С каждым годом в мире растет доля бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Под определение МЛУ-штаммов попадают штаммы бактерий, обладающие устойчивостью к трем и более антибактериальным препаратам [1]. Бактериальные инфекции, вызываемые МЛУ-штаммами, входят в список самых опасных угроз для мирового общественного здравоохранения. Наибольшее количество случаев устойчивости детектируют среди так называемых ESKAPE-патогенов (от начальных букв Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa и Enterobacter spp.). Бактерии этой группы вызывают угрожающие жизни внутрибольничные инфекции, особенно у людей с ослабленным иммунитетом и хроническими заболеваниями [2–4].

Согласно данным Всемирной организации здравоохранения, бактериальные патогены можно отнести к трем уровням приоритета опасности: критический, высокий и средний [1]. Карбапенем-устойчивые A. baumannii, P. aeruginosa и Enterobacteriaceae spp, а также K. pneumoniae относят к критическому уровню опасности. Доля таких изолятов в мировой популяции может достигать 50 и 64% для P. aeruginosa и K. pneumoniae соответственно [5]. Метициллин-устойчивые S. aureus (MRSA — от англ. methicillin resistant Staphylococcus aureus) и ванкомицин-устойчивые E. faecium относят к высокому уровню опасности. Доля MRSA может достигать 43%, а ванкомицин-устойчивых E. faecium — 59,1% [5]. При этом с каждым годом количество устойчивых изолятов только возрастает.

Инфекции, вызванные лекарственно-устойчивыми ESKAPE-патогенами, требуют искать новые подходы к лечению пациентов. Один из таких подходов — применение вирулентных бактериофагов в качестве дополнения или альтернативы антибактериальным препаратам. Попытки применения бактериофагов были сделаны еще в начале ХХ в. В настоящие время бактериофаги зарекомендовали себя как эффективные антибактериальные агенты [6, 7]. Применение вирулентных бактериофагов имеет ряд преимуществ, главное из которых в том, что взаимодействие между бактериофагом и бактерией не зависит от профиля устойчивости к антибактериальным препаратам. Надо также отметить, что бактериофаги постоянно коэволюционируют совместно с бактериями-хозяевами, что позволяет им преодолевать защитные системы последних.
На фармацевтическом рынке нашей страны представлена линейка препаратов на основе вирулентных бактериофагов (или фагов). Все они представляют собой коктейли из нескольких вирулентных бактериофагов. Использование таких коктейлей обеспечивает расширение спектра действия по отношению к различным штаммам бактерий. В основном коммерческие препараты вирулентных бактериофагов на территории России выходят под торговыми марками АО НПО «Микроген» и НПЦ «Микромир». Надо отметить, что производитель указывает широкий спектр активности препаратов против таких ESKAPE-патогенов, как E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa. К сожалению, на сегодняшний день на рынке не представлены препараты бактериофагов, действующие против A. baumannii и Enterobacter spp., что подчеркивает необходимость их разработки.
Целью работы было оценить эффективность коммерческих фаговых препаратов и моноизолятов бактериофагов, выделенных из природных источников, против клинических штаммов E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные изоляты

В исследование включены изоляты E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae и P. aeruginosa (n = 147), выделенные от пациентов, проходивших лечение в стационаре Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России в 2018–2019 гг. Культивирование бактерий проводили в течение 18–24 ч на колумбийском агаре (Oxoid; Великобритания) или на соевом бульоне (Oxoid; Великобритания) при температуре 37 °С.
Видовую идентификацию проводили с помощью метода прямого масс-спектрометрического профилирования бактериального лизата по методике, описанной ранее [8]. В качестве матрицы использовали насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (α-cyano-4-hydroxycinnamicacid (Bruker Daltonics; Германия)) в 50%-м ацетонитриле и 2,5%-й трифторуксусной кислоте. Масс-спектры получали на времяпролетном масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics; Германия). Для калибровки использовали бактериальный тест-стандарт (Bruker Daltonics; Германия). Для записи, обработки и анализа масс-спектров применяли программное обеспечение flexControl 3.0 и flexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics; Германия). Видовую идентификацию проводили с помощью программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics; Германия).

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам

Оценку чувствительности бактериальных штаммов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом по международным лабораторным стандартам (CLSI, the Clinical and Laboratory Standards Institute, 2019) [9]. Для грамотрицательных микроорганизмов (K. pneumoniae и P. aeruginosa) тестировали следующие антибактериальные препараты: цефтриаксон, гентамицин, ципрофлоксацин и меропенем. Для грамположительных микроорганизмов (S. aureus и E. faecium) устанавливали профиль чувствительности к эритромицину, ципрофлоксацину и тетрациклину.
S. aureus дополнительно тестировали на устойчивость к оксациллину и гентамицину. Чувствительность E. faecium к ванкомицину оценивали методом серийных разведений в соответствии со стандартами CLSI [9].

Молекулярно-генетическое типирование штаммов коллекции

Типирование штаммов K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. faecium проводили методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) с использованием стандартных схем [10–14]. Для S. aureus использовали метод spa-типирования, основанный на установлении последовательности гена стафилококкового белка А (Staphylococcus protein A), с применением стандартного протокола [15].
Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-экспресс» («Литех»; Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Пробы ДНК хранили при –20 °C. Реакцию амплификации генов, входящих в схемы молекулярно-генетического типирования, проводили на TETRAD DNA ENGINE (MJ Research; США). Амплификацию осуществляли в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 66 мМ Tris-HCl (рН 9), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 2,5 мМ MgCl₂, 250 мкМ каждого dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы («Литех»; Россия) и по 10 пмоль соответствующих праймеров. Продукты амплификации анализировали в 2%-м агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.
Секвенирование по Сэнгеру выполняли на приборе 3730 DNA Analyzer (Thermo Fisher Scientific; Великобритания). Последовательности генов анализировали с помощью программного обеспечения Ridom StaphType TM (Ridom GmbH; Würzburg, Германия), а также комплекса программ Vector NTI Suite 9 (Thermo Fisher Scientific; Великобритания). Для определения аллельных профилей и сиквенс-типов штаммов методом МЛСТ сравнивали полученные нуклеотидные последовательности с аналогичными последовательностями, доступными в международной базе данных PubMLST [11].

Препараты бактериофагов

В исследовании оценивали эффективность 14 коммерческих терапевтических препаратов вирулентных бактериофагов различных серий фирмы АО НПО «Микроген» (таблица). Все препараты были приобретены в аптеках г. Москвы и разрешены для клинического применения.

Выделение бактериофагов из природных источников

Бактериофаги, эффективные в отношении отдельных штаммов K. pneumoniae и S. aureus, выделяли из природных источников (проб воды из различных водоемов) методом накопительных культур. Для этого образец воды в объеме 50 мл пропускали через фильтр Millipore с диаметром пор 0,45 мкм (Merck Millipore; США). К пробе добавляли двукратный бульон LB (от англ. lysogeny broth) (Oxoid; Великобритания), вносили 300 мкл ночной культуры бактериального штамма и инкубировали на качалке при 37 °С в течение 18 ч. После культивирования бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3500 g, надосадок пропускали через фильтр Millipore с диаметром пор 0,22 мкм (Merck Millipore; США). Моноизоляты получали последовательным (трехкратным) выделением из отдельных негативных колоний. В дальнейшем бактериофаги наращивали в 50 мл бульона LB, содержащего 300 мкл ночной культуры бактериального штамма. Концентрацию бактериофага в фаговом лизате оценивали стандартным методом титрования по Грациа [16].

Оценка эффективности препаратов бактериофагов и фаголизатов бактериофагов

Оценку эффективности литических бактериофагов (титр более 107) проводили методом спот-тестирования. Для этого 0,1 мл ночной культуры смешивали с полужидким LB-агаром (0,6% агара). Полученную взвесь распределяли по поверхности чашки Петри, содержащей слой LB-агара (1,5% агара). После застывания верхнего слоя с полужидким агаром на поверхность наносили по 5 мкл исследуемых препаратов и инкубировали при температуре 37 °С в течение 18–24 ч. Через сутки на местах нанесения капли наблюдали образование прозрачного пятна лизиса либо отдельных негативных колоний. В таком случае бактериальный штамм считали чувствительным к действию препарата. Если пятно лизиса отсутствовало, бактериальный штамм считали устойчивым. Эффективность действия препарата бактериофагов по отношению к бактериальным штаммам одного вида определяли как процент чувствительных к данному препарату штаммов бактерий этого вида в общем пуле штаммов коллекции соответствующего вида.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования создана коллекция из 147 бактериальных штаммов: K. pneumoniae (33 штамма; 22,5%), P. aeruginosa (40 штаммов; 27,2%), S. aureus (50 штаммов; 34%) и E. faecium (24 штамма; 16,3%). Для всех штаммов коллекции определен профиль устойчивости к антибактериальным препаратам (рис. 1).
Согласно нашим данным, 9 из 33 штаммов (27,3%) K. pneumoniae были чувствительны ко всем тестируемым антибактериальным препаратам; 4 из 33 (12,1%) были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 17 из 33 (51,5%) были классифицированы как МЛУ. Для штаммов P. aeruginosa чувствительность ко всем тестируемым антибактериальным препаратам была определена для 7 из 40 (17,5%) штаммов; 15 из 40 (37,5%) штаммов были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 6 из 40 (15%) P. aeruginosa были классифицированы как МЛУ.
Среди S. aureus чувствительными ко всем тестируемым антибактериальным препаратам были 19 из 50 (38%) штаммов; 7 из 50 (14%) были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 22 из 50 (44%) классифицированы как МЛУ. Устойчивость к оксациллину проявляли 27 штаммов (54%). Среди E. faecium чувствительных штаммов выявлено не было; 3 из 24 (12,5%) штаммов были устойчивы к одному антибактериальному препарату, а 19 из 24 (19,2%) классифицированы как МЛУ. Доля штаммов E. faecium, устойчивых к ванкомицину, составила 12%.
На основании проведенного молекулярно-генетического типирования методом МЛСТ штаммы K. pneumoniae были отнесены к 15 сиквенс-типам (рис. 2A). Наиболее представленными сиквенс-типами оказались ST395 и ST23, к ним относились 14 из 33 (42,4%) и 5 из 33 (15,2%) штаммов соответственно. Было также обнаружено два уникальных сиквенс-типа (2-1-1-1-9-4-1 и 2-1-1-1-9-4-18). По результатам типирования выявлено, что штаммы P. aeruginosa относились к 26 различным сиквенс-типам (рис. 2Б). Сиквенс-тип ST12 был наиболее представленным (5 из 40 штаммов; 12,5%). Кроме того, было выявлено три уникальных сиквенс-типа: 15-5-11-8-4-4-1 (2 штамма), 15-2-11-3-3-38-3 (2 штамма) и 17-5-12-3-14-4-7 (1 штамм). Штаммы E. faecium характеризовались 12 сиквенс-типами, а большинство из них относились к сиквенс-типам ST18 (4 из 24; 16,7%), ST17 (3 из 24; 12,5%), ST78 (3 из 24; 12,5%) и ST192 (3 из 24; 12,5%) (рис. 2В).
Методом spa-типирования установлено разнообразие штаммов S. aureus (:media_2Г). Для штаммов коллекции было характерно 18 spa-типов, среди которых доминировали spa-типы t008 (20 из 50; 40%) и t308 (6 из 50; 12%).

Созданную коллекцию охарактеризованных штаммов

ESKAPE-патогенов использовали для оценки эффективности 14 препаратов бактериофагов, включенных в исследование (см. таблица рис. 3). Наиболее эффективным препаратом против K. pneumoniae был «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» серии У1 (29 из 33; 87,9%) (рис. 3А). В отношении штаммов P. aeruginosa эффективность препаратов варьировала от 76,9 до 92,5% (рис. 3Б). Эффективность препарата «Бактериофаг стафилококковый» против штаммов S. aureus составила 43 из 50 (86%) штаммов (рис. 3В). Единственный доступный препарат «Интести-бактериофаг» П86, действующий против E. faecium, показал эффективность на одном из 24 (4,2%) штаммов.
Для сравнения эффективности коммерческих препаратов с эффективностью отдельных бактериофагов были выделены моноизоляты бактериофагов из природных источников (vB_Kp_M_Seu621 и vB_SauP-436-3w), активные в отношении штаммов видов K. pneumoniae и S. aureus соответственно. Их титр составил 10¹² БОЕ/мл (для vB_Kp_M_Seu621) и 1011 БОЕ/мл (для vB_SauP-436-3w).
Эффективность моноизолятов vB_Kp_M_Seu621 и vB_ SauP-436-3w, установленная на штаммах коллекции, составила 5,9 и 60% соответственно (см. рис. 3А и рис. 3В).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По результатам исследования эффективность поливидовых препаратов вирулентных бактериофагов по отношению к виду K. pneumoniae варьировала в широком диапазоне от 42,4 до 87,9%, для монопрепаратов этот диапазон составил 33,3–78,1% (см. :media_3А). Последнее показывает неоднородность состава препаратов и говорит о необходимости обновления и периодического тестирования препаратов против коллекций актуальных бактериальных штаммов. Эффективность бактериофага vB_Kp_M_Seu621 (5,9%), выделенного из природного источника, была значительно ниже, чем эффективность коммерческих препаратов бактериофагов, что может быть связано с разнообразием видов капсулы у K. pneumoniae. Капсула может служить рецептором для бактериофагов и определять эффективность взаимодействия бактериофага с хозяином [17].

В целом нужно отметить, что практически все штаммы K. pneumoniae (32 из 33; 97,9%) были чувствительны к какому-либо тестируемому препарату бактериофагов. При этом не было достоверных различий в эффективности лизиса МЛУ-штаммов и штаммов, чувствительных к действию антибактериальных препаратов. Наибольшее количество МЛУ-штаммов относилось к сиквенс-типу ST395. Штаммы, входящие в этот сиквенс-тип, наиболее распространены среди внутрибольничных и ассоциированы с распространением гена blaOXA-48, ответственного за устойчивость к β-лактамным антибиотикам [18]. Для МЛУ-штаммов этого сиквенс-типа показана высокая эффективность препарата «Пиобактериофаг поливалентный очищенный» серии У1 (9 из 11; 81,8%). Данный препарат вызывал лизис и остальных МЛУ-штаммов K. pneumoniae, относящихся к сиквенс-типам ST15, ST23, ST268.

Наибольшую эффективность препараты вирулентных бактериофагов показали в отношении штаммов P. aeruginosa. Для поливидовых препаратов эффективность составила 76,2–90%, а для моновидового препарата — 87,5% (см. рис. 3Б). Полученные результаты коррелируют с опубликованными данными. Согласно исследованию турецких коллег, проведенному на небольшой выборке штаммов P. aeruginosa (10 штаммов), эффективность препаратов «Пиобактериофаг комплексный» и «Интести-бактериофаг» составила 90 и 80% соответственно [19].

Как и в случае со штаммами K. pneumoniae, тестируемые препараты вызывали лизис практически всех штаммов P. aeruginosa коллекции (39 из 40; 97,5%). Что касается МЛУ-штаммов, относящихся к сиквенс-типам ST235, ST357 и ST654, то их лизис вызывало большинство тестируемых препаратов.

В отношении штаммов S. aureus моновидовые препараты вирулентных бактериофагов показали эффективность 86% для обеих серий препарата «Бактериофаг стафилококковый» (см. :media_3В). Высокая эффективность препарата продемонстрирована в работах и других исследователей. К примеру, эффективность бактериофага vB_SauM-fRuSau02, выделенного из данного препарата, была оценена на 135 штаммах стафилококков, в том числе 30 штаммах коагулазоотрицательных видов [20]. Надо отметить, что штаммы S. aureus отличались своим происхождением: 51 штамм был получен от людей, а 54 штамма выделены от свиней. Для S. aureus, выделенных от людей, эффективность бактериофага vB_SauM-fRuSau02 была крайне высока (96%). В свою очередь для штаммов коагулазоотрицательных видов и штаммов S. aureus, выделенных от животных, эффективность была ниже и составила 50 и 33% соответственно [20]. Кроме того, проведена оценка эффективности другого коммерческого препарата, активного против S. aureus — «Stafal phage» (Bohemia Pharmaceuticals; Чешская республика).
Бактериофаги, выделенные из этого препарата, были активны против 83% MRSA и 99% MSSA (от англ. methicillin susceptible Staphylococcus aureus) [21].

По данным нашего исследования, все MRSA-штаммы (а также МЛУ-штаммы) были чувствительны к препарату «Бактериофаг стафилококковый» серии Н33. К серии П332 этого же препарата был устойчив один MRSA-штамм, который также относился к МЛУ-штаммам. Данный штамм представлял spa-тип t127.

Эффективность моноизолята бактериофага vB_SauP-436-3w на штаммах коллекции (30 из 50; 60%) была ниже эффективности коммерческого препарата «Бактериофаг стафилококковый» (43 из 50; 86%), однако значительно выше, чем аналогичная величина для бактериофага vB_Kp_M_Seu621, активного против K. pneumoniae. Данный факт связан с тем, что в качестве рецепторов для бактериофагов стафилококков выступают тейхоевые кислоты бактериальных клеток [22], вариабельность которых значительно ниже, чем вариабельность капсул грамотрицательных бактерий.

Крайне низкая эффективность была выявлена для коммерческих препаратов, активных в отношении E. faecium (1 из 24; 4,2%). Чувствительный к действию препарата бактериофагов штамм относился к ST-17. Надо отметить, что бактериофаги, активные против этого вида, входили в состав препаратов с широким спектром действия. Моновидовых препаратов вирулентных бактериофагов для E. faecium не представлено на российском рынке.

Для клинической медицины интересны данные о наличии корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и их устойчивостью к антибактериальным препаратам, а также корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и принадлежностью бактерий к определенному клональному комплексу. Поиск таких корреляций был осуществлен в рамках данной работы. Было установлено, что препараты бактериофагов вызывают лизис штаммов как чувствительных к антибактериальным препаратам, так и устойчивых, что является ключевым моментом в применении бактериофагов в медицине в качестве альтернативы антимикробным веществам. Корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и их устойчивостью к антибактериальным препаратам обнаружено не было (p > 0,05). Что касается корреляции между устойчивостью штаммов к бактериофагам и принадлежностью бактерий к определенному клональному комплексу, то штаммы одного МЛСТ сиквенс-типа могут быть как чувствительными, так и устойчивыми к воздействию бактериофага. Это справедливо для всех исследуемых бактериальных видов. Таким образом, нет четкой корреляции между типом взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и ее МЛСТ сиквенс-типом (р > 0,05).

ВЫВОДЫ

Результаты данного исследования показывают, что штаммы собранной коллекции относятся к различным генетическим группам и обладают повышенной устойчивостью к антибактериальным препаратам, что делает их пригодными для оценки эффективности коммерческих терапевтических препаратов. Существующие на рынке препараты бактериофагов обладают высокой эффективностью против таких представителей ESKAPE-патогенов, как P. aeruginosa и S. aureus. Однако не все испытываемые препараты одинаково эффективны против штаммов K. pneumoniae. Следует также подчеркнуть, что для терапевтических целей предпочтительно использование коктейлей бактериофагов, особенно при терапии инфекционных процессов, вызванных грамотрицательными микроорганизмами, в частности K. pneumoniae.