Атеросклероз каротидного синуса (КС) обусловливает развитие до трети всех ишемических инсультов, основная причина которых — дестабилизация структуры атеросклеротической бляшки (АСБ) с развитием атеротромбоза, атеро- или тромбоэмболии церебральных артерий [1, 2]. К морфологическим маркерам нестабильной структуры АСБ относят крупные очаги атероматоза, истончение и изъязвление покрышки, кровоизлияния и выраженную воспалительную реакцию [2, 3]. В последние годы в данный перечень была включена неоваскуляризация вследствие большого количества накопленных данных, свидетельствующих о ключевой роли новообразованных сосудов в процессе дестабилизации АСБ и прогрессирования атеросклероза [1, 3–6].
Одним из наиболее широко применяемых методов оценки степени неоваскуляризации in vivo является контраст-усиленное ультразвуковое исследование (КУУЗИ). С момента первого применения КУУЗИ для оценки неоваскуляризации АСБ КС в 2003 г. [7] точность и надежность метода были подтверждены многочисленными исследованиями на животных и людях, продемонстрировавших высокую корреляцию ультразвуковых и морфологических данных [8–9].
Несмотря на 15-летнюю историю применения КУУЗИ для оценки неоваскуляризации АСБ КС, до сих пор отсутствует консенсус в отношении подходов к интерпретации результатов. В большинстве исследований применяют качественную или полуколичественную шкалу, хотя все авторы указывают на субъективность такого подхода, невозможность его использования для динамического наблюдения за течением атеросклеротического процесса и необходимость разработки более надежного и объективного метода [6, 10]. Единого мнения в отношении подходов к количественной оценке результатов КУУЗИ также достигнуто не было [9–11]. Кроме того, исследования с морфологической верификацией данных КУУЗИ немногочисленны, а полученные данные зачастую требуют подтверждения или уточнения.
В настоящее время необходимость разработки единого подхода к точной, надежной и воспроизводимой оценке результатов КУУЗИ приобретает особое значение в связи с разработкой эхоконтрастных препаратов, проходящих доклинические испытания и предназначенных уже для молекулярной визуализации сосудистого фенотипа in vivo и таргетной доставки веществ [12, 13]. Данные препараты открывают широкие возможности для реализации эффективной персонализированной стратегии профилактики, диагностики и лечения пациентов с атеросклерозом КС, однако при отсутствии стандартизированного метода оценки результатов КУУЗИ внедрение новых методов станет затруднительным.
Целью исследования было установить наиболее надежный и информативный метод оценки неоваскуляризации АСБ КС по данным КУУЗИ для использования в широкой клинической практике.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследованная популяция

Исследование проводили в ФГБНУ «Научный центр неврологии» в период с 2015 по 2018 г. Критерии включения в исследование: наличие у пациента атеросклеротического поражения КС и показаний к проведению каротидной эндартерэктомии в соответствии с Национальными российскими рекомендациями по ведению пациентов с заболеваниями брахиоцефальных артерий [14]. Критерии исключения: наличие в бляшке крупных кальцификатов по данным УЗИ (> 50% от площади бляшки), акустическая тень от которых не позволяла объективно оценивать неоваскуляризацию бляшки. В исследовании приняли участие 73 пациента (50 мужчин и 23 женщины в возрасте от 40 до 79 лет; средний возраст 63 ± 8 лет) с атеросклеротическими стенозами КС ≥ 50% (50–90%, в среднем 70 ± 16%), определяемыми по методу NASCET в соответствии с существующими ультразвуковыми критериями [15]. Всем пациентам была выполнена каротидная эндартерэктомия в ФГБНУ НЦН в период с 1 января 2015 по 31 декабря 2017 г. (у 5 пациентов с двух сторон); проведено последующее морфологическое исследование удаленных АСБ. В общей сложности проанализировано 78 АСБ КС. Оперированные стенозы имели симптомное течение в 25 случаях (32%) и асимптомное — в 53 случаях (68%).

Стандартное и контраст-усиленное УЗИ

До операции всем пациентам было выполнено стандартное дуплексное сканирование сонных артерий, а также КУУЗИ включенных в исследование АСБ в продольной плоскости сканирования. Все УЗИ проводили на приборе iU22 (Philips Healthcare NV; Нидерланды) линейным датчиком L9-3.
При дуплексном сканировании определяли эхогенность АСБ, степень стеноза сонных артерий и область наилучшей визуализации АСБ для последующего проведения КУУЗИ. Эхогенность бляшки относили к 1 из 4 категорий по классификации А. Gray-Weale [16]: 1 — гомогенные гипоэхогенные; 2 — гетерогенные с преобладанием гипоэхогенного компонента; 3 — гетерогенные с преобладанием гиперэхогенного компонента; 4 — гомогенные гиперэхогенные.
Для проведения КУУЗИ в периферическую вену пациентов внутривенно болюсно вводили 2,4 мл эхоконтрастного препарата «Соновью» (Braсco; Италия), растворенного в 5 мл 0,9%-го физиологического раствора, с последующим введением 5 мл физиологического раствора через тот же внутривенный катетер. Исследование выполняли, активируя на приборе опцию работы с контрастами (Contrast General), при низком механическом индексе (0,06) и усилении сигнала 85%. С момента введения «Соновью» на приборе осуществляли запись видеоклипа АСБ КС в течение 2 мин, при этом датчик удерживали неподвижно до момента достижения стабильного контрастирования просвета артерии, после чего начинали постепенно изменять угол наклона датчика для визуализации всей площади бляшки.
Анализ видеоклипа КУУЗИ АСБ проводили на персональном компьютере, оснащенном рабочей станцией с программным обеспечением QLAB (Philips Healthcare NV; Нидерланды). Признаком неоваскуляризации были изменявшиеся во времени динамичные гиперэхогенные сигналы (ДГЭС) в толще АСБ, получаемые от микропузырьков введенного контрастного препарата, тогда как статичные гиперэхогенные сигналы расценивали как кальцификаты. Оценку неоваскуляризации проводили с помощью четырех методов в программе QLAB.

1. Полуколичественной оценки неоваскуляризации по 4-балльной шкале (метод 1): 0 — отсутствие ДГЭС; 1 — единичные ДГЭС; 2 — умеренное количество ДГЭС; 3 — значительное количество ДГЭС.

2. Трех методов количественной оценки (см. рис.), при которых из кинопетли при КУУЗИ выбирали кадр с визуально наибольшим количеством сосудов. Кадр анализировали следующим образом:
а) определяли количество ДГЭС на единицу площади АСБ (1 см²) (метод 2), для чего на выбранном кадре вручную обводили контур АСБ и в его пределах подсчитывали количество отдельно расположенных ДГЭС. Искомую величину получали путем деления количества сигналов на автоматически определенную площадь обведенной АСБ;
б) определяли соотношение площади ДГЭС и площади бляшки (%) (метод 3), для чего на выбранном кадре вручную обводили контур АСБ и контур всех ДГЭС. Искомую величину получали путем деления суммы площадей обведенных сигналов на площадь обведенной АСБ и умножения полученного значения на 100%;
в) определяли ROI (интенсивность УЗ-сигнала) бляшки (метод 4), для чего на выбранном кадре вручную обводили область интереса — всю бляшку, по возможности исключая статичные гиперэхогенные сигналы (кальцификаты), и программа автоматически рассчитывала значение ROI в дБ.

Морфологическое исследование

Всего при операции было фрагментировано и исключено из анализа 13 АСБ. Удаленные при каротидной эндартерэктомии 65 АСБ фиксировали в 10%-м растворе формалина на фосфатном буфере (рН 7,4) и исследовали на всем протяжении. Бляшки в зависимости от длины разрезали на 4–9 блоков толщиной 0,3 см в плоскости, перпендикулярной оси сосуда; блоки заливали в парафин. Срезы с каждого блока толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и по методу ван Гизона, после чего сканировали с помощью аппарата Aperio AT2 (Leica Biosystems; Германия) при 400-кратном увеличении изображения.
Неоваскуляризацию бляшек анализировали в программе Aperio ImageScope (Leica Biosystems; Германия) версии 11.2.0.780. Сосуды определяли как выстланные эндотелием структуры, имеющие просвет. Оценивали общую плотность расположения сосудов на 1 см² бляшки (результат деления общего количества сосудов во всех срезах на сумму площадей этих срезов). С учетом ограничения разрешающей способности КУУЗИ анализировали плотность расположения сосудов определенного диаметра (< 20, ≥ 20, ≥ 30, ≥ 40, ≥ 50 мкм). При косом или продольном сечении сосуда его диаметр определяли как поперечный размер в наиболее широком участке.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили в пакете Statistica 10.0 (StatSoft; США). Для выявления статистических различий и корреляционных связей применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни и коэффициент корреляции Спирмена. Во всех случаях порог статистической значимости (р) составлял 0,05. Данные представлены в следующем виде: медиана (Ме) (квартиль 1 (Q1); квартиль 3 (Q3)).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам стандартного дуплексного сканирования, подавляющее большинство АСБ имели гетерогенную структуру (81%) с преобладанием гипоэхогенного компонента (51%) (табл. 1). В 67% бляшек встречались небольшие или среднего размера кальцификаты. Сосуды при КУУЗИ были обнаружены во всех бляшках, при этом ни один из применяемых методов оценки степени неоваскуляризации АСБ не выявил значимых различий между разными типами АСБ по классификации А. Gray-Weale [16] (см. табл. 1).
Согласно данным полуколичественной оценки результатов КУУЗИ (метод 1), преобладали АСБ с умеренным и небольшим количеством ДГЭС (2 балла и 1 балл по шкале оценки соответственно), составив 51% и 37% всех АСБ. АСБ со значительным количеством ДГЭС (3 балла по шкале оценки) выявляли более чем в 3 раза реже (12% всех АСБ). При сопоставлении данных ультразвукового и морфологического исследований отмечена тенденция к повышению количества сосудов на 1 см² бляшки с увеличением балла по шкале оценки результатов КУУЗИ. Тем не менее значимое отличие в степени неоваскуляризации АСБ по данным морфологического исследования отмечено лишь для группы АСБ с единичными ДГЭС (табл. 2).

Результаты трех методов количественного анализа данных КУУЗИ продемонстрировали значительную вариабельность степени неоваскуляризации АСБ: количество ДГЭС на 1 см² бляшки (метод 2) составило 16 сигналов/см² (10; 26); соотношение площадей ДГЭС и бляшки (метод 3) — 6% (3; 9); значение ROI АСБ (метод 4) — 2,6 дБ (1,8; 4,1). Корреляционный анализ продемонстрировал наличие прямой зависимости между результатами оценки по методам 2 и 3 (R = 0,45; р = 0,000034), а также по методам 3 и 1 (R = 0,38; р = 0,0006). Значение ROI с результатами других методов оценки не коррелировало.

Выявлена значимая корреляционная зависимость между морфологическими данными и результатами трех методов оценки степени неоваскуляризации АСБ с помощью КУУЗИ (методы 1–3), особенно метода 2 (определение количества ДГЭС на 1 см² АСБ) (табл. 3). Последний метод также позволил провести прямое сопоставление результатов ультразвукового и морфологического исследований, в результате чего был установлен средний диаметр сосудов, которые могут быть выявлены при КУУЗИ — 30 мкм (22; 37).
Кроме того, для оценки влияния гиперэхогенного компонента на результат КУУЗИ был проведен дополнительный корреляционный анализ данных ультразвукового и морфологического исследований в группах трех разных типов бляшек по классификации Gray-Weale (табл. 4). Обнаружено, что с увеличением объема гиперэхогенного компонента значимость корреляционной зависимости между данными КУУЗИ и морфологии, а также надежность УЗ-оценки неоваскуляризации резко снижаются. Так, количество ДГЭС на 1 см² бляшки по данным КУУЗИ (метод 2), наиболее высоко коррелировавшее с результатами морфологического исследования в общей группе бляшек, продемонстрировало еще более высокий результат в группе бляшек с преобладанием гипоэхогенного компонента, тогда как в двух других группах АСБ результат корреляционного анализа оказался сомнительным (см. табл. 4). Соотношение площадей ДГЭС и бляшки (метод 3) коррелировало с морфологическими данными только в группе АСБ с преобладанием гипоэхогенного компонента (см. табл. 4). Что касается полуколичественного метода оценки неоваскуляризации, то результаты анализа в разных группах бляшек оказались противоречивыми (см. табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Большое внимание в литературе при оценке результатов КУУЗИ уделено именно визуальным шкалам, поскольку несмотря на определенную долю субъективиности они достаточно просты и занимают мало времени в исполнении, что позволяет их использовать в широкой рутинной практике без наличия специальных программ для количественного обсчета. Описано более 10 подходов к полуколичественной оценке неоваскуляризации АСБ КС с использованием визуальных шкал от 2 до 5 баллов. При этом в большинстве шкал помимо количества ДГЭС учитывают их расположение [8, 17–22], гораздо реже оценивают только количество ДГЭС [17, 23, 24]. Все шкалы, учитывающие расположение ДГЭС, подразумевают прямую зависимость увеличения количества ДГЭС и их распространения в направлении от адвентиции к поверхности бляшки. При выборе шкалы оценки у нас возник ряд сложностей с применением шкал данного типа, поскольку все выявленные нами паттерны неоваскуляризации АСБ не укладывались ни в одну из данных шкал. В этой связи мы остановились на более простых монопараметрических шкалах, взяв за основу стандартную 4-балльную шкалу оценки количества ДГЭС, сходную с уже предложенной в литературе [24]. Ее автор, правда, предлагал относить к бляшкам с «выраженной» степенью васкуляризации (3-я степень) только бляшки, в которых выявлены крупные сосуды по типу артерий без уточнения их характеристик. Однако полученные нами результаты как КУУЗИ, так и морфологического исследования продемонстрировали наличие слабо васкуляризированных АСБ с крупными сосудами по типу артерий, а также обильно васкуляризованных АСБ без крупных сосудов по типу артерий, на основании чего было принято решение не учитывать калибр сосудов при полуколичественной оценке.

Сопоставление значений плотности расположения сосудов в АСБ, определенной при морфологическом исследовании, между тремя группами бляшек различной степени неоваскуляризации по данным выбранной нами 4-балльной визуальной шкалы продемонстрировало значимое отличие лишь группы слабо васкуляризированных бляшек с единичными ДГЭС от групп с умеренным и значительным количеством ДГЭС. В то же время результаты КУУЗИ с использованием данной шкалы, как и в случае с визуальными шкалами, предлагаемыми другими авторами [8, 20, 23, 24], показали значимую корреляцию с морфологическими данными. При анализе различных по эхогенности бляшек мы не смогли четко подтвердить надежность предлагаемого полуколичественного метода оценки в связи с противоречивыми результатами корреляционного анализа в группах бляшек разных типов по классификации А. Gray-Weale [16]. Причин расхождения результатов могло быть несколько: небольшой размер анализируемых групп, субъективный подход к градации степени неоваскуляризации без четких критериев оценки, а также часто выявляемые в АСБ кальцификаты, которые могли обусловить как недооценку, так и переоценку степени неоваскуляризации [25]. В 67% АСБ при дуплексном сканировании выявляли небольшие или среднего размера кальцификаты, которые могли быть ошибочно приняты за сосуды при КУУЗИ. Сложность дифференцировки сосудов и небольших кальцификатов также связана с впервые выявленным нами сходным паттерном их визуализации при КУУЗИ — большинство кальцификатов небольшого и среднего размеров становилось видимым только по мере заполнения сосудистого русла бляшки контрастом, что может быть связано с отмеченным в литературе изменением отражающей способности ткани в этих участках [26]. Кроме того, морфологическое исследование выявило частое расположение сосудов в непосредственной близости от кальцификатов, что также могло осложнить их выявление при КУУЗИ вследствие ограниченной разрешающей способности прибора.

Что касается количественного анализа результатов КУУЗИ, то в литературе описано три принципиально различающихся подхода, которые были применены в данной работе: наиболее распространенная оценка интенсивности сигнала в области интереса (контрастированной бляшке), определение соотношения площадей ДГЭС и бляшки, а также подсчет количества ДГЭС на 1 см² АСБ. Мы не выявили взаимосвязи между значением ROI бляшки и плотностью расположения сосудов по данным морфологии, а также результатами других методов оценки неоваскуляризации при КУУЗИ. В ряде исследований, в которых проводили морфологическую верификацию результатов КУУЗИ, основанных на оценке ROI, авторы демонстрировали успешность такого подхода [20, 27, 28], хотя объем выборки в них, как правило, был небольшой или была применена менее точная полуколичественная оценка неоваскуляризации при морфологическом исследовании. Другие авторы выявили корреляцию между интенсивностью сигнала при КУУЗИ и результатами морфологического исследования только для стабильных бляшек [8]. На интенсивность УЗ-сигнала оказывают влияние разные факторы, например индивидуальные показатели эхоотражающих свойств ткани; степень обызвествления бляшки (особенно мелкие и пылевидные кальцификаты, которые невозможно исключить из области анализа); преимущественная локализация бляшки по передней или задней стенке артерий; небольшие изменения параметров яркости и контрастности изображения при оценке, которые сложно стандартизировать, и др. [2, 25, 26]. Все вышеуказанные факторы могли стать причиной полученного нами результата. Кроме того, во всех приведенных в литературе исследованиях авторы использовали не абсолютное, а скорректированное значение интенсивности УЗ-сигнала: соотношение значений ROI бляшки и просвета сосуда [8, 17] или прилегающей неизмененной стенки [27]; разницу значений ROI бляшки до и после введения контраста [18, 20]; многокомпонентный алгоритм, учитывающий несколько факторов [12, 22], и др. [28]. Мы специально использовали абсолютное значение ROI, которое можно оценить на самом приборе без дополнительных математических вычислений, что было бы сопоставимо по скорости и удобству с визуальной шкалой, при этом предоставляло возможность динамического наблюдения за течением атеросклеротического процесса. Тем не менее полученные результаты свидетельствуют о том, что использование значения ROI при оценке степени неоваскуляризации требует учета большого количества факторов и введения поправочных коэффициентов.

Результаты второго использованного нами количественного метода оценки, определения соотношения площадей ДГЭС и бляшки, не отражали общего количества сосудов в бляшке или плотности расположения в ней мелких сосудов диаметром до 20 мкм, составляющих до 96% всех сосудов бляшки по литературным данным [29]. Тем не менее как в общей группе бляшек, так и в группе бляшек с преобладанием гипоэхогенного компонента, результаты КУУЗИ коррелировали с плотностью расположения сосудов более крупного калибра (≥ 20 мкм и ≥ 40 мкм соответственно) по данным морфологии. Анализ различных по эхогенности типов бляшек также продемонстрировал, что применение данного метода нельзя рекомендовать при оценке бляшек с выраженным гиперэхогенным компонентом, поскольку корреляционная зависимость между ультразвуковыми и морфологическими данными в группах бляшек 3-го и 4-го типов по классификации Gray-Weale отсутствовала. Последнее можно объяснить недооценкой или переоценкой степени неоваскуляризации при КУУЗИ при наличии в бляшке кальцификатов, что было описано выше. Авторы, разработавшие и применившие данный метод, отметили высокую корреляцию результатов КУУЗИ с общей плотностью расположения сосудов в бляшке по данным морфологии [10]. Отсутствие такой корреляционной зависимости в нашем исследовании можно объяснить различными подходами к расчету показателя: мы использовали коммерчески доступное программное обеспечение QLAB и обводили ДГЭС вручную, тогда как А. Hoogi с коллегами использовали специально разработанный автоматизированный алгоритм на базе Matlab (Mathworks). Кроме того, точность ручного способа выделения ДГЭС может значительно снижаться с уменьшением размера сигналов (сосудов). Тем не менее с учетом литературных данных о наличии высокой корреляции между плотностью расположения сосудов различного диаметра в АСБ [29], а также полученных нами данных о возможности надежного выявления при КУУЗИ сосудов диаметром более 30 мкм, использованный нами подход можно применять для количественной оценки неоваскуляризации в АСБ КС при отсутствии выраженного гиперэхогенного компонента, однако для повышения точности результата рекомендуется использовать автоматизированный алгоритм расчета показателя.

Подсчет количества ДГЭС на 1 см² АСБ продемонстрировал высокую корреляцию с морфологическими данными как в общей группе бляшек, так и в группе бляшек с преобладанием гипоэхогенного компонента. В группе АСБ с выраженным гиперэхогенным компонентом результаты, как и в случае с другими методами количественной оценки, были не столь убедительными, что свидетельствует о необходимости разработки комплексного автоматизированного алгоритма анализа бляшек 3-го и 4-го типов при КУУЗИ для надежной оценки неоваскуляризации. В литературе отсутствуют данные по сопоставлению результатов морфологического исследования и КУУЗИ с использованием данного подхода. В одном из исследований был применен сходный метод оценки неоваскуляризации при КУУЗИ [12], однако авторы не проводили морфологическую верификацию результатов и использовали при анализе разработанный на базе MevisLab автоматизированный алгоритм. Они провели сопоставление методов полуколичественной и количественной оценки неоваскуляризации на основе определения значения ROI, площади и количества ДГЭС в бляшке, продемонстрировав наличие корреляционной взаимосвязи между величиной соотношения площадей ДГЭС и бляшки, количеством ДГЭС на 1 см² бляшки и результатами визуальной оценки, при этом взаимосвязь усиливалась при исключении из анализа гиперэхогенных АСБ.

ВЫВОДЫ

Метод КУУЗИ является информативным способом визуализации сосудистой сети АСБ КС, позволяющим быстро и надежно оценить степень неоваскуляризации бляшек без выраженного гиперэхогенного компонента с использованием широко распространенного программного обеспечения QLAB. Наиболее надежный и удобный способ количественной оценки неоваскуляризации АСБ — подсчет количества ДГЭС на 1 см² бляшки на 1 кадре с визуально наибольшим количеством сигналов, его результаты высоко коррелировали с данными морфологического исследования всей бляшки. Расчет соотношения площадей ДГЭС и бляшки также может быть использован, однако это более трудоемкий и менее надежный способ. Абсолютное значение ROI бляшки для данной цели использовать не рекомендуется. Полуколичественный метод оценки с помощью 2- или 3-балльной визуальной шкалы рекомендуется применять только как качественный экспресс-метод оценки наличия сосудистого компонента в АСБ. Гиперэхогенный компонент в АСБ оказывает значительное влияние на результат КУУЗИ, на основании чего для достоверной оценки неоваскуляризации АСБ необходима разработка алгоритма, позволяющего автоматически выявлять и исключать из анализа не только крупные, но особенно мелкие и среднего размера кальцификаты.