Болезнь Паркинсона (БП) относится к числу наиболее распространенных неврологических расстройств, особенно у лиц старше 60 лет. Общее число пациентов с БП в мире составляет не менее 4 млн и, согласно прогнозам, может удвоиться к 2040 г. по мере увеличения доли пожилых людей в обществе [1]. Патогенетическое лечение БП не разработано, поэтому особое значение имеет изучение молекулярных механизмов заболевания, в том числе на модельных животных.
Характерные моторные симптомы БП (брадикинезия, мышечная ригидность, тремор покоя) обусловлены поражением дофамин-продуцирующих нейронов черной субстанции среднего мозга, дегенерацией нигростриатного дофаминергического пути и развивающимся нейротрансмиттерным дисбалансом в центральной нервной системе (ЦНС) [2]. У больных БП наблюдается также целый ряд немоторных клинических проявлений, самый частый из которых, дисфункция желудочно-кишечного тракта (констипация и др.), развивается задолго до манифестации первых моторных симптомов заболевания [3]. Нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта при БП связывают с вовлечением в патологический процесс периферических отделов вегетативной нервной системы, однако до настоящего времени соответствующие пусковые механизмы и закономерности взаимодействия «периферического» и «центрального» звеньев патогенеза БП остаются не вполне ясными.

Основным молекулярным событием, приводящим к повреждению нейронов ЦНС при БП, считают нарушение конформации небольшого синаптического белка α-синуклеина [4]. Именно агрегаты фосфорилированного α-синуклеина в цитоплазме нейронов являются основным биохимическим субстратом телец Леви — классических патоморфологических маркеров БП [2]. Интересно, что патологическую агрегацию α-синуклеина обнаруживают не только в церебральных нейронах, но и в биопсийном и аутопсийном материалах интрамуральных вегетативных сплетений кишечника больных БП, в связи с чем выдвинуто предположение об энтеральных сплетениях как о первичном сайте патологического процесса, распространяющегося далее на структуры ЦНС через волокна блуждающего нерва [5]. Существуют данные о том, что триггерную роль в α-синуклеиновом каскаде могут играть некоторые нейротоксины окружающей среды, такие как тяжелые металлы, пестициды и фунгициды [6, 7]. Так, образование агрегатов α-синуклеина и Леви- патологии способен инициировать сильный гербицид неспецифического действия паракват (1,1-диметил-4,4- бипиридин), который широко используют для уничтожения сорняков во фруктовых садах, на пахотных землях сельскохозяйственного использования, плантациях кофе, какао, чая и т. д., а также в качестве высушивающего агента при переработке сельскохозяйственной продукции [6, 8, 9]. Его особенностью является структурное сходство с активным метаболитом известного нейротоксина, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), — токсичным катионом 1-метил-4-фенилпиридиния (МФП+), что позволяет использовать паракват для моделирования БП на животных. Токсичный эффект параквата связан с образованием супероксидных радикалов, но при этом он обладает низкой аффинностью к комплексу I дыхательной цепи митохондрий.

При моделировании БП обычно используют длительное системное введение параквата в дозе 10 мг/кг, что приводит к выраженным нарушениям движения экспериментальных животных и вызывает значительные дегенеративные изменения дофаминергических нейронов черной субстанции [10]. Однако такой подход не пригоден для изучения начальных стадий патологического процесса и оценки премоторных симптомов заболевания. Целью работы было выявить у крыс комплекс наиболее ранних патологических изменений, вовлекающих α-синуклеин, при введении малой дозы параквата и сопоставить их с симптомами, развивающимися у таких животных на ранней стадии экспериментального паркинсонизма.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работу проводили на крысах-самцах линии Wistar (n = 18) в возрасте 3–3,5 месяца, которых содержали в виварии при свободном доступе к пище и воде и 12-часовом цикле свет/тьма.
Экспериментальные животные были разделены на две группы: группа «паракват» (n = 10) и группа «контроль» (n = 8). Крысам первой группы вводили паракват в дозе 6 мг/кг, объемом 0,5 мл. Контрольным животным вводили только физиологический раствор в том же объеме. Токсин растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно через день в течение 4 недель. На следующий день после последней инъекции проводили тесты «открытое поле» (ОП) и «сужающаяся дорожка» (СД), которые позволяют оценить нарушения локомоции экспериментальных животных. Исходный уровень двигательной активности был определен у интактных крыс, т. е. до начала введения препаратов. Установка ОП (изготовлена в мастерских ФГБНУ НЦН) представляла собой квадратный короб, со стороной 75 см и высотой 40 см; площадь пола установки разделена на 25 квадратов. При проведении теста оценивали величину пройденного крысой пути за 3 мин. Установка СД (Open science; Россия) представляла собой 2 планки, наложенные друг на друга, длиной 165 см: ширина нижней планки — от 10 до 5,5 см, ширина верхней планки — от 6 до 1,5 см, высота — 2 см. На узком конце дорожки располагается короб (укрытие), имеющий съемную крышку и отверстие в передней панели, через которое животное может проникнуть внутрь. Вся конструкция приподнята над полом на высоту 70 см. Экспериментальное животное должно пройти по верхней планке от начала дорожки до укрытия. Подсчитывали число оступаний (соскальзываний) с верхней планки на нижнюю при проходе по всей длине установки и общее количество шагов каждой конечностью. Регистрацию поведения экспериментальных животных проводили с помощью системы видеонаблюдения Any-maze (Stoelting Inc., США).

Для морфологического исследования было взято по четыре образца мозга животных из групп «контроль» и «паракват». Мозг извлекали и фиксировали 4%-м раствором формалина. Образцы пропитывали средой O.C.T. (TissueTek; США) и готовили серийные фронтальные срезы толщиной 10 мкм на криостате Tissue-Tek Cryo3 Flex (Sakura Finetek; США). Срезы окрашивали иммунофлуоресцентным методом для выявления тирозингидроксилазы (ТирГд) — маркерного белка дофаминергических волокон и кислого глиофибриллярного белка (GFAP) для оценки нейродегенеративных изменений в нигростриатной дофаминергической системе. Ядра клеток докрашивали DAPI. Для выявления ТирГд использовали поликлональные кроличьи антитела (1 : 500, Sigma; Германия) и соответствующие вторичные антитела козы против иммуноглобулинов кролика, меченые флуорохромом CF488 (1 : 500, Sigma; Германия). Для выявления GFAP использовали антитела, меченые флуорохромом Cy3 (Sigma; 1 : 80). С каждого мозга на уровне хвостатого ядра и черной субстанции исследовали 5–10 срезов, взятых на разных уровнях по рострокаудальной оси. Срезы изучали под флуоресцентным микроскопом Eclipse NiU (Nikon; Япония). Количественную оценку плотности ТирГд-позитивных волокон проводили, выделяя исследуемые области вручную, при увеличении объектива ×40 в программе ImageJ (Wayne Rasband (NIH); США) и оценивали среднюю интенсивность флуоресценции (с коррекцией на фоновое окрашивание) ткани в стриатуме.

Участки тощей кишки длиной 5–7 см извлекали, разрезали продольно вдоль брыжейки, промывали физиологическим раствором и расправляли на дне чашки Петри, покрытом парафином. Фиксировали в 4%-м растворе формалина на фосфатном буфере в течение 3 ч, затем промывали фосфатным буфером (рН = 7,4) и под бинокулярной лупой Wild M7A (Wild Heerbrugg; Германия) при помощи глазного пинцета удаляли слизистую оболочку и подслизистую основу. Полученные тотальные препараты тонкого кишечника, состоящие из кольцевого и продольного мышечных слоев и располагающегося между ними межмышечного нервного сплетения, использовали для проведения иммунофлуоресцентных реакций. Для выявления нервных волокон в энтеральных сплетениях использовали первичные антитела к β-III-тубулину, ТирГд и α-синуклеину, фосфорилированному по серину-129 (α-Syn-p129), в разведении 1 : 250. Для визуализации связывания использовали вторичные антитела (Sigma; Германия), меченые флуорохромом CF448, в разведении 1 : 100. Препараты исследовали и фотографировали под микроскопом Nikon Eclipse NiU (Nikon; Япония) с цифровой камерой Nikon DS-Qi (Nikon; Япония). Морфометрию выполняли с помощью программы NIS Elements (Nikon; Япония) на фотоизображениях, полученных при увеличении объектива ×10, исследуя не менее 30–40 полей зрения на животное. В программе NIS Elements оценивали среднюю интенсивность и яркость флуоресценции (с коррекцией на фоновое окрашивание) β-III-тубулин- и ТирГд-позитивных нервных волокон в межмышечном нервном сплетении.
Анализ полученных данных проводили в программе Statistica 12 (StatSoft; США), используя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующими апостериорными сравнениями по критерию Фишера и тест Манна–Уитни, различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего за время эксперимента животным было сделано 12 инъекций параквата. Исходная величина пройденного в ОП пути у интактных крыс составила 4,96 ± 0,7 м. Тестирование поведения на следующий день после последней инъекции показало снижение двигательной активности в ОП у крыс, получавших паракват, однако статистически значимых различий с контролем получено не было (рис. 1).
Тест «СД» выявил нарушения координации у крыс под действием параквата, что выразилось в статистически значимом увеличении числа оступаний левыми конечностями на нижнюю планку дорожки (рис. 2). Число оступаний подсчитывалось в процентах от общего числа шагов соответствующими конечностями.
При исследовании черной субстанции у животных, получавших паракват, выявляли снижение окрашивания на ТирГд и повреждение дофаминергических нейронов, однако наиболее выраженные изменения отмечали в стриатуме. По сравнению с контрольной группой, интенсивность окрашивания стриатума животных на ТирГд статистически значимо снижалась (рис. 3). При этом диффузное снижение плотности выявляемых дофаминергических волокон отмечали преимущественно в дорсальных отделах стриатума. Кроме того, выявляли умеренный глиоз — гипертрофию отростков GFAP- позитивных астроцитов.
В миентеральном сплетении тонкого кишечника крыс при введении параквата было выявлено снижение интенсивности иммунофлуоресцентного окрашивания на β-III-тубулин и ТирГд (рис. 4). Содержание фосфорилированного α-синуклеина (α-Syn-p129) увеличивалось в телах миентеральных нейронов и в ТирГд-позитивных волокнах (рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Паракват — весьма перспективный токсин для моделирования БП за счет ряда особенностей этого соединения, позволяющих использовать индуцированные им модели при проверке различных гипотез патогенеза БП и тестирования новых препаратов [11]. Согласно литературным данным, введение параквата вызывает в нейронах окислительный стресс, продукцию свободных радикалов in vitro и in vivo, а также повышение уровней α-синуклеина и тау-белка с их аккумуляцией [8, 12, 13]. Несмотря на структурное сходство параквата и МФП+ [14], проникновение в мозг и механизм действия этих нейротоксинов разные. Оба они представляют собой заряженные молекулы, но паракват, в отличие от МФП+, проникает в мозг с помощью транспортера нейтральных аминокислот [15, 16]. Данные об эффекте параквата на дофаминергические нейроны довольно противоречивы. В одних работах были показаны нарушения двигательной функции и гибель дофаминергических нейронов после системного введения параквата мышам и крысам [14, 10, 17], другие исследователи при использовании параквата не обнаружили изменений моторики животных, несмотря на дегенерацию нигростриатного пути [18, 14]. При этом, индуцируя агрегацию α-синуклеина и другие нарушения в дофаминергических нейронах черной субстанции, паракват не оказывает выраженного эффекта на уровень дофамина в стриатуме. Возможно, сохранность уровня дофамина в этой модели обусловлена компенсаторным повышением активности ТирГд в стриатуме [19].

Для моделирования БП у крыс чаще всего используют введение параквата, растворенного в физиологическом растворе, в дозе 10 мг/кг. Показано, что такой режим введения параквата внутрибрюшинно в течение 3 недель вызывает селективную гибель дофаминергических нейронов в черной субстанции, снижение двигательной координации, тонуса и сократительной способности мышц [10]. Более высокие дозы параквата (20–25 мг/кг) используют для моделирования тяжелых повреждений внутренних органов, в частности, почек и легочной ткани [20]. Однако наш предшествующий опыт применения параквата в дозе 10 мг/кг для моделирования БП на крысах вышеуказанной линии и возраста оказался негативным, к 5-й инъекции все животные (n = 10) погибли, а при патологоанатомическом исследовании погибших животных были обнаружены характерные для действия параквата изменения в легочной и почечной тканях и тканях других висцеральных органов [20]. Использование в настоящей работе дозы параквата 6 мг/кг позволило избежать гибели животных и в то же время воспроизвести поведенческие и морфохимические нарушения, имитирующие симптомы начальной стадии БП, включая типичную асимметрию двигательных нарушений. Латерализацию двигательных симптомов при БП (гипокинезии, тремора покоя и др.) отмечают уже в дебюте заболевания, и она может становиться менее выраженной по мере его прогрессирования [21]. Моторная асимметрия имеет большую клиническую значимость для дифференциальной диагностики БП и других сходных паркинсонических синдромов. Вместе с тем, асимметрия повреждения нейронов черной субстанции у людей с БП продемонстрирована лишь в немногих работах [22, 21], а моделей, воспроизводящих односторонние двигательные нарушения при системном введении нейротоксинов, практически не описано. Проведенное нами исследование восполняет этот пробел.

В миентеральном сплетении интенсивность окрашивания β-III-тубулин-позитивных нервных волокон под действием параквата снижалась относительно контроля. Хотя нарушение сборки микротрубочек под влиянием параквата [23] было описано ранее, полученные нами данные о снижении окрашивания на β-III-тубулин вступают в противоречие с результатами некоторых других исследователей [6]. По-видимому, выявленные изменения могут отражать не столько снижение абсолютного числа тубулин-позитивных нервных волокон, сколько изменение морфологии сети энтеральной нервной системы, т. е. ее разрежение. В исследованном материале мы не выявили тел нейронов, содержащих ТирГд; полученные результаты свидетельствуют о том, что ТирГд-позитивные волокна в межмышечном сплетении являются симпатическими афферентами, и это согласуется с данными других авторов [24, 25]. Интенсивность окрашивания на ТирГд под действием параквата также снижалась относительно контроля, что может свидетельствовать о повреждении симпатической иннервации тонкого кишечника. Кроме этого, такое снижение могло быть вызвано не только изменением плотности волокон, но и изменением функционального состояния нейронов.
α-Синуклеин в структурах периферической вегетативной нервной системы был выявлен нами как у экспериментальных, так и у контрольных животных. Известно, что часть α-синуклеина в нормальных условиях находится в нейронах в фосфорилированной форме [26]. Этот белок локализовался диффузно в соме части нейронов миентеральных ганглиев. В то же время у животных, получавших паракват, было обнаружено усиление окрашивания тел нейронов и утолщение ТирГд-позитивных нервных волокон, иммунопозитивных к фосфорилированной форме α-синуклеина (α-Syn-p129). Изменения морфологии нервных волокон и накопление α-Syn-p129 может свидетельствовать об образовании специфичных для БП белковых агрегатов под действием параквата. Увеличение экспрессии α-синуклеина в нейронах черной субстанции под действием параквата, показанное ранее [6], вместе с результатами нашей работы подчеркивает сходство молекулярного патогенеза данной модели паркинсонизма с механизмами развития БП у человека.

Вероятными причинами накопления α-синуклеина в энтеральной нервной системе при воздействии параквата являются продукция АФК и воспаление [27]. Показано, что воспалительные заболевания кишечника у приматов вызывают накопление фосфорилированного α-синуклеина в нейронах миентеральных ганглиев [28]. Нарушение баланса между фосфорилированным и нефосфорилированным пулами α-синуклеина сопровождают образование токсических фибрилл белка и формирование его нерастворимых агрегатов [29]. Патологическое накопление α-синуклеина в волокнах, иннервирующих желудочно- кишечный тракт, и энтеральных ганглиях, характерное для ранних стадий БП, рассматривают как потенциальный биомаркер заболевания [30].

ВЫВОДЫ

Системное введение параквата в дозе 6 мг/кг вызывало поведенческие и морфохимические изменения, сходные с таковыми у пациентов на ранней стадии БП, включая ключевое звено патогенеза — α-синуклеиновую патологию в структурах периферической вегетативной нервной системы. Такой режим введения параквата представляется чрезвычайно перспективным в моделировании БП и имеет большое значение для лучшего понимания патогенеза заболевания и разработки новых терапевтических стратегий.