Появление и быстрое распространение нового коронавируса SARS-CoV-2 стало причиной пандемии заболевания COVID-19 [1]. Менее чем за три месяца с момента проникновения инфекции за пределы Китая подтверждено более 2 млн инфицированных и более 150 тыс. людей скончались [2]. В условиях полного отсутствия средств специфической профилактики и лечения изоляция и карантин стали единственно доступными средствами противодействия новой инфекции [3]. Способность коронавируса к передаче в инкубационном периоде сделала методы молекулярной диагностики на основе амплификации нуклеиновых кислот основным инструментом мониторинга и контроля над ситуацией [4]. Так, КНР, Сингапур, Южная Корея и Германия, сумевшие наладить широкое тестирование граждан и своевременное выявление носителей SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (РТ-ПЦР), добились стабилизации эпидемической ситуации и сохранили резервы системы здравоохранения для лечения наиболее тяжелобольных. В свою очередь Италия, Швеция и США, запоздавшие с внедрением массового скрининга или отрицавшие его действенность на первом этапе, в настоящий момент испытывают серьезные трудности.
Молекулярно-биологические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, обладают высокой чувствительностью и специфичностью и позволяют не только быстро обнаружить РНК вируса у тяжелобольных пациентов, но и выявлять людей с бессимптомным течением заболевания, что особенно важно для предотвращения распространения вируса [5, 6]. Китайские ученые и ВОЗ оперативно распространили свои рекомендации с указанием последовательностей праймеров и зондов для выявления SARS-CoV-2, разработанные на основе первых полногеномных сиквенсов, однако в последующие месяцы были получены тысячи полных геномов, благодаря которым уже разработано множество вариантов ПЦР-тест-систем. В этой работе рассмотрены основные подходы к дизайну ПЦР систем и особенности их использования для обнаружения SARS-CoV-2.

Основой качественной диагностики является правильно собранный и информативный биологический материал. При выборе типа материала критичными являются знания тканевой тропности вируса. Так, на успешность выявления SARS-CoV-2 методом РТ-ПЦР влияют источник и способ сбора биологического материала. Исследования показывают, что информативность биологического материала для выявления SARS-CoV-2 можно расположить по убыванию в следующем порядке: образцы жидкости бронхоальвеолярного лаважа, мокрота, мазки из носа, биопсия, мазки из глотки, кал и кровь (1% случаев) [7]. Однако для скрининговых исследований самым доступным и информативным типом материала являются мазки из носа и ротоглотки [8, 9]. Правильное взятие мазка не только позволяет получить качественный материал для исследования, но и обеспечивает безопасность медицинского персонала [10].
Основным методом молекулярно-генетического анализа, позволяющего выявлять SARS-CoV-2, является ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [6, 11, 12]. Это наиболее доступный, высокочувствительный и специфичный метод. Использование ПЦР-тест-систем помогает проводить масштабные скрининговые исследования с целью выявления инфицированных лиц, а также определять вирусную нагрузку у каждого пациента.

Подходы к созданию тест-систем

На сегодняшний день опубликовано уже несколько десятков работ исследователей разных стран с описанием олигонуклеотидов и ПЦР-РВ-тест-систем для идентификации SARS-CoV-2. Анализ данных работ показывает, что существуют разные подходы к созданию ПЦР-РВ-тест-систем для выявления SARS-CoV-2. Наиболее простой и доступный вариант дизайна — это моноплексные тесты, в которых олигонуклеотиды выбраны на один ген вируса. Более сложные модификации позволяют создавать мультиплексные варианты, в которых олигонуклеотиды выбраны на разные гены. В последнем случае праймеры и зонды могут иметь разную специфичность или позволяют дискриминировать SARS-CoV-2 от родственных коронавирусов и других респираторных инфекций. Для выбора праймеров и зондов на SARS-CoV-2 чаще всего используют гены вирусного нуклеокапсида (N1 и N2), ген РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRP) и ген Е белка оболочки SARS-CoV-2. Так, для выявления пациентов с COVID-19 CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Центр по контролю и профилактике заболеваний США) рекомендует, сначала провести скрининг на наличие гена Е, нуклеотидная последовательность которого не отличается от таковой у вируса SARS, а затем дифференцировать SARS от SARS-CoV-2 при помощи олигонуклеотидов на ген RdRP [13]. В соответствии с протоколом ВОЗ образцы тестируют на наличие генов N и Orf1b, но предлагаемые олигонуклеотиды не позволяют различать SARS-CoV-2 и SARS, поэтому для окончательной идентификации вирусов рекомендуется использовать секвенирование [14]. В табл. 1 приведены открытые для всех желающих последовательности праймеров и зондов, рекомендуемые ВОЗ и CDC.

Особенности использования существующих тест-систем

Высокая востребованность привела к появлению в России большого разнообразия различных коммерческих тест-систем, многие из которых уже получили регистрационное удостоверение изделия медицинского назначения (табл. 2). На сегодняшний день на российском рынке уже более десятка ПЦР-РВ-тестов и у каждого есть свои особенности. Так, для моноплексных вариантов характерна более высокая чувствительность (до 500 ГЭ/мл) по сравнению с мультиплексными вариантами (от 1000 до 10000 ГЭ/мл), тогда как мультиплексные наборы (несколько генов SARS-CoV-2) позволяют избежать появления ложноотрицательных результатов, обусловленных вариабельностью вируса (появление мутаций на месте посадки олигонуклеотидов). Необходимо также отметить, что иногда результаты полученные при помощи тест-систем, выявляющих несколько вирусных генов, довольно сложно интерпретировать, что может быть связано с недостаточной оптимизацией олигонуклеотидного состава. Тем не менее заявленная чувствительность всех российских коммерческих наборов составляет 1000 ГЭ/мл. Кроме того, независимо от количества специфичных вирусных мишеней в тест-системе, обязательно наличие внутреннего контроля, он может быть как эндогенным (ДНК человека), так и экзогенным (например, РНК-фаг). Внутренний контроль позволяет контролировать все этапы протокола от экстракции нуклеиновых кислот до ПЦР.
Несмотря на очевидную необходимость внутреннего контроля не все системы его включают. По техническим причинам такого контроля лишены наборы, основанные на изотермической амплификации, например петлевой изотермической амплификации (loop-mediated isothermal amplification, или LAMP). Основные преимущества таких тестов — быстрота получения ответа (до 40 мин), отсутствие необходимости в хорошо оборудованной лаборатории и возможность проводить тестирование у постели больного (не требуется термоциклер). Чувствительность тестов на основе LAMP может достигать 1–3 копий РНК в реакцию [15]. Однако существующие коммерческие образцы не «дотягивают» до заявленной чувствительности (см. табл. 2).

Полногеномное секвенирование

Наиболее информативным методом молекулярно-генетического анализа остается секвенирование. Особенностью пандемии, вызванной SARS-CoV-2, стало наличие самого большого количества последовательностей полного генома коронавируса, полученных за короткий период времени. Полногеномное секвенирование никогда не было так близко к клиническому применению, как в случае пандемии COVID-19. Существует несколько подходов для полногеномного секвенирования SARS-CoV-2. Классический метод — экстракция нуклеиновых кислот из носоглоточных и/или ротоглоточных мазков и дальнейшее истощение рибосомной РНК-хозяина с приготовлением библиотек и последующим секвенированием по стандартным протоколам производителя. Однако данный метод требует достаточного количества РНК вируса и большого количества прочтений. При малой вирусной нагрузке возможна наработка вируса на культурах клеток. Для этого проводят пассирование вируса с использованием клеточных линий Vero V, Vero E6, LLC-MK2 и ряда других. Данный подход был успешно применен в некоторых лабораториях, в том числе в Референс-центре по коронавирусной инфекции (код доступа к базе GISAID: EPI_ISL_421275).

Подходом, альтернативным культивированию на клеточных линиях, является полногеномная амплификация вируса SARS-CoV-2. На сегодняшний день было разработано несколько таргетных панелей, позволяющих проводить полногеномное секвенирование SARS-CoV-2. Одна из них — Ion AmpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel (Thermo Fisher Scientific; США). Данная панель состоит из двух пулов праймеров для амплификации фрагментов длиной 125–275 пар оснований [16].

Другая панель была разработана Paragon Genomics Inc (США), она включает два пула праймеров и позволяет амплифицировать фрагменты длиной 99 пар оснований [17]. Потенциальня эффективность обнаружения SARS-CoV-2 с помощью панели от Paragon Genomics Inc — 1,15 копии вируса (с вероятностью 95%). Совместное использование двух перекрывающихся пулов праймеров позволит обеспечить полное покрытие всего генома вируса, и расчетный предел обнаружения составляет 0,29 копии (с вероятностью 95%). Информация о пределе обнаружения SARS-CoV-2 с использованием панели AmpliSeq SARS-CoV-2 Research Panel пока отсутствует.

Еще один из методов — протокол для пробоподготовки и биоинформатического анализа от ARTIC [18]. Он разработан для секвенирования на платформе Oxford Nanopore и позволяет получить результаты в течение 8 ч.

ВЫВОДЫ

Методы, основанные на молекулярно-генетическом анализе нуклеиновых кислот, позволяют организовать мониторинг и надзор за распространением SARS-CoV-2, что является важной составляющей борьбы с пандемией COVID-19. Главное их преимущество по сравнению с термометрией или выявлением симптомов — возможность выявлять бессимптомных носителей и инфицированных в инкубационный период. Несмотря на большое разнообразие дизайнов, классическая ПЦР-РВ остается наиболее предпочтительным методом. Совершенствование изотермических способов позволит сделать молекулярные методы анализа еще более доступными и эффективными для мониторинга и контроля над биологическими угрозами в будущем. Секвенирование генома вируса позволяет накопить информацию о его изменениях и использовать ее при оптимизации праймеров для ПЦР-РВ, разработки вакцин, изучения эволюции вируса, а также для реконструкции эпидемиологических процессов, способствующих развитию эпидемии. Используя различные платформы для секвенирования, можно проводить анализ не только в стенах лаборатории, но и непосредственно в клиниках и получать более оперативную информацию.