В мире и, в частности, РФ число заболеваний органов пищеварения удваивается каждое десятилетие, что представляет собой глобальную медико-социальную проблему [1]. Несмотря на широкую вариабельность эпидемиологических данных рост заболеваемости язвенным колитом (ЯК) и болезнью Крона (БК), в том числе среди молодых социально активных и трудоспособных лиц, констатируют многие авторы [2, 3]. Повсеместно регистрируется увеличение количества больных с ЯК и БК, заболеваемость составляет 3–62 и 50–70 случаев на 100 тыс. населения в год соответственно [4]. Только в США около 1,6 млн человек страдают от ЯК и БК [5, 6]. Серьезную проблему при ЯК и БК составляет широкий спектр кишечных и внекишечных осложнений, увеличивающих финансовые затраты на госпитализацию, хирургическое и амбулаторное лечение.
Патогенез ЯК и БК до конца не ясен прежде всего в связи с широким спектром этиологических факторов, инициирующих активацию клеточных и гуморальных компонентов иммунной системы при участии Тh1-, Тh2- зависимого иммунного ответа, изменения баланса Тh17/T_reg [7].
При ЯК и БК наряду с цитокинами, ферментами, иммуноглобулинами и другими факторами в запуске и поддержании воспалительного процесса в стенке кишечника имеют значение активные формы кислорода (АФК) и азота, генерируемые активированными нейтрофилами, моноцитами/макрофагами, эндотелиоцитами, эпителиоцитами в условиях дефицита факторов антиокислительной защиты [8–10]. АФК и активные формы азота, продукты их взаимодействия с белками и липидами могут выступать в роли маркеров повреждения тканей кишечника, отражающих тяжесть течения заболевания и эффективность проводимой терапии, а также служить мишенями при поиске новых персонифицированных терапевтических и профилактических подходов к регуляции локального редокс-статуса в толстом кишечнике при БК и ЯК [11– 13]. В этом отношении представляет интерес изучение особенностей свободно- радикального окисления (СРО) и взаимосвязи показателей редокс-статуса в очаге повреждения кишечника и тяжести клинических проявлений при ЯК и БК.
Целью исследования было изучить особенности СРО в толстом кишечнике, его связь с клиническими проявлениями при ЯК и БК в эксперименте in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проводили на 35 крысах-самцах линии Wistar массой 200–230 г. Животные были случайным образом разделены на три группы: группа 1 (n = 7) — интактный контроль; группа 2 (n = 14) — животные с БК; группа 3 (n = 14) — животные с ЯК. Для моделирования БК 30 мг тринитробензосульфоновой кислоты (ТНБС) (Sigma-aldrich; США) растворяли в 150 мл 50%-го этанола, 0,2–0,3 мл в зависимости от массы тела полученного раствора вводили per rectum через полиуретановый катетер (ОАО «Синтез»; Россия) диаметром 2 мм на глубину 8 см [14]. ЯК моделировали двухэтапным введением оксазолона (Sigma-aldrich; США): на первом этапе проводили накожную сенсибилизацию нанесением на межлопаточную область 150 мкл 3%-го спиртового раствора оксазолона, на втором этапе ректально на глубину 7–8 см вводили 150 мкл 3%-го спиртового раствора оксазолона [15]. Для анестезии использовали препарат «Золетил-100» (МНН: тилетамина гидрохлорид) (Virbac Sante Animale; Фpaнция) в дозе 20 мг/кг. БК и ЯК верифицировали по клинической картине и морфологии очага повреждения в кишечнике. Исследования проводили на 3-и и 7-е сутки. Клинический статус оценивали ежедневно в баллах по модифицированной шкале Disease activity index (DAI), адаптированной для крыс [16, 17]. Показатели параметров представлены в (табл. 1). Под параметром «жидкий стул» понимали несформированные каловые массы с консистенцией пасты или жидкие. Под термином «диарея» понимали отсутствие оформленного стула с частотой дефекаций более трех раз в сутки. Ректальное кровотечение определяли как присутствие свежей крови на шерсти вокруг ануса и в каловых массах. Наличие скрытой крови в каловых массах определяли с помощью бензидиновой реакции.

Для приготовления 10%-го гомогената слизистой оболочки толстого кишечника проксимальную часть ободочной кишки извлекали из брюшной полости, помещали в охлажденный 0,1 М раствор фосфатного буфера (рН 7,4), после чего около 100 мг ткани гомогенизировали в стеклянном механическом гомогенизаторе в соотношении 1 : 10 в течение 3 мин при температуре не выше 4 °C с последующим получением 1 мл гомогената. Содержание продуктов пероксидного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате определяли экстракционно- спектрофотометрическим методом на спектрофотометре «СФ-56» («ЛОМО-Спектр»; Санкт-Петербург) по методике Волчегорского И. А. и соавт. [18, 19]. В гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта измеряли оптическую плотность при 220 нм (содержание изолированных двойных связей), 232 нм (содержание диеновых конъюгатов — ДК), 278 нм (содержание кетодиенов и сопряженных триенов — КД и СТ), 400 нм (основания Шиффа — ШО). Относительное содержание продуктов ПОЛ выражали в единицах индексов окисления (е.и.о.): E232/E220 (ДК), Е278/Е220 (КД и СТ) и Е400/Е220 (ШО). Продукты окислительной модификации белков (ОМБ) в гомогенате определяли по реакции карбонильных производных белков с 2,4-динитрофенилгидразином в спонтанном и металл-зависимом по реакции Фентона режимах с последующей регистрацией на спектрофотометре альдегиддинитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетондинитрофенилгидразонов (КДНФГ) в ультрафиолетовой части спектра и области видимого света [20, 21]. Результат выражали в единицах оптической плотности на 1 мг белка (у.е./мг) или в относительных величинах (%). Резервно-адаптационный потенциал (РАП, %) рассчитывали путем отношения продуктов спонтанного окисления к индуцированному. Результаты обрабатывали с помощью программы IBM SPSS Statistics 19 («SPSS: An IBM Company»; США). Показатели представлены в виде медианы (Ме) и квартилей [Q₁–Q₃]. Значимость различий между группами оценивали при помощи критериев Краскелла–Уоллиса, Манна–Уитни, Вальда–Вольфовитца. Для выявления связи между изучаемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (R). Отличия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При экспериментальной БК, начиная с 3-х суток наблюдения, у животных были зафиксированы увеличение частоты дефекации, изменение консистенции кала, кровь в каловых массах; на 7-е сутки наблюдения к указанным признакам добавились снижение массы тела и увеличение выраженности симптомов, что нашло отражение в статистически значимом увеличении индекса DAI на 3-и и 7-е сутки эксперимента (табл. 2). Кроме того, было отмечено снижение двигательной активности животных. В динамике БК значение DAI на 7-е сутки статистически значимо превышало значения на 3-и сутки (р < 0,05). В липидном экстракте слизистой оболочки толстого кишечника при БК изменяется содержание продуктов ПОЛ (табл. 3). Так, на 3-и сутки увеличивается в гептановой фазе количество первичных и вторичных продуктов, в изопропанольной фазе — первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ. На 7-е сутки в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта увеличивается содержание первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ. В динамике БК в изопропанольной фазе содержание первичных и конечных продуктов ПОЛ нарастает от 3-х к 7-м суткам (р < 0,01). Далее при экспериментальной БК нами была проведена оценка содержания продуктов ОМБ в спонтанном и индуцированном режимах в гомогенате толстого кишечника (табл. 3).

Обнаружено, что на 3-и и 7-е сутки эксперимента увеличивается суммарное количество карбонильных производных белков — необратимых продуктов окислительного стресса, формирующихся за счет окисления нескольких аминокислотных остатков, а также взаимодействия продуктов пероксидного окисления липидов и редуцирующих сахаров. В динамике БК суммарное содержание продуктов ОМБ возрастает на 7-е сутки по сравнению с 3-ми сутками наблюдения (р < 0,01). Анализ относительного содержания компонентов ОМБ выявил, что на 7-е сутки БК снижается доля первичных продуктов — альдегидов и увеличивается доля вторичных продуктов — кетонов. Поскольку в области УФ-спектра накапливаются карбонильные производные нейтрального характера, а в видимой — основного характера, относительный анализ суммарного содержания карбонилов в области УФ-света и в области видимого света позволяет оценить природу образовавшихся продуктов в динамике БК. Так, на 3-и сутки БК относительное содержание продуктов ОМБ основного и нейтрального характера не отличается от группы интактных животных. На 7-е сутки эксперимента зафиксировано смещение спектра в сторону образования продуктов ОМБ основного характера, о чем свидетельствуют снижение суммарного относительного содержания продуктов в области УФ-спектра и повышение суммарного относительного содержания продуктов в области видимого света. Проведена оценка резервно- адаптационного потенциала в гомогенате толстого кишечника при экспериментальной БК путем подсчета отношения общего содержания продуктов ОМБ в спонтанном режиме и металл-индуцированном. Для этого исследовано содержание продуктов ОМБ в гомогенате толстого кишечника после индукции окисления белков компонентами реакционной смеси, включающей Fe₂+ и Н₂О₂, что сопровождается образованием высокореактогенного радикала ОН — в реакции Фентона. Обнаружено, что суммарное содержание продуктов ОМБ в металл-индуцированном режиме в гомогенате толстого кишечника повышается на 3-и и 7-е сутки экспериментальной БК, на 3-и сутки относительное содержание первичных и вторичных продуктов ОМБ основного и нейтрального характера не отличается от группы интактных животных, на 7-е сутки снижается доля альдегидов нейтрального характера и увеличивается доля кетонов основного. Как видно, изменения показателей ОМБ в металл-индуцированном режиме по своей направленности соответствуют изменениям показателей ОМБ в спонтанном режиме. Общий резервно-адаптационный потенциал значительно повысился на 3 сутки экспериментальной БК, к 7-м суткам наблюдения — статистически значимо не отличался от группы интактных животных. Данное изменение резервно-адаптационного потенциала обусловлено на 3-и сутки повышением резервно-адаптационного потенциала АДНФГ и КДНФГ в области УФ-спектра и видимого спектра, но преимущественно — КДНФГ, регистрируемых в области видимого спектра.

При экспериментальном ЯК у животных на 3-и сутки наблюдения снижается масса тела, увеличивается число дефекаций, консистенция кала становится жидкой, появляется кровь, определяемая как визуально, так и с проведением бензидиновой пробы, на 7-е сутки выраженность клинических признаков возрастает, что отражается в статистически значимом увеличении индекса DAI (см. табл. 2). В динамике ЯК значение DAI на 7-е сутки статистически значимо превышает значения на 3-и сутки (р < 0,05). При оценке продуктов ПОЛ в гомогенате слизистой оболочки толстого кишечника при ЯК на 3-и сутки зарегистрировано статистически значимое увеличение в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта уровня первичных, вторичных и конечных продуктов (табл. 3).

На 7-е сутки ЯК обнаружены аналогичные изменения: статистически значимое увеличение в гептановой и в изопропальной фазах первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ. В динамике экспериментального ЯК содержание в изопропанольной фазе первичных, вторичных продуктов ПОЛ снижается от 3-х к 7-м суткам (р < 0,01).

При экспериментальном ЯК в слизистой оболочке толстой кишки отмечено статистически значимое увеличение суммарного содержания ОМБ в спонтанном режиме на 3-и и 7-е сутки (см. табл. 3). При этом относительное количество АДНФГ снижается, а КДНФГ увеличивается на 3-и и 7-е сутки наблюдения, относительное количество карбонильных производных основного характера увеличивается, а нейтрального — снижается на 7-е сутки эксперимента, о чем свидетельствуют повышение суммарного относительного содержания продуктов ОМБ в области видимого света, снижение — в УФ-области. Анализ содержания при экспериментальном ЯК продуктов ОМБ в металл-индуцированном режиме показал повышение на 3-и и 7-е сутки суммарного количества продуктов ОМБ. Относительное количество АДНФГ снижается, а относительное количество КДНФГ увеличивается на 3-и и 7-е сутки эксперимента. Выявлено преимущественное повышение суммарного относительного содержания продуктов ОМБ в области видимого света на 3-и сутки наблюдения, что указывает на смещение спектра продуктов ОМБ в сторону образования АДНФГ и КДНФГ основного характера. Общий резервно-адаптационный потенциал статистически значимо снижался на 3-и и 7-е сутки экспериментального ЯК.

При проведении корреляционного анализа установлены ассоциации между интегральным показателем клинического статуса DAI и содержанием продуктов ПОЛ и продуктов ОМБ в гомогенате слизистой оболочки толстого кишечника (табл. 4). На 3-и сутки эксперимента ассоциации представлены при БК средней силы связями DAI с содержанием вторичных продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах, суммарным количеством продуктов ОМБ в спонтанном режиме, при ЯК — сильными связями DAI с содержанием вторичных продуктов ПОЛ в гептановой фазе, первичных и вторичных продуктов в изопропанольной фазе, суммарным количеством продуктов ОМБ в спонтанном и индуцированном режимах. На 7-е сутки эксперимента ассоциации представлены при БК связями DAI с содержанием первичных продуктов ПОЛ в гептановой фазе, первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ в изопропанольной фазе, суммарным количеством продуктов ОМБ в спонтанном и индуцированном режимах, при ЯК — сильными связями DAI с содержанием первичных и конечных продуктов ПОЛ в гептановой фазе, первичных, вторичных и конечных продуктов в изопропанольной фазе, суммарным количеством продуктов ОМБ в спонтанном и индуцированном режимах. Наибольшее количество сильных связей было выявлено при ЯК: из 12 связей 10 сильных, в то время как при БК из 9 связей обнаружена только одна сильная.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При экспериментальном моделировании БК и ЯК наблюдаемая клиническая картина характерна для этих заболеваний, что позволяет применять представленные модели с использованием ТНБС и оксазолона для изучения патогенеза изменений гомеостаза. Потеря веса у крыс в среднем не превышала 10%, принято считать, что она обусловлена как диареей, так и системным воспалительным ответом, в частности анорексигенным эффектом некоторых провоспалительных цитокинов [22]. Полагают, что ТНБС выступает в роли гаптена и индуцирует после ректального введения Th1-зависимый иммунный ответ с участием различных провоспалительных цитокинов и медиаторов против гаптен-модифицированных аутологичных белков (антигенов) в стенке толстого кишечника или белков кишечной микробиоты, что приводит к трансмуральной инфильтрации лейкоцитами и воспалению [23–25]. Оксазолон рассматривают в качестве гаптена, опосредующего Th2-зависимый иммунный ответ, характерный для ЯК, и большинство исследователей предпочитают его как наиболее востребованный агент при моделировании этого заболевания у крыс [26]. Используемый в качестве растворителя для ТНБС и оксазолона 50%-й раствор этилового спирта вызывает дополнительное повреждение слизистой оболочки толстого кишечника [27].

При экспериментальных БК и ЯК наряду со снижением массы тела, увеличением частоты и изменением консистенции стула, а также наличием крови в каловых массах, зафиксировано накопление продуктов ПОЛ в слизистой оболочке толстого кишечника. Такое накопление выявлено как в изопропанольной фазе липидного экстракта слизистой толстого кишечника, которая аккумулирует преимущественно фосфолипиды клеточных мембран, так и в гептановой фазе (в триацилглицеридах). Кроме того, обнаружено накопление продуктов ОМБ, преимущественно вторичных — КДНФГ и преимущественно основного характера в спонтанном и индуцированном режимах. Это позволяет говорить об аккумуляции поздних маркеров окислительной деструкции белка и преимущественно фрагментации белков под влиянием совместного действия радикалов ОН ̇ и О2 ̇ [20, 28, 29]. Белковые фрагменты высокоустойчивы к протеолизу, имеют токсичные свойства и могут инициировать апоптоз или некроз клеток, расширяя зону вторичной альтерации [30]. Есть ряд особенностей СРО в толстом кишечнике при БК и ЯК в отношении окислительной деструкции липидов и белков. Во-первых, сравнительный анализ показывает, что на 3-и сутки эксперимента содержание конечных продуктов ПОЛ в гептановой фракции и вторичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции липидного экстракта толстого кишечника, а также на 7-е сутки количество вторичных и конечных продуктов ПОЛ в гептановой фракции, количество вторичных продуктов ПОЛ в изопропанольной фракции значимо выше у крыс с ЯК (см. табл. 3). Во-вторых, при сравнительной оценке продуктов ОМБ в гомогенате толстого кишечника выявлено, что при БК резервно- адаптационный потенциал и суммарное содержание продуктов ОМБ выше в спонтанном и индуцированном режимах на 3-и и 7-е сутки эксперимента. Кроме того, при сравнительной оценке относительного количества первичных и вторичных продуктов ОМБ основного и нейтрального характера видно, что при БК по сравнению с ЯК на 3-и сутки превалирует содержание первичных основного характера продуктов ОМБ в спонтанном и индуцированном режимах, на 7-е сутки — содержание основного характера продуктов ОМБ в спонтанном режиме.

Полагаем, что эскалация оксидативного стресса, инициируемого продукцией АФК активированными нейтрофилами, моноцитами/макрофагами, эндотелиоцитами в очаге первичного повреждения в условиях дефицита активности и/или количества ферментов антиокислительной защиты, приводит к дополнительному повреждению, дисфункции и гибели клеток толстого кишечника, расширению зоны вторичной альтерации и, как следствие, утяжелению симптомов в динамике БК и ЯК. По данным корреляционного анализа такое предположение подтверждено ассоциацией показателя клинического статуса DAI и содержания продуктов ПОЛ и продуктов ОМБ в гомогенате слизистой оболочки толстого кишечника при БК и ЯК.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование позволило выполнить поставленную цель и установить, что в динамике экспериментальных ТНБС-индуцированной БК и оксазолониндуцированного ЯК на 3-и и 7-е сутки наблюдения увеличивается индекс клинической активности болезни, в толстом кишечнике повышается количество первичных, вторичных и конечных продуктов ПОЛ в гептановой и изопропанольной фазах, повышается суммарное количество продуктов ОМБ, при БК на 7-е сутки увеличивается доля вторичных продуктов ОМБ основного характера. Особенностями СРО при ЯК выступает преимущественное накопление продуктов ПОЛ, при БК — продуктов ОМБ; при ЯК прежде всего накапливаются конечные продукты ПОЛ в гептановой фазе и вторичные продукты в изопропанольной фазе липидного экстракта; при БК — вторичные продукты ОМБ основного характера. При БК и ЯК установлена ассоциация индекса клинической активности болезни и содержания продуктов ПОЛ преимущественно в изопропанольной фазе, продуктов ОМБ в спонтанном режиме; наибольшее количество сильных связей зафиксировано при ЯК. Полученные результаты расширяют имеющиеся представления о роли изменений редокс-статуса в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника, служат предпосылкой для проведения дальнейших исследований по изучению СРО в толстом кишечнике в клинических условиях у больных БК и ЯК для обозначения продуктов ПОЛ и ОМБ в качестве диагностических маркеров заболевания, а также показателей эффективности проводимой терапии при купировании обострений и пролонгации ремиссии.