Совершенствование вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) за последние 15–20 лет привело к повышению частоты имплантации эмбрионов человека, что повлекло за собой рост числа многоплодных беременностей. Многоплодная беременность является доказанным фактором риска осложненного течения беременности и родов и значительно повышает риск возникновения материнских и перинатальных осложнений [1–3]. В связи с этим перенос одного эмбриона стал приоритетной задачей лечения методами ВРТ [4, 5].
Для максимального повышения вероятности наступления беременности в программах ВРТ первостепенное значение имеет возможность выбора эмбриона с наивысшим потенциалом развития. Это позволит сократить время до достижения беременности и облегчит ранжирование оставшихся эмбрионов для криоконсервации, что в последующем будет способствовать переносу потенциально качественного эмбриона в первую очередь [6, 7].
С момента возникновения технологии экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) морфологическая оценка эмбрионов человека была основным методом, используемым эмбриологами для оценки развития и выбора эмбрионов при переносе. Со временем были разработаны классификации для оценки развития и жизнеспособности эмбрионов. Однако их использование на практике оказалось более трудным, чем ожидалось, из-за высокодинамичного характера развития эмбриона в период преимплантации. Другими словами, эмбрион, оцененный в 8 ч утра на вторые сутки развития, может выглядеть совсем по-другому через несколько часов [8]. Следовательно, чрезвычайно сложно интерпретировать данные морфологии без оценки развития эмбриона в динамике, с анализом морфологии в разные промежутки времени.

С внедрением в лабораторию ЭКО time-lapse технологии, или TLM (электронной микроскопии с временным интервалом), — современного метода выбора эмбриона для переноса, наступила новая эра эмбриологии. Благодаря этой методике на сегодняшний день возможна оценка морфологии эмбрионов как континуум, т. е. с фиксацией изображения каждые несколько минут [9–11].
В настоящее время получены противоречивые данные о результатах использования TLM. Ретроспективное исследование показало, что культивирование эмбрионов в инкубаторе EmbryoScope может улучшить показатели рождаемости, а традиционные методы культивирования негативно влияют на развитие эмбрионов и потенциал имплантации [12]. Авторы текущих ретроспективных и проспективных исследований подчеркивают и преимущество этой технологии с многообещающими результатами [13–16], и отсутствие различий по сравнению с морфологической оценкой качества эмбрионов [17, 18].
Целью исследования было оценить исходы переноса одного эмбриона в программе ЭКО у пациенток с хорошим овариальным резервом с использованием TLM.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 208 женщин с бесплодием, которым был проведен перенос одного эмбриона по программе ЭКО на базе ЗАО «Медицинская компания ИДК» (г. Самара) в 2013–2015 гг.
Произведен статистический анализ 208 клинических и эмбриологических протоколов пациенток с помощью статистического пакета SPSS21, номер лицензии 20130626-3 (An IBM Company; США) и Microsoft Excel (Microsoft; США).
Критерии включения в исследование: программа ЭКО; циклы с использованием собственных ооцитов; циклы с получением восьми и более ооцитов; перенос одного эмбриона на пятые сутки культивирования; толщина эндометрия 8 мм и более на день переноса эмбриона.

Критерии исключения: программа ИКСИ; циклы с использованием донорских ооцитов; циклы с получением менее 8 ооцитов; циклы с переносом размороженного эмбриона; перенос эмбрионов на третьи сутки культивирования; перенос двух эмбрионов; толщина эндометрия менее 8 мм на день переноса эмбриона.
Ограничений по возрасту пациенток для включения в исследование не было. Минимальный возраст составил 20 лет, максимальный — 42 года.

Пациенток разделили на две группы. Группу исследования составили 95 пациенток с хорошим овариальным резервом с переносом одного эмбриона по программе ЭКО с использованием системы time-lapse микроскопии.
Группу контроля составили 113 пациенток с хорошим овариальным резервом с переносом одного эмбриона по программе ЭКО с использованием метода традиционного культивирования и выбора эмбриона для переноса. Средний возраст, факторы бесплодия, длительность отсутствия бесплодия в браке, порядковый номер настоящей программы ЭКО статистически не различались у пациенток двух групп. Средний возраст женщин в основной и контрольной группах составил 31,40 ± 0,38 и 30,65 ± 0,37 г. соответственно (р > 0,05).

Эмбриологический этап программы ЭКО в группе исследования проводили с использованием видео-системы наблюдения за развитием эмбрионов Primovision (Vitrolife; Швеция).
В обеих группах для оценки качества эмбрионов использовали буквенно-цифровую систему, разработанную Gardner и Schoolcraft в 1999 г. [19]. Бластоцисты градации АА, АВ, ВА оценивали как эмбрионы отличного качества; бластоцисты градации ВВ оценивали как эмбрионы хорошего качества; бластоцисты градации АС, СА, ВС, СВ, СС оценивали как эмбрионы удовлетворительного качества.

По типу переноса эмбриона в каждой группе были выделены две подгруппы: подгруппа с неэлективным переносом одного эмбриона на пятые сутки культивирования (подгруппа 5SET: 45 пациенток в группе исследования, 67 — в группе контроля) и подгруппа с элективным переносом одного эмбриона на пятые сутки культивирования (подгруппа 5еSET: 50 пациенток в группе исследования, 46 — в группе контроля). Элективным считали перенос при наличии выбора из двух и более эмбрионов отличного качества.

Дополнительно в группе исследования выбор эмбрионов на перенос проводили на основании их соответствия ключевым морфодинамическим параметрам системы. В качестве ключевых событий деления эмбрионов оценивали следующие параметры: время наступления первого дробления; интервал времени между первым и вторым дроблением; время наступления второго дробления; время наступления третьего дробления; время формирования бластоцисты. Если все параметры деления эмбриона соответствовали референсным значениям системы и эмбрион был отличного или хорошего качества на основании морфологической оценки, такой эмбрион выбирали для переноса (референс-положительный эмбрион). В подгруппе с референс-положительным эмбрионом было 52 пациентки. В том случае, если один или несколько параметров деления эмбриона не соответствовало референсному значению системы, выбор эмбриона на перенос осуществляли дополнительно на основании стандартной морфологической оценки (референс-отрицательный эмбрион). В подгруппе с референс-отрицательным эмбрионом было 43 пациентки.

В обеих группах культивирование проводили с использованием универсальной среды Continuous Single Culture (Irvine Scientific; USA). Оценку качества эмбрионов на пятые сутки культивирования проводили через 116–118 ч после оплодотворения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования в обеих группах была проведена оценка качества переносимых эмбрионов, частоты наступления клинической беременности, частоты наступления родов и частоты случаев потери беременности.

Доля пациенток позднего репродуктивного возраста (≥ 35 лет) составила 21,05% в основной группе и 23,89% — в группе контроля (p > 0,05). Поскольку настоящее исследование включало только женщин с хорошим овариальным резервом и с переносом одного эмбриона, то основную часть наблюдений составили женщины молодого репродуктивного возраста.
Среднее число полученных ооцитов в основной и контрольной группах составило 11,87 ± 0,32 и 12,49 ± 0,40 соответственно (р > 0,05).

Известно, что качество переносимых эмбрионов значительно влияет на вероятность наступления беременности при использовании ЭКО. Так, при переносе эмбрионов отличного или хорошего качества показатель частоты наступления клинической беременности значительно выше, чем при переносе эмбрионов удовлетворительного качества [20]. В группе исследования в 100% случаев были перенесены эмбрионы хорошего (16 эмбрионов) и отличного (79 эмбрионов) качества, в группе контроля этот показатель составил 93,8% (из них 88 эмбрионов отличного качества, 18 эмбрионов хорошего качества) (р = 0,037) (рис. 1). У 7 пациенток группы контроля были перенесены эмбрионы удовлетворительного качества (6,2%).
При анализе качества переносимых эмбрионов между подгруппой пациенток с положительным референсным значением перенесенных эмбрионов и подгруппой пациенток с отрицательным референсным значением перенесенных эмбрионов различий не выявлено. В подгруппе с положительным референсным значением доля циклов с переносом отличного эмбриона составила 87,5%, в подгруппе с отрицательным референсным значением — 78,95% (р = 0,44).
Таким образом, частота наступления клинической беременности при использовании ЭКО не различалась между двумя группами и составила 64,2% в основной группе и 60,2% в группе контроля (р = 0,65).

Среди всех исходов переноса эмбрионов доля наступивших родов составила 52,6% в основной группе и 42,5% в группе контроля (p > 0,05). Число всех случаев ранней потери беременности (биохимические беременности и потери в сроке до 12 недель гестации) в основной группе составило 11,6%, в группе контроля 17,7%, хотя разница была статистически незначимой.

Мы не получили статистически значимых различий в группе исследования между подгруппой пациенток с положительным референсным значением перенесенных эмбрионов и подгруппой пациенток с отрицательным референсным значением перенесенных эмбрионов в частоте клинической беременности (66,7 и 60,5% соответственно) и по частоте наступивших родов (50 и 52,6% соответственно).
Так как по данным литературы элективный перенос эмбриона повышает вероятность благоприятного исхода переноса [21], был проведен сравнительный анализ частоты наступивших родов в зависимости от вида переноса.

Так, в основной группе частота родов составила 54% при элективном переносе эмбриона (подгруппа 5eSET) и 51,1% — при неэлективном переносе (подгруппа 5SET) (р = 0,940). В группе контроля вид переноса существенно влиял на частоту родов: в подгруппе переноса 5eSET частота родов составила 54,3%, а в подгруппе переноса 5SET — только 34,3% (р = 0,052 при оценке точным методом Фишера). Разница в частоте родов составила 20,1% (95% ДИ — 1,5–37%) при ОШ 2,28 (95% ДИ — 1,06–4,91). Таким образом, у женщин при использовании TLM независимо от вида переноса процент наступления родов был высоким 54,0% и 51,1% и статистически не различался. 
С учетом полученных выше данных нами была проведена оценка связи благоприятного исхода цикла ЭКО (наступление родов) с двумя факторами: наличием или отсутствием TLM и с видом переноса эмбриона (элективный или неэлективный) (табл. 2).

В группе комбинации двух признаков (вид переноса 5eSET в обеих группах и вид переноса 5SET в основной группе) частота наступления родов достигала 53,2%, в то время как в группе контроля с видом переноса 5SET этот показатель был ниже и составил 34,3% (р = 0,01) (ОШ = 2,17 (1,19–3,97)). Таким образом, можно предположить, что есть положительная тенденция к повышению частоты наступления родов при использовании TLM независимо от вида переноса эмбриона.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Технология использования TLM минимизирует контакт эмбриона с внешней средой, что может быть одним из факторов, обусловливающих более высокий имплантационный потенциал эмбриона. Непрерывный мониторинг с короткими промежутками времени дает больше информации о кинетике и морфологии эмбрионов по сравнению со стандартной ежедневной оценкой. Текущие публикации содержат противоречивые данные о влиянии TLM на результаты программы ЭКО.

В рамках нашего исследования получены данные о переносе бластоцист более высокого качества в группе TLM, что совпадает с данными ряда авторов [22, 23]. Так, у пациенток с хорошим овариальным резервом доля бластоцист хорошего качества и число криоконсервированных эмбрионов на пациентку были существенно ниже в группе контроля, по сравнению с группой TLM (50,7% и 1,72 ± 1,55 против 60,1% и 2,64 ± 2,59 соответственно; р < 0,05); хотя не было получено статистически значимых различий в числе эмбрионов хорошего качества на третьи сутки, частоте случаев наступления клинической беременности и частоте случаев имплантации [23]. Поскольку в нашем исследовании пациентки по клиническим характеристикам (возрасту, факторам бесплодия, продолжительности бесплодия) не различались между двумя группами, можно предположить, что различие в доле эмбрионов отличного и хорошего качества связано с отсутствием влияния в группе TLM факторов внешней среды (температуры, света, изменения рН).
Эффективность TLM может быть обусловлена двумя факторами: стабильными условиями культивирования эмбрионов (для оценки качества эмбриона нет необходимости извлекать эмбрион из инкубатора) и возможностью выбора эмбриона на перенос с помощью программного обеспечения [24].

По результатам недавно проведенного обзора Cochrane (2995 супружеских пар), отсутствуют убедительные доказательства преимущества TLM по сравнению с традиционным культивированием — не было обнаружено достоверных различий в частоте случаев наступления клинической беременности (ОШ 0,95; 95% ДИ — 0,78– 1,16) и частоте родов (ОШ 1,12; 95% ДИ — 0,92–1,36) [25]. В метаанализе ведения 1637 пациенток, напротив, показано преимущество использования TLM по сравнению со стандартной инкубацией и оценкой качества эмбрионов [26]. В этом исследовании сообщается о высокой частоте наступления клинической беременности (51,0 против 39,9%; ОШ 1,54, 95% ДИ — 1,21–1,97), более низкой частоте ранней потери беременности (15,3 против 21,3%; OШ 0,66, 95% ДИ — 0,47–0,94) и высокой частоте случаев живорождения (44,2 против 31,3%; ОШ 1,67, 95% ДИ — 1,13–2,46).

Мы получили высокую частоту наступления клинической беременности в обеих группах (64,2% в группе исследования и 60,2% в контрольной группе), что может свидетельствовать об отсутствии негативного влияния на культуру эмбрионов использования системы непрерывного мониторинга. Применение покадровой микроскопии вело к снижению числа случаев ранней потери беременности.
Нельзя исключить, что отсутствие различий между двумя группами по частоте наступления клинической беременности, частоте наступления родов и случаев ранней потери беременности в нашем исследовании может быть связано с небольшим с точки зрения статистики числом наблюдений (95 пациенток) с помощью TLM.

В одном из ретроспективных когортных исследований было показано увеличение частоты случаев наступления клинической беременности в группе TLM (+15,7% на перенос эмбриона) [27]. Но в отличие от нашей работы, это исследование было гетерогенным по составу пациентов (включало циклы с донорскими ооцитами), количеству переносимых эмбрионов (от 1 до 3 эмбрионов), по суткам переноса — в большинстве случаев в группе TLM проводили перенос на третьи сутки культивирования, что снижало итоговый показатель частоты наступления клинической беременности. Так, в указанной работе в группе TLM показатель наступления клинической беременности на пункцию фолликулов (получение ооцитов) при переносе эмбриона на пятые сутки культивирования составил 50%, в то время как в нашем исследовании показатель наступления клинической беременности в расчете на перенос эмбриона на пятые сутки культивирования достигал 64,2%. Из достоинств этой работы можно отметить разработанную авторами прогностическую (математическую) модель, согласно которой в клинике ВРТ после использования TLM можно ожидать увеличения числа случаев наступления клинической беременности на 15,7% в расчете на перенос эмбриона. При этом улучшения результатов лечения чаще всего можно достигнуть увеличением числа циклов ЭКО с использованием TLM до 200 раз и выше.

Как многие технологические достижения, применение TLM может не дать быстрого эффекта во всех лабораториях, и для успешного внедрения, вероятно, потребуется некоторая стандартизация. Действительно, TLM не всегда имеет преимущество при отборе эмбрионов в клинических исследованиях [22]. Однако нельзя не упомянуть о ее возрастающей ценности для проведения непрерывного культивирования и помощи в выборе времени процедуры биопсии эмбриона [28, 29].
В настоящее время ведутся работы по внедрению искусственного интеллекта в TLM для определения комбинаций параметров, способных указать на максимальный потенциал эмбриона к имплантации и живорождению [24].

ВЫВОДЫ

В проведенном исследовании не выявлено различий в частоте наступления клинической беременности, частоте достижения родов и частоте случаев ранней потери беременности между группой TLM и группой традиционного культивирования эмбрионов, что может быть связано с небольшим числом наблюдений в группе TLM. При использовании TLM выявлена высокая частота наступления родов вне зависимости от элективного и неэлективного переноса эмбриона, однако отсутствовали различия в частоте случаев наступления клинической беременности и ранней потери беременности. При использовании традиционного способа культивирования и выбора эмбриона для переноса вид переноса существенно влиял на частоту случаев достижения родов: в подгруппе элективного переноса показатель родов был выше, по сравнению с подгруппой неэлективного переноса (р = 0,052 при оценке точным методом Фишера). Проведение элективного переноса эмбриона на пятые сутки культивирования (5eSET) или использование TLM вне зависимости от вида переноса было благоприятным фактором и повышало шанс на роды (р = 0,01).
Представленные данные открывают перспективы изучения преимущества использования TLM у пациенток разных возрастных групп, у пациенток со сниженным овариальным резервом. Дальнейшее накопление фактического материала необходимо для анализа таких показателей, как кумулятивный показатель беременности в циклах ВРТ с использованием системы видеонаблюдения, а также для мониторинга отдаленных результатов использования этой технологии. Нет сомнений, что скоро будут созданы сложные системы для неинвазивной оценки качества эмбрионов (морфологии, динамики и метаболизма), позволяющие автоматизировать процесс выбора эмбриона для переноса. Они снизят вероятность воздействия факторов человека и окружающей среды и, как следствие, увеличат рождаемость при переносе эмбрионов.