Один из перспективных скрининговых подходов в онкодиагностике получил название жидкостной биопсии. Он состоит в обнаружении циркулирующих опухолевых клеток, циркулирующей опухолевой ДНК или РНК и экзосом в плазме крови у пациентов со злокачественными новообразованиями (ЗНО). Жидкостная биопсия включает различные методы анализа: количественный анализ представленности отдельных молекул, в том числе и белковых, анализ последовательности нуклеиновых кислот, анализ метилирования ДНК и др. [1]. Анализ внеклеточной фракции нуклеиновых кислот плазмы крови дает возможность отслеживать генетическую гетерогенность опухоли в динамике (в ответ на применение различных методов лечения, подавляющих рост опухолевых клеток) [2, 3].
Известно, что апоптотические или некротические клетки высвобождают в кровоток фрагменты ДНК и РНК, а также экзосомы (мембранные инкапсулированные субклеточные структуры, содержащие белки и нуклеиновые кислоты, выделяемые опухолевыми клетками) [4]. Клетки от этапа раннего онкогенеза до метастазирования в ходе эволюции опухоли накапливают специфичные мутации и эпигенетические модификации, что может быть отражено во фракции внеклеточных нуклеиновых кислот.

Анализ внеклеточной фракции ДНК

Анализ внеклеточной фракции ДНК как диагностический инструмент в онкологии используют уже более 20 лет, применяя при раках легких [5, 6], головы и шеи [7], пищевода [8], молочной железы [9], печени [10], толстой кишки [11], поджелудочной железы [12], почек [13] и др. Как правило, определяют наличие мутаций онкогенов, генов- супрессоров опухоли или микросателлитные изменения [6, 9, 13]. Анализ метилирования циркулирующей ДНК также может быть информативен для постановки диагноза, прогнозирования и мониторинга роста опухолей [8, 14]. Кроме примеров с ЗНО, количественные аберрации циркулирующей ДНК описаны в исследованиях ряда других патологических состояний, включая преэклампсию [15], хромосомные анеуплоидии плода [16] и неукротимую рвоту беременных [17].

Анализ внеклеточной фракции мРНК

Поскольку активную пролиферацию опухолевых клеток и эволюцию опухоли сопровождают значительные изменения профиля представленности многих транскриптов (относительно нормы), используя количественную ОТ-ПЦР, можно попытаться детектировать изменение профиля внеклеточных мРНК [18]. Так, ОТ-ПЦР успешно применили для оценки содержания мРНК генов «домашнего хозяйства», циркулирующей в крови в норме и при опухолевой патологии [19]. Циркулирующие РНК изучали при таких ЗНО, как меланома [20–22], фолликулярная лимфома [23], рак молочной железы [22, 24–28], толстой кишки [23, 29], печени [30], пищевода [21], носоглотки [31], щитовидной железы [22], простаты [40, 41], легких [32] и др. При этом внРНК исследовали и при патологических состояниях неонкологического спектра — у пациентов с травмой [33, 34], диабетической ретинопатией [35] или у женщин во время беременности (фетальная мРНК) [36].

Так, для рака молочной железы (РМЖ) обнаружили статистически значимое изменение содержания мРНК hTERT в плазме пациентов с начальными стадиями РМЖ по сравнению со здоровыми людьми. При этом было показано, что присутствие мРНК hTERT в плазме пациентов с РМЖ зависит от хирургического удаления опухоли [25]. Однако hTERT, скорее всего, не является РМЖ-специфичным маркером, поскольку его изменение обнаружено и у пациентов с меланомой и раком щитовидной железы [22]. Экспрессия мРНК hMAM в плазме в значительной степени коррелировала с неблагоприятным прогнозом и более низкими показателями выживаемости у пациенток c РМЖ [26]. В другом исследовании продемонстрирован повышенный уровень мРНК Bmi-1 в плазме у пациентов с РМЖ в сравнении со здоровыми [27]. Недавно показано, что уровень циркулирующей мРНК большого межгенного некодирующего РНК-регулятора репрограммирования (LincRNA-ROR) может быть потенциальным биомаркером для диагностики РМЖ, и, учитывая, что его уровни в плазме снижались в послеоперационном периоде по сравнению с предоперационными образцами, данный маркер может быть использован для мониторинга состояния пациентов [28].

При раке яичников обнаружены повышенный уровень сывороточного MMP-9 у пациенток с запущенными стадиями и его корреляция с плохим прогнозом, что указывает на потенциальную прогностическую роль этого биомаркера [37]. Выявление циркулирующей внРНК HMGA2 тоже может быть инструментом для диагностики и мониторинга пациенток с раком яичников [38].

При раке предстательной железы у пациентов с метастазами наблюдают более высокие уровни циркулирующей мРНК cBMP6 в сравнении с пациентами с контролируемой локализованной опухолью. При этом для H3K27me3 характерно обратное распределение и его уровень был значительно ниже у пациентов с метастазами, чем у пациентов с более ранними стадиями. Таким образом, уровни циркулирующих в плазме крови мРНК сBMP6 и H3K27 после лечения позволяют отличать метастатический рак предстательной железы от локализованного заболевания [39]. Количественная оценка мРНК hTERT в плазме также может быть опухолевым маркером для различения локализованного и местно- распространенного рака простаты [40].

Анализ состава экзосом

Особое внимание в последнее время уделяют изучению секретируемых опухолью внеклеточных везикул (экзосом и микровезикул), способствующих, как считается, инвазии и метастазированию [41, 42].
Внеклеточные везикулы являются специализированными мембранными органоидами, секретируемыми большинством типов клеток, и содержат различные молекулярные составляющие, включая РНК, белки, липиды и метаболиты [43, 44]. В настоящее время внеклеточные везикулы все чаще признают важными медиаторами межклеточной коммуникации, а именно средством для транспорта мРНК через внеклеточную среду от опухолевых клеток к нормальным клеткам [45, 46].
В микровезикулах стабильно обнаруживаются микроРНК, различные виды длинных РНК (включая мРНК), кольцевая РНК и длинные некодирующие РНК [47, 48]. Профили РНК внеклеточных везикул здоровых людей и пациентов с гепатоцеллюлярным раком достоверно различались [48].

Анализ внеклеточной фракции микроРНК

МикроРНК представляют собой группу некодирующих регуляторных РНК, состоящих примерно из 22 нуклеотидов и играющих важную роль в регуляции экспрессии генов [49]. Они могут иметь определенные преимущества по сравнению с мРНК в качестве циркулирующих биомаркеров из-за своей высокой стабильности. Кроме упомянутой выше экзосомной фракции микроРНК, они циркулируют и вне экзосом [50, 51] и стабильны, по- видимому, благодаря связыванию с белками-аргонавтами [52] или липопротеиновыми комплексами (например, липопротеинами высокой плотности) [53].
Анализ циркулирующих микроРНК описан для пациентов с лимфомой [54], а также в плазме и сыворотке пациентов с раком простаты [55]. Уровень представленности miR- 26a в плазме может выявлять пациентов с эпителиальным раком яичников [56]. Представленность четырех микроРНК (miR-148b, miR-376c, miR-409-3p и miR-801) значительно возрастает в плазме больных РМЖ [57]. Установлено также повышение уровня микроРНК (miR-16, miR-21 и miR-451) и значительное снижение содержания miR-145 в плазме пациенток с РМЖ [58]. При этом комбинация miR- 145 и miR-451 была лучшим биомаркером при различении РМЖ от здорового контроля и всех других видов рака, включенных в это исследование.

Проблемы и ограничения метода

Хотя анализ внРНК имеет высокий потенциал применения в различных областях медицины, эта технология содержит и ряд недостатков. Количественную оценку внРНК затрудняют искажения, возникающие в ходе амплификации мишеней, особенно при анализе низкопредставленных молекул [59]. Искажения могут быть обусловлены и разной эффективностью метода обратной транскрипции на разных последовательностях микроРНК и мРНК при различном молекулярном окружении. Поэтому стратегии обнаружения внРНК без ПЦР представляют большой интерес [60, 61].
На сегодняшний день большинство предложенных диагностических подходов на основе анализа внРНК обладает сравнительно низкой чувствительностью и специфичностью [62]. Для повышения этих показателей необходимо проведение больших проспективных когортных исследований.

ВЫВОДЫ

Анализ внРНК при онкологических заболеваниях, на наш взгляд, демонстрирует высокую диагностическую и прогностическую ценность этого вида малоинвазивных биомаркеров. Информативность жидкостной биопсии можно повысить за счет дифференциального анализа экзосомной и свободно циркулирующей фракций внРНК, включая анализ микроРНК. Для снижения ложноположительных и ложноотрицательных результатов необходимо применение стандартизованных протоколов отбора проб, выделения внРНК и анализа полученных результатов. Для выбора наиболее чувствительных и специфичных панелей внРНК необходимо проведение более масштабных проспективных когортных исследований.