В настоящее время убедительно доказана ведущая роль иммунитета в развитии и течении заболеваний. Важнейшими медиаторами межклеточных взаимоотношений в иммунной системе являются цитокины, регулирующие иммуногенез в норме и при патологии [1, 2]. Дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов приводит к нарушению противоинфекционной защиты, а также к хронизации патологического процесса [3]. Активность синтеза цитокинов определяется экспрессией соответствующих генов, которая обусловлена не только влиянием персистирующих микроорганизмов, но и генетическими особенностями организма хозяина [4]. Существование однонуклеотидных замен (SNP) в генах человека, кодирующих иммунокомпетентные молекулы, определяет различные уровни их синтеза в ответ на инфекцию, что влияет на развитие и клиническое течение заболевания [5–7].
Верифицирован ряд полиморфных локусов промоторных регионов генов, связанных с продукцией провоспалительных цитокинов — IL1β, IL6, TNFα и др. [8–12].
Острые респираторные заболевания (ОРЗ) относят к числу наиболее распространенных заболеваний детского возраста. В настоящее время к часто болеющим (более шести эпизодов в год) относят детей с повторной или рецидивирующей респираторной вирусной, бактериальной или смешанной инфекционной патологией ЛОР-органов (аденоидит, тонзиллит, отит), верхних (ларингит) или нижних (трахеит, бронхит, пневмония) дыхательных путей, развивающейся на фоне сниженного иммунитета или неадекватного лечения острого респираторного заболевания [13–15]. Повышенная заболеваемость детей обусловлена целым рядом факторов, в том числе генетическими. В настоящее время идет поиск возможных иммуногенетических маркеров этой предрасположенности.
Целью исследования было выявить ассоциации полиморфизма генов ключевых провоспалительных цитокинов с предрасположенностью к частым респираторным заболеваниям у девочек-школьниц в возрасте от 7 до 17 лет.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Всего были обследованы 116 девочек-школьниц в возрасте 7–17 лет, проживающих в городе Самаре, обратившихся к детскому гинекологу в рамках медицинских (профилактических) осмотров в течение 2014–2016 гг. Критерии включения в группу: возраст от 7 до 17 лет; отсутствие тяжелых органических патологий; соответствие физического, полового и психического развития возрастным нормативам. Критерии исключения: иной возраст; наличие тяжелых органических патологий; несоответствие развития возрастным нормативам. Были изучены особенности анамнеза (частота и характер течения острых респираторных заболеваний) и особенности распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов провоспалительных цитокинов методом ПЦР c электрофоретической детекцией результата с помощью тест-систем SNP-ЭКСПРЕСС («ЛИТЕХ»; Россия). Выявляли следующие точечные мутации генов: IL1β T-31C (rs1143627); IL1β T-511C (rs16944), IL1β C-3953T (rs1143634), IL1β G-1473C (rs1143623) в гене интерлейкина- 1β; IL6 C-174G (rs1800795) в гене интерлейкина-6, TNFα G-308A (rs1800629) в гене фактора некроза опухоли альфа. ДНК для исследования выделяли из буккального эпителия с помощью набора реагентов для экспресс- выделения ДНК из буккального соскоба того же производителя. Все исследуемые замены SNP связаны с характеристикой иммунного статуса человека и входят в список рекомендованных для изучения в клинико- диагностических целях на ХХV-м Международном совещании по гистосовместимости и иммуногенетике, Бразилия, 2008 г. [16].
Для амплификации использовали детектирующий термоциклер DTlite в комплектации 4S1 («ДНК- технология»; Россия). Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону Харди–Вайнберга в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения по критерию Пирсона χ2-квадрат, а также выявление ассоциаций и значимость различий в частоте встречаемости качественных признаков (расчет отношения шансов (ОШ) c указанием 95%-го доверительного интервала (ДИ)) осуществляли online с помощью программы DeFinetti на сайте института генетики человека (Мюнхен, Германия) [17]. Анализировали данные, полученные при гипотезе доминирования минорной аллели, предполагающей оценку риска носительства данной аллели в любых сочетаниях.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ клинико-анамнестических данных показал, что у 56,9% обследованных девочек острые респираторные заболевания возникали до 6–10 раз в год, что позволило отнести их к группе часто болеющих детей. У 10,6% из них диагностирована хроническая патология ЛОР-органов (тонзиллит, фаринголарингит) с частыми обострениями (до 4–6 раз в год), которые проявлялись на фоне острой вирусной и/или бактериальной инфекции. В связи с этим все обследованные девочки были разделены на две группы: 65 девочек составили группу детей с частыми острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ) и 51 девочка вошла в группу детей без частых ОРЗ.
Частота встречаемости генотипов полиморфных вариантов пяти из шести проанализированных полиморфизмов генов иммунной системы соответствовала равновесию Харди–Вайнберга, за исключением полиморфизма гена TNFα (G-308A). В связи с этим указанный полиморфизм был исключен из дальнейшего анализа (см. таблица).
Анализ частот встречаемости аллелей и генотипов генов провоспалительных цитокинов в общей популяции девочек выявил преобладание носителей аллелей Т-31, G-1473, С-3953 гена IL1β (р < 0,05), определяющих высокие уровни синтеза соответствующего цитокина. В случае полиморфизма IL1β (T-511C) и IL6 (С-174G) имело место относительно равномерное распределение аллелей, ассоциированных с высоким и низким уровнями синтеза цитокина.

Сравнительная оценка отдельных полиморфизмов в клинически значимых локусах генов цитокинов, связанных с высокими и низкими уровнями их экспрессии, показала, что в группе часто болеющих девочек статистически значимо чаще встречаются аллели С в позициях 31 и 511 гена IL1β в гомозиготном и гетерозиготном состояниях. Наличие аллеля С-31 повышало риск частых респираторных заболеваний в два раза (ОШ = 2,05; ДИ: 1,16–3,64) по сравнению с носительством аллеля Т-31. Наибольший риск попадания в группу часто болеющих детей имеют девочки с генотипом СС по сравнению с гетерозиготами СТ (ОШ = 2,58; ДИ: 1,14–5,85), а также по сравнению с объединенной группой генотипов СТ+ТТ (ОШ = 2,65; ДИ: 1,25–5,63). Наличие аллеля С-511 в любых вариантах также с высокой долей вероятности несло риски возникновения частых респираторных заболеваний (ОШ = 1,68; ДИ: 0,99–2,83; р = 0,053). Риск частых респираторных заболеваний статистически значимо повышался в три раза и более у носителей гомозиготы СС по сравнению с гетерозиготами СТ (ОШ = 3,28; ДИ: 1,22–8,79), наличием гомозиготы ТТ (ОШ = 2,9; ДИ: 1,03–8,17) и по сравнению с объединенной группой генотипов СТ + ТТ (ОШ = 3,11; ДИ: 1,25–7,76) в локусе -511C/T гена IL1β.
Гипотеза наличия ассоциаций развития частых респираторных заболеваний с полиморфизмом в локусе гена IL6 (C-174G) не получила статистически значимых подтверждений, однако у часто болеющих девочек носительство аллеля G, связанного с высоким уровнем синтеза цитокина, встречалось в состоянии гомозиготы в 1,5 раза реже, чем у девочек без частых простудных заболеваний (ОШ = 0,57; ДИ: 0,20–1,59; р = 0,277).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Частые и длительные респираторные заболевания, особенно в раннем возрасте — нерешенная медицинская проблема, создающая, в свою очередь, значительные социальные и экономические проблемы для детей, их семей и общества. Согласно современным представлениям, основной причиной высокой восприимчивости детей к инфекции является незрелость иммунной системы и наследственная предрасположенность к инфекционным заболеваниям [18, 19]. Важную роль в противоинфекционной защите организма играют цитокины, регулирующие защитные реакции не только в рамках иммунной системы, но и на уровне всего организма. К настоящему времени накоплено большое количество данных о наличии функционального полиморфизма генов цитокинов, связанного с заменами единичных нуклеотидов (полиморфизм вследствие различия единичных нуклеотидов), которые приводят к количественным изменениям функционирования соответствующих генов. Такой функциональный полиморфизм генов цитокинов обусловливает индивидуальные наследственные колебания уровня их продукции, влияющие на развитие и исход инфекционных заболеваний и иммунопатологических процессов [20]. Провоспалительные цитокины играют центральную роль в формировании и регуляции воспалительных реакций, как во врожденном, так и в адаптивном иммунитете. В связи с этим изучение полиморфизма генов ключевых провоспалительных цитокинов может привести к новым направлениям в диагностике и лечении заболеваний [21, 22].

В нашем исследовании был проведен анализ ассоциаций полиморфизма генов ключевых провоспалительных цитокинов с предрасположенностью к частым респираторным заболеваниям у девочек-школьниц в возрасте от 7 до 17 лет. Оценивались клинически значимые функциональные полиморфизмы IL1β (T-31C), IL1β (T-511C), IL1β (C-3953T), IL1β (G-1473C) в гене интерлейкина-1β, IL6 (C-174G) в гене интерлейкина-6, TNFα (G-308A) в гене фактора некроза опухоли альфа.
На первом этапе была проанализирована частота встречаемости аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов провоспалительных цитокинов, а также проверено соответствие частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга среди всех обследованных девочек- школьниц без учета предрасположенности к респираторным заболеваниям. Необходимость данного этапа объяснялась тем, что именно соответствие полученных в наблюдении частот генотипов равновесию Харди–Вайнберга позволяет судить об адекватности выбора субъектов для проведения генетических исследований. Исследование показало, что частота встречаемости генотипов пяти из шести проанализированных полиморфных вариантов соответствовала равновесию Харди–Вайнберга, за исключением полиморфизма TNFα (G-308A). Для полиморфизма G-308A гена TNFα наблюдаемая гетерозиготность в общей группе обследованных девочек отличалась от ожидаемой, что может быть связано как с недостаточным количеством числа наблюдений, так и с особенностями распределения аллелей данного локуса в исследуемой группе. В связи с этим указанный полиморфизм был исключен из дальнейшего анализа.

Анализ характера распределения аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов IL1β и IL6 выявил преобладание носителей аллелей Т-31, G-1473, С-3953 гена IL1β и G-174 в гене IL6 в общей группе обследованных школьниц. Распределение аллелей полиморфизма IL1β (T-511C) было относительно равномерным. Выявленный характер распределения аллелей и генотипов совпадал с описанным для европейской популяции женщин [23], а также русских женщин, проживающих в городе Москва [24], что, по-видимому, свидетельствует об эволюционном преимуществе аллелей, определяющих высокий уровень синтеза провоспалительных цитокинов, по крайней мере, в европеоидной популяции.
Последующий анализ ассоциаций между носительством аллелей/генов в полиморфных локусах провоспалительных цитокинов показал, что наличие аллелей С-31 и С-511 в гене IL1β статистически значимо повышало риск возникновения частых респираторных заболеваний в 2–3 раза, особенно при гомозиготном варианте. У часто болеющих девочек также в 1,5 раза реже встречался аллель G в локусе 174 гена интерлейкина-6 (р > 0,05). Обнаруженная нами связь между полиморфными аллелями С-31, С-511 локусов гена IL1β и частыми респираторными заболеваниями согласуется с данными литературы, согласно которым данный интерлейкин играет центральную роль в генерации и регуляции противоинфекционного иммунитета, а носительство полиморфных вариантов в позициях 31Т и 511Т в большинстве случаев определяет увеличение выработки цитокина in vivo и in vitro по сравнению с аллелями С, носительство которых увеличивает частоту и тяжесть респираторных заболеваний у детей и взрослых [25–27].
Для ряда европеоидных популяций показано, что SNP IL1β (T-31C) находится в 100%-м неравновесном сцеплении с SNP IL1β (T-511C) [28], что, по-видимому, и объясняет выявление сходных рисков именно для данной пары полиморфизмов.

Вместе с тем тот факт, что нами была выявлена статистически значимая связь частых респираторных заболеваний только для двух полиморфизмов гена IL1β, свидетельствует, на наш взгляд, о необходимости выделения среди часто болеющих детей подгрупп с преобладанием вирусных или бактериальных инфекций, наличием/отсутствием аллергических заболеваний и т. д., а также увеличения числа обследованных в группах. В то же время система цитокинов — это полиморфная регуляторная сеть медиаторов с высокой надежностью, плейотропным действием, биологические эффекты которой характеризуются каскадностью, разнообразием и нередко избыточностью [29]. Поэтому снижение экспрессии одного или нескольких генов цитокинов и уменьшение продукции соответствующих пептидных медиаторов не всегда будут сопровождаться наличием ярко выраженной патологии. Все это говорит о том, что при изучении влияния полиморфизма генов цитокинов на патологические состояния недостаточно анализа носительства отдельных полиморфных вариантов в нескольких генах цитокиновой сети. Необходимо учитывать сцепленное наследование, взаимное влияние, взаимодействие с рецепторами и другие факторы, влияющие на цитокиновый статус в норме и при развитии патологии.

ВЫВОДЫ

1. В исследованной группе девочек 7–17 лет, проживающих в г. Самаре, преобладают носители аллелей Т-31, G-1473, С-3953 гена IL1β и G-174 в гене IL6.
2. Наличие аллелей С-31 и С-511 в гене IL1β ассоциировано с повышенным риском возникновения частых респираторных заболеваний.
3. В связи с выявлением связи между аллельными вариантами генов цитокинов и респираторными заболеваниями необходимо дальнейшее комплексное изучение функционального полиморфизма генов цитокинов для разработки новых направлений в диагностике, профилактике и персонификации лечения заболеваний.
4. При оценке индивидуальных иммуногенетических особенностей и поиске генетических маркеров для прогнозирования, профилактики и персонификации терапии недостаточно анализа носительства отдельных полиморфных вариантов в нескольких генах цитокиновой сети — необходимо учитывать сцепленное наследование, взаимное влияние, взаимодействие с рецепторами и другие факторы, влияющие на цитокиновый статус в норме и при развитии патологии.