Понятие аутоиммунная патология подразумевает под собой группу заболеваний. В их основе лежит дисбаланс в работе иммунной системы и механизмах поддержания аутотолерантности, приводящий к развитию комплекса иммунных реакций против собственных тканей организма.
В настоящее время терапией выбора при аутоиммунных заболеваниях является главным образом использование иммунодепрессантов, синтетических базисных противовоспалительных препаратов (DMARD), а также генно-инженерных препаратов. Однако применение таких средств сопряжено с риском серьезных побочных эффектов. Регуляторные Т-клетки (Т_reg) препятствуют развитию иммунных реакций к аутоантигенам, контролируют развитие патологического воспаления и, как следствие, аутоиммунных заболеваний, непосредственно участвуя в индукции и поддержании периферической толерантности. Т_reg-клетки составляют 3–5% от общего числа CD4⁺-Т-лимфоцитов в периферическом русле и могут подавлять активацию, пролиферацию и эффекторные функции CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов, NK-клеток, В-клеток, антигенпрезентирующих клеток (АПК) [1]. У пациентов с аутоиммунными патологиями можно наблюдать изменение количества Т_reg-клеток, при этом нередко их функция ослаблена или нарушена [2, 3]. Экспериментальные исследования, проведенные на мышиных моделях аутоиммунных заболеваний, показали, что адоптивная терапия Т_reg-клетками, полученными от здоровых особей, обладает хорошим терапевтическим эффектом [4]. Благодаря позитивным результатам доклинических исследований, Т_reg-лимфоциты стали рассматривать в качестве перспективного подхода к лечению аутоиммунных заболеваний.
С учетом текущего состояния исследований и ограничения современных методов лечения необходима разработка новых высокоспецифичных подходов для эффективной и безопасной терапии аутоиммунных патологий. Мы предполагаем, что клинические решения на основе T_reg-клеток могут занять центральное место в комплексной терапии аутоиммунных заболеваний при условии решения ряда технических задач.
В работе отражено мнение о перспективах применения Т_reg-клеток в качестве инструмента для терапии аутоиммунных заболеваний на основании имеющихся результатов научных и клинических исследований, дана оценка возможных трудностей, возникающих при использовании данного подхода, и предложены потенциальные пути решения научно-технических проблем в данной области.

Регуляторные Т-клетки и механизмы супрессорного действия

Ключевыми маркерами Т_reg-клеток служат мембранный антиген CD25 и внутриклеточный транскрипционный фактор FOXP3. Экспрессия гена FOXP3 необходима для реализации супрессорной функции Т_reg-лимфоцитов [5]. Маркер CD25 представляет собой α-цепь IL2, его экспрессия коррелирует с пролиферацией и дифференцировкой Т_reg [6].
Дифференцировка Т_reg-клеток происходит в тимусе и на периферии. Из тимуса Т_reg расселяются в кровь и периферические органы лимфоидной системы в течение первых 2–3 дней жизни [7]. На периферии Т-клетки с фенотипом CD4+FOXP3– также могут подвергаться дифференцировке с образованием индуцированных Т_reg-клеток, отличающихся высокой экспрессией FOXP3 (CD4+CD25+FOXP3+).
Супрессорное действие Т_reg на иммуноциты может быть реализовано напрямую при межклеточном контакте или опосредованно, в результате секреции биологически активных молекул. Можно выделить четыре основных механизма: прямой цитотоксический эффект (при участии PD-1/PD-L1, OX40/OX40L и гранзимов B), изменение метаболизма клеток-мишеней (CD25, CD39, триптофан), секреция ингибирующих цитокинов (IL10, TGFβ и IL35), а также супрессия АПК (CD80 и CD86/CTLA-4) [8].

Клинические испытания иммунотерапии на основе Т_reg-клеток

Клинические испытания иммунотерапии на основе Т_reg-клеток при аутоиммунных заболеваниях начались менее 10 лет назад. Целью испытаний стала проверка технических аспектов при инфузии Т_reg, а также оценка безопасности и эффективности метода. В клинических испытаниях применяют общий подход: сортировка Т_reg-клеток, поликлональная экспансия Т_reg, подбор дозы и проведение инъекций Т_reg-лимфоцитов пациентам. Однако данный подход не учитывает функциональный статус клеток. Общей проблемой при использовании Т_reg остается отсутствие стабильной экспрессии FOXP3 и стойкой супрессорной активности, что во многих случаях обусловливает невысокую эффективность применения данной технологии для клеточной терапии.
Согласно открытому многоцентровому исследованию CATS1, опубликованному в 2012 г. [9], на этапе I/IIa, включающем 20 пациентов из четырех групп с активной и симптоматической рефрактерной болезнью Крона, была показана безопасность инфузии клеток. В феврале 2018 г. было начато двойное слепое плацебо-контролируемое исследование NCT03185000 (TRIBUTE), оценивающее инфузию T_reg с фенотипом CD4+CD25+CD127lowCD45RA+ у пациентов с болезнью Крона, резистентных минимум к двум стандартным схемам терапии.
В целом хорошие результаты получены в ходе применения Т_reg для иммунотерапии при сахарном диабете 1-го типа (СД1). Клинические испытания стартовали в 2014 г. с рандомизированного исследования фазы I с целью оценки безопасности и целесообразности инфузии аутологичных Т_reg, полученных ex vivo у пациентов в возрасте 7–18 лет с недавно диагностированным СД1 [10]. По результатам годового исследования не было выявлено сильных побочных эффектов и тем самым подтверждена безопасность лечения. Кроме того, у 8 из 12 пациентов были выявлены признаки клинической ремиссии.
С той же целью в другом исследовании на базе Калифорнийского и Йельского университетов было проведено изучение эффективности и безопасности иммунотерапии у взрослых пациентов с СД1, результаты были опубликованы в 2015 г. [11]. В исследовании приняли участие 14 человек (6 женщин и 8 мужчин в возрасте 18–43 лет), разделенных на четыре группы в зависимости от дозы Т_reg при инфузии. Для инфузии применяли поликлональные Т_reg-клетки с фенотипом CD4+CD127lo/–CD25+ в количестве от 0,05 × 10⁸ до 26 × 10⁸ клеток. По результатам исследования, до 25% клеток от их пикового уровня сохранялось в периферическом русле реципиентов еще в течение года после адоптивного переноса. При этом не было выявлено никаких инфузионных реакций или побочных эффектов, связанных с клеточной терапией [11]. Однако данная работа не позволила определить оптимальное количество клеток для инфузии, а также установить, как влияет иммунотерапия на основе Т_reg на функцию β-клеток поджелудочной железы. Многоцентровое рандомизированное плацебо-контролируемое двойное слепое клиническое исследование II фазы (NCT02691247) ставит своей целью решить эти вопросы. В настоящее время идут рандомизированные открытые исследования фазы I/II NCT03011021 и NCT02932826 (Центральный Южный университет Чанша), оценивающие инфузию Т_reg пуповинной крови наряду с терапией лираглутидом и инсулином у взрослых и пожилых пациентов с аутоиммунным диабетом.
Кроме того, начаты открытые исследования по инфузии аутологичных поликлональных Т_reg у пациентов с временной активной кожной пузырчаткой (NCT03239470) и аутоиммунным гепатитом (NCT02704338).

Перспективы и трудности, связанные с применением Т_reg-клеток в иммунотерапии

Принципиальная возможность осуществления инфузии Т_reg-клеток пациентам с различными аутоиммунными патологиями и относительная безопасность данного подхода были продемонстрированы в ходе пилотных клинических исследований. На дальнейших этапах представляет интерес адаптировать применяемую у пациента в текущий момент иммуносупрессивную терапию к инфузиям Т_reg, так как показано, что некоторые иммунодепрессанты дозозависимо влияют на свойства Т_reg-клеток и могут снижать эффективность клеточной терапии [12]. Наиболее перспективным подходом представляется применение T_reg в комбинации с другими методами лечения, необходимыми в каждом конкретном случае.
Одно из основных препятствий для успешного применения Т_reg в иммунотерапии — получение стабильной фракции Т_reg-клеток, проявляющих стойкую иммуносупрессорную активность. Существующие методы получения Т_reg основаны на экспансии лимфоцитов ex vivo. При этом источником Т_reg служат клетки периферической крови, которые неоднородны и в значительной степени представлены клетками с индуцированной экспрессией FOXP3.

Другой не менее важной проблемой является повышение специфичности терапии. Функциональная активность T_reg по своей природе антигенспецифична. В присутствии антигена происходят активация T_reg и значительное увеличение экспрессии мембранных ингибирующих молекул, которые обусловливают супрессорное действие на клетки-мишени.
Эта зависимость была продемонстрирована in vivo на примере CTLA-4 — ключевой ингибирующей молекулы T_reg-клеток. CTLA-4 конститутивно экспрессируется как T_reg, так и Т-эффекторами [13]. T_reg контролируют активацию Т-эффекторов, ограничивая их доступ к костимулирующим молекулам CD80/86 на мембране АПК. CTLA-4 конкурентно блокирует CD80/86 на АПК, а также может связывать и перемещать CD80/86 внутрь клетки в результате транс- эндоцитоза. Таким образом, T_reg-клетки регулируют фенотип АПК и эффективно ограничивают CD28- зависимую активацию Т-эффекторов. Конкурентный эффект достигается за счет того, что экспрессия CTLA-4 на антигенспецифичных T_reg-клетках значительно выше, чем на Т-клетках. Триггером к захвату CD80/86 T_reg- клетками является презентация аутоантигена [13].
Клинические испытания, о которых говорилось выше, как правило, включают применение инфузии поликлональных T_reg-клеток с неизвестной антигенной специфичностью. Большая часть клонов в составе фьюзов будет неэффективна в отношении супрессии клеток- эффекторов и в подавлении аутоиммунных реакций. Кроме того, при использовании поликлональных лимфоцитов сохранаяется высокий риск возникновения побочных эффектов, таких как системная иммуносупрессия и реактивация инфекций. Таким образом, клинические подходы на основе поликлональных T_reg заведомо слабы.

В последнее десятилетие были разработаны новые высокоэффективные подходы лечения некоторых патологий на основе адоптивной клеточной иммунотерапии, которые могут позволить преодолеть вышеуказанные трудности в применении Т_reg для лечения аутоиммунных заболеваний. К таким подходам относят конструкции на основе эффекторных Т-клеток для экспрессии высокоспецифичных химерных антигенных рецепторов (CARs), а также методы редактирования генома, в частности CRISPR-Cas9.
CAR-модифицированные Т-клетки (CAR-T) применяют в иммунотерапии некоторых форм рака. Однако метод достаточно эффективен и в случае с Т_reg-клетками (CAR- Т_reg). CAR-Т_reg-технология имеет огромный потенциал: благодаря антигенспецифичности CAR-Т_reg позволяют повысить эффективность лечения при минимальных побочных эффектах [14]. В сравнении с использованием в терапии поликлональных Т_reg, CAR-Т_reg способны специфично связываться с определенным белком на мембране клеток-мишеней. Среди недостатков технологии можно отметить высокую сложность получения CAR-Т_reg со стабильной супрессорной активностью. Кроме того, существует опасность возникновения так называемого цитокинового шторма и нейротоксичности, как и в случае с противоопухолевыми CAR-T-клетками, что оказывается серьезным препятствием для использования CAR-Т_reg в клинике. Более того, препятствием для применения CAR-Т_reg являются идентификация и выбор мишеней для таргетной терапии, что особенно важно в случае с аутоиммунными заболеваниями в связи с особенностями их патогенеза и недостатком знаний об их этиологии.

Один из вышеуказанных недостатков, а именно получение стабильной фракции клеток, могут помочь устранить технологии на основе CRISPR-Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats / CRISPR-associated protein) или их более продвинутых аналогов. Первые доклинические исследования уже показали многообещающие результаты применения CRISPR-Cas9 в иммунотерапии. Предпринимаются попытки модификации функциональной активности Т_reg, в плане как стабилизации их активности, так и повышения уровня активности Т_reg. Известно, что одной из основных проблем применения Т_reg остается поддержание жизнеспособности клеток ex vivo, которая напрямую зависит от стабильности экспрессии гена FOXP3. В этой связи предлагают использовать технологию CRISPR-Cas9 для редактирования генов, участвующих в регуляции транскрипционных программ, контролирующих дифференцировку Т_reg-клеток и уровень экспрессии FOXP3. CRISPR-Cas9 обладает высокой специфичностью благодаря малым РНК: они способны направлять нуклеазу Cas9 точно в целевой фрагмент генома [15]. В случае с Т_reg-клетками и FOXP3 технология представляет интерес возможностью редактировать эпигеном. В первичных Т-клетках у мышей было показано, что используя модификацию базовой технологии, включающую мутантный Cas9 без эндонуклеазной активности (dead Cas9; CRISPR-dCas9), можно индуцировать заданные эпигенетические изменения, способствующие стабилизации экспрессии гена Foxp3 [16].

ВЫВОДЫ

Первые результаты клинических исследований продемонстрировали относительную безопасность применения Т_reg-клеток для лечения аутоиммунных патологий. Многообещающим стало исследование эффективности подхода, основанного на применении поликлональных Т_reg-лимфоцитов у пациентов с болезнью Крона и диабетом 1-го типа, а также для некоторых других аутоиммунных заболеваний. Однако большинство клинических исследований безопасности применения Т_reg были проведены на малых выборках, а сам подход имеет ряд серьезных недостатков, прежде всего низкую антигенную специфичность. Дальнейшие усилия должны быть направлены на нерешенные вопросы в отношении технологии адоптивной терапии T_reg-клеток: поиск эффективной дозы Т_reg для инфузии; повышение специфичности метода за счет идентификации мишеней для таргетной клеточной иммунотерапии и использования фьюзов антигенспецифичных T_reg; достижение стабильной супрессорной активности T_reg и стойкого эффекта от клеточной терапии у пациентов с аутоиммунными заболеваниями.