентов со спорадическими ДФ и мутацией в гене APC зарегистрировано 3 случая с ранней манифестацией заболевания (двум пациентам диагноз поставлен в возрасте 1 и 2 месяцев, и одному ребенку — в 2 года).
Все мутации в гене АРС у больных со спорадическими ДФ были локализованы на 3'-конце от кодона 1444 и ассоциированы с тяжелым течением заболевания в виде мультифокальных ДФ и ранней манифестации (медиана возраста начала заболевания составила 5,8 года, в отличие от значения, полученного среди больных ДФ без мутаций, и составившего 19 лет). Также все ДФ у пациентов с мутацией в АРС были локализованы на туловище, хотя в целом при десмоидном фиброматозе локализация на туловище не была значимо выше, чем другие локализации (см. табл. 2; р = 0,17). Эти наши данные получены впервые. В литературе описаны семьи с наследственной десмоидной болезнью. Например, есть сообщение о семье, где в трех поколениях родственники наследуют десмоидные опухоли. Десмоидный фиброматоз у них связан с мутацией сдвига рамки считывания в кодоне 1924 гена АРС. У больных членов семьи наблюдаются множественные ДФ различной локализации как экстраабдоминальные, так и интраабдоминальные. Возраст возникновения ДФ варьирует от рождения до 10–20 лет жизни. Из 9 больных ДФ в этой семье полипоз либо рак толстой кишки был зафиксирован у троих человек. Другие немногочисленные случаи описания семей с наследственным десмоидным фиброматозом также связаны с мутациями в гене АРС на 3’-конце от кодона 1444, характеризуются возникновением множественных ДФ и тяжелым течением заболевания [19, 20].

Также было интересно сравнить выявленные характеристики мутаций и фенотипические особенности спорадических ДФ с таковыми при САП. Данные о связи генотипа с клинической картиной САП, полученные в разных работах, различаются. Так, в одной работе связи с локализацией мутации в гене АРС и развитием ДФ у больных с САП выявлено не было [21], в другой из 14 пациентов с САП и ДФ только у двоих мутация была расположена на 3'-конце от кодона 1444 [22], что может быть обусловлено популяционными особенностями. Была изучена российская выборка САП. Среди 65 больных с САП 12 имели ДФ (18%). Данное значение близко к значениям, полученным в других работах: по одним данным оно составило 3,5–32% [23], по другим — 10–15% [24]. У половины пациентов с САП и ДФ из нашей выборки были обнаружены мутации в гене АРС. Все найденные 6 мутаций были локализованы на 5'-конце от кодона 1444. Различие в частотах расположения мутаций относительно кодона 1444 при спорадических ДФ и ассоциированных с САП статистически значимо (р = 0,002). Мы сравнили частоты мутаций относительно кодона 1444 при ДФ, ассоциированных с САП, полученные в нашей работе с аналогичными частотами, полученными на объединенной выборке больных с САП из нескольких стран [25]. Указанные частоты статистически значимо не различались (р = 0,34). В то же время, полученные нами частоты расположения мутаций относительно кодона 1444 при спорадических ДФ отличались также от частот при ДФ, ассоциированных с САП, полученных другими исследователями (р = 0,0002) [25]. Следовательно, спорадические ДФ обусловлены мутациями, локализованными на 3'-конце от 1444 кодона, чаще, чем десмоидные опухоли, ассоциированные с САП.

У пациентов с САП в нашей выборке первичных ДФ обнаружено не было: все десмоидные опухоли возникли после операции и были локализованы внутрибрюшинно либо на брюшной стенке. Такие же особенности течения ДФ у пациентов с САП были отмечены и в других исследованиях [26, 27].

Cпорадические ДФ при мутациях в гене АРС были преимущественно мультифокальными и локализованы в области грудной и (или) брюшной стенки. Интраабдоминальная локализация ДФ характерна для САП и существенно реже встречается при спорадических ДФ [25]. Вероятнее всего, абдоминальная локализация ДФ при САП обусловлена травмированием тканей при проведении оперативного вмешательства на органах брюшной полости [28]. Напротив, при спорадических ДФ с мутациями в гене АРС прямой связи с травмой не наблюдалось.

Медианы возраста развития ДФ у больных с мутациями и без мутаций не отличались в нашей выборке с САП, в то время как возраст манифестации заболевания при спорадических ДФ у больных с герминальными мутациями в APC был существенно ниже. Следует отметить, что возрасты диагноза спорадических и САП-ассоциированных ДФ у пациентов без мутаций статистически значимо не различались (р = 0,09).
Эти данные указывают на существенные различия клинических картин развития спорадических ДФ и ДФ, ассоциированных с САП, среди больных с мутацией в гене АРС, связанные, по крайней мере частично, с положением мутации в этом гене.

Таким образом, в выборке больных со спорадическими ДФ выявлена группа больных с особенностями течения заболевания, обусловленными герминальной мутацией в гене АРС. Для таких пациентов характерны: мультифокальный рост ДФ, ранняя манифестация, тяжелое течение, неэффективность проводимой терапии и, как следствие, неблагоприятный прогноз заболевания. Существуют молекулярные особенности, связанные с вышеописанной клинической картиной. Мутация в этих случаях локализована на 3'-конце гена АРС.
Полученная информация существенна для выбора тактики лечения таких больных и мер профилактики полипоза, а также открывает возможности изучения механизмов, приводящих к развитию мультифокальных ДФ, но не САП.

ВЫВОДЫ

Среди больных с ДФ без семейной истории аденоматозного полипоза обнаружен подтип с герминальными мутациями в гене АРС и фенотипическими особенностями. Больные с мутациями имеют фенотип, отличающий их от больных с ДФ без мутаций, — более ранний возраст возникновения ДФ, как правило, множественных и располагающихся на туловище. По этим характеристикам больные со спорадическими ДФ с мутациями отличаются и от больных с ДФ при САП, также с герминальными мутациями в гене АРС. При этом для спорадических ДФ характерно более частое расположение мутаций на 3'-конце гена АРС. Полученные результаты следует учитывать при лечении больных с ДФ и разработке подходов к профилактике как ДФ, так и САП. Они также создают возможности для исследования молекулярных механизмов, приводящих в результате мутаций в гене АРС к первичному возникновению ДФ, а не САП.