Быстрое и прогрессирующее распространение коронавирусной инфекции COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2, глубоко повлияло на здоровье сотен тысяч людей, создав серьезный вызов системам здравоохранения и глобальной экономической стабильности. Характеристики SARS-CoV-2, особенно отличающие это заболевание от гриппа, заключаются в более высокой скорости инфицирования в сочетании с повышенным риском тяжелого течения и летальности, главным образом из-за возникновения острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС) [1]. Механизм инфицирования клетки активно изучают во многих лабораториях. В частности, уже известно, что вирусная оболочка SARS-CoV-2 экспрессирует белок SPIKE (белок S), который содержит рецепторсвязывающий домен, взаимодействующий с внеклеточным доменом ангиотензин-превращающего фермента 2 (АПФ2) с высокой аффинностью. Дальнейшее расщепление белка S сериновой протеазой 2 (TMPRSS2) для генерирования субъединиц S1 и S2 является критической стадией для слияния мембран и вирусной интернализации путем эндоцитоза с АПФ2 в легочном эпителии. Предполагается, что большую вирулентность SARS-CoV-2 по сравнению с другими коронавирусами можно объяснить тем фактом, что взаимодействие белка S1 с АПФ2 имеет заметно более сильную аффинность. Такой механизм попадания SARS-CoV-2 приводит к потере АПФ2 на поверхности клетки, тем самым способствуя хронической потере легочной функции и усилению фиброза тканей [2].

МикроРНК — это короткие некодирующие одноцепочечные РНК, состоящие в среднем из 22 нуклеотидов. Одна из важнейших внутриклеточных функций микроРНК — негативная регуляция экспрессии генов, осуществляемая путем связывания молекулы микроРНК с мРНК-мишенью по принципу комплементарности, что приводит к деградации мРНК или блокировке ее трансляции [3]. МикроРНК образуются из более длинных молекул-шпилек пре-микроРНК в результате обработки ферментами Drosha и Dicer, осуществляющими разрезание шпильки [4]. Неточность в позиции разреза приводит к появлению изоформ микроРНК, различающихся несколькими нуклеотидами на концах молекулы. Показано, что для многих микроРНК их каноническая форма экспрессирована значительно слабее, чем некоторая альтернативная изоформа [5]. Крайне важно, что у различных изоформ одной микроРНК могут быть совершенно разные гены-мишени. Это объясняется тем, что наиболее важную роль при связывании с мРНК-мишенью играет участок микроРНК со 2 по 7 нуклеотид (seed-регион) на 5'-конце молекулы [6].

Известно, что функциональные нарушения микроРНК и их изоформ связаны с большим количеством патологических состояний, в том числе с онкологическими, неврологическими и сердечно-сосудистыми заболеваниями [7]. Большое число работ посвящено исследованию роли микроРНК в патогенезе вирусных инфекций: одни из них направлены на изучение возможности прямого терапевтического микроРНК-воздействия на вирус [8], тогда как другие нацелены на изучение потенциальных взаимодействий микроРНК и белков, играющих ключевую роль в процессах жизнедеятельности вируса [9]. Однако вопрос о микроРНК-регуляции экспрессии АПФ2 и TMPRSS2 при COVID-19 остается малоизученным. Целью работы было выявить механизмы взаимодействия изоформ микроРНК и генов AПФ2 / TMPRSS2 в тканях толстого кишечника, известных высоким уровнем экспрессии указанных ферментов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для поиска изоформ микроРНК, взаимодействующих с ферментами АПФ2 И TMPRSS2, проводили интегрированный анализ парного профиля экспрессии мРНК и микроРНК в выборке нормальных тканей толстого кишечника, в котором данный фермент экспрессирован наиболее сильно. На выбор данной ткани повлиял также тот факт, что модели кишечника зачастую используют для исследований вирусов in vitro [10, 11]. Так, была использована публично доступная выборка, полученная в рамках проекта The Cancer Genome Atlas Colon Adenocarcinoma (TCGA-COAD), проанализированная методами мРНК- и микроРНК-секвенирования нового поколения [12]. Данные представляют из себя матрицы экспрессии тысяч мРНК и изоформ микроРНК в восьми образцах, единица экспрессии — двоичный логарифм количества ридов, попавших на соответствующий транскрипт, нормированный на верхнюю квартиль всего распределения (FPKM-UQ). Для поиска потенциальных регуляторных взаимодействий изоформ микроРНК и TMPRSS2 рассчитывали коэффициенты корреляции Спирмена между экспрессиями 25% самых высокоэкспрессированных изоформ с экспрессиями соответствующей мРНК, с последующей фильтрацией по p-value на уровне значимости 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспрессия АПФ2 и TMPRSS2 на уровне мРНК оказалась очень большой: TMPRSS2 попал в список 1% наиболее экспрессированных генов, тогда как экспрессия АПФ2 расположилась между 93-м и 94-м процентилями, что полностью согласуется с литературными данными [13] (см. рисунок).
Применение корреляционного анализа позволило выявить микроРНК miR-21, значимо отрицательно коррелирующую с экспрессией гена АПФ2, и следующие семейства микроРНК, регулирующие TMPRSS2: let-7a / let-7d, miR-30a, miR-30c, miR-127, miR- 194, miR-200c, miR-361 и miR-423. При этом микроРНК let-7a была представлена изоформой hsa-let-7a-5p, отличающейся от канонической добавлением аденина к 5'-концу молекулы, а miR-194 была представлена изоформой hsa-miR-194-3p, у которой отсутствует первый нуклеотид с 5'-конца. Отсутствие в этом списке соответствующих канонических форм микроРНК подчеркивает важность рассмотрения профиля всех изоформ микроРНК, а не только канонических.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Некоторые из найденных микроРНК уже были обнаружены в вирусологических исследованиях. Так, было показано, что экспрессия miR-30c в легких мыши значимо меняется при заражении вирусом SARS-CoV [14], что дает основание выдвинуть гипотезу о задействовании данной микроРНК в развитии болезни, вызванной вирусом. Огромный интерес представляет также микроРНК miR-200c. В 2017 г. была опубликована работа, показавшая, что эта микроРНК играет ключевую роль в патогенезе ОРДС вирусной этиологии [15]. Авторы выявили, что вирус птичьего гриппа H5N1 промотирует экспрессию miR-200c, мишенью которой служит рецептор АПФ2. Более того, были найдены вирусные белки, непосредственно отвечающие за повышение экспрессии микроРНК. Обнаружение возможности взаимодействия данной микроРНК с ферментом TMPRSS2 подчеркивает необходимость исследований по изучению роли miR-200c в патогенезе COVID-19.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты свидетельствуют о наличии множества регуляторных взаимодействий между изоформами микроРНК и ферментами АПФ2 / TMPRSS2. Такая информация крайне актуальна ввиду ключевой функции ферментов в механике инфицирования клетки коронавирусом SARS-CoV-2. Необходимы дальнейшие исследования для уточнения и экспериментальной валидации находок. В частности, возможно открытие новых направлений в терапии, основанных на контроле экспрессии АПФ2 и TMPRSS2 через микроРНК.