Совершенствование методов реаниматологии и интенсивной терапии привело к увеличению числа пациентов, выживающих после тяжелого повреждения мозга. В связи с этим появилось большое число тяжело инвалидизированных больных с различными формами хронических нарушений сознания (ХНС), к которым относят вегетативное состояние, или синдром ареактивного бодрствования (ВС/САБ), состояние минимального сознания (СМС) и состояние выхода из СМС. Как известно, для ВС характерно спонтанное открывание глаз без признаков осознания себя и окружающей действительности. СМС отличает хоть и ограниченное, но четко определяемое наличие признаков сознания [1–4]. Пациенты с ХНС ставят перед медициной и обществом множество трудных задач, таких как разработка подходов к социальной адаптации пациентов и поиск методов реабилитации с доказанной эффективностью, что создает широкое поле для исследований в клинической и фундаментальной нейронауке.

В настоящее время большая часть исследований в области ХНС направлена на изучение нейрофизиологических и нейровизуализационных особенностей нарушенного сознания, а также применение различных подходов к восстановлению сознания, среди которых наибольшее внимание привлекают методы неинвазивной нейромодуляции, такие как транскраниальная магнитная стимуляция (ТМС) и транскраниальная стимуляция постоянным током (tDCS) [5]. При этом изучение биохимических изменений нервной ткани отходит на второй план. На сегодняшний день известно большое число нейротрофических факторов, которые участвуют в восстановлении центральной нервной системы (ЦНС) и могут служить маркерами нейропластичности.

В контексте ХНС и восстановления сознания наибольший интерес представляет фактор, выделенный из головного мозга — BDNF (brain-derived neurotrophic factor). Он известен как один из самых активных нейропротективных факторов и участвует в восстановлении нейронов как в остром периоде повреждения ткани мозга, так и при хронических патологических состояниях [6]. Среди других нейротрофических белков, участвующих в процессах нейропластичности, рассматривают нейротрофин-3 (NT3), нейротрофический фактор, выделенный из глиальных клеток (glial cell derived neurotrophic factor, GDNF), фактор роста, выделенный из тромбоцитов (platelet derived growth factor, PDGF), и фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF). Как правило, изучение нейтротрофических факторов обусловлено поиском возможных способов лечения нейродегенеративных заболеваний [6], но известны и попытки применения их после травматических повреждений нервной ткани [7]. NT3 в основном известен как фактор, стимулирующий процессы нейрогенеза у плода, у взрослых людей он участвует в процессах образования нейронов из стволовых клеток и их регенерации [8]. GDNF повышает выживаемость дофаминергических нейронов, а также мотонейронов, в связи с чем его тоже считают фактором, способствующим восстановлению нервной ткани [9]. PDGF является фактором роста тромбоцитов, поэтому широко известен благодаря своему влиянию на ангиогенез и мезенхимальные стволовые клетки. Кроме этого, PDGF стимулирует активность глиальных клеток, в частности, олигодендроцитов, что влияет на функционирование нейронов и их восстановление [10]. NGF стимулирует рост и восстановление нейронов [6]. Другим потенциально интересным белком может стать маркер повреждения нервной ткани — нейронспецифичная енолаза (NSE). NSE традиционно исследуют в контексте острых ситуаций (острой черепно-мозговой травмы, остановки сердца), и на сегодняшний день показана прогностическая точность изменений уровня NSE в остром периоде повреждения головного мозга как для дальнейшего восстановления сознания, так и при смерти мозга [11, 12].

На сегодняшний день исследований уровней нейротрофических факторов у пациентов с ХНС крайне мало, неизвестно потенциальное влияние этих факторов на восстановление сознания. Как уже упоминалось выше, одним из важных направлений реабилитации таких пациентов является неинвазивная стимуляция головного мозга, в частности ТМС. В ряде исследований показаны изменения уровней BDNF, NT3, GDNF и PDGF в плазме пациентов после проведения ТМС, что может быть интересным в плане изучения процессов восстановления поврежденной нервной ткани [13–15].

В целом, на сегодняшний день прогностическая ценность биохимических маркеров при ХНС остается недостаточно изученной, так же как и их корреляции с процессами восстановления. Целью данной работы было изучить уровни нейротрофических факторов в крови и ликворе пациентов с ХНС и динамику их изменения на фоне применения курса ритмической ТМС (рТМС).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Критерии включения пациентов в исследование: возраст старше 18 лет; стабильная клиническая картина ХНС (вегетативное состояние или состояние минимального сознания); в сроках не менее трех месяцев при нетравматическом поражении головного мозга (постгипоксической, последствий инфекций ЦНС, последствий ОНМК и др.) или не менее 12 месяцев после черепно-мозговой травмы (ЧМТ); стабильное соматическое состояние; отсутствие инфекционных осложнений, недостаточности функций органов и систем, противопоказаний к проведению рТМС. Для обеспечения безопасности проведения рТМС у пациентов с органическим повреждением ЦНС проводился скрининг ЭЭГ [16]. Критерий исключения: обнаружение эпилептиформной активности при ЭЭГ.

При поступлении пациента проводили осмотр с применением валидированной на русский язык шкалы Coma Recovery Scale — Revised (CRS-R) [17], пункцию вены для получения крови и люмбальную пункцию по стандартному протоколу для получения ликвора, после чего выполняли курс высокочастотной рТМС левой ангулярной извилины [18]. Пациенты получали стандартные реабилитационные процедуры, в том числе занятия лечебной гимнастикой, массаж и вертикализацию. После проведения курса рТМС пациентов снова оценивали по шкале CRS-R и повторно производили сбор образцов сыворотки крови и ликвора в течение суток после последней сессии рТМС.

После сбора образцов биоматериалов кровь центрифугировали для получения сыворотки, далее сыворотку и ликвор замораживали при — 71 °С. Исследовали уровни BDNF, NSE, NGF, PDGF, GDNF, NT3. Определение проводили твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) сэндвич-типа. Использовали наборы реагентов R&D Systems (США, Китай), «Вектор-Бест» (Россия). При всех исследованиях пользовались калибраторами фирм — производителей реагентов. Определение проводили в дублях на плашечном ридере VICTOR 2 (Perken Elmer; США) с использованием лиофилизированных контрольных сывороток/плазм с низким и высоким содержанием исследуемых параметров.

В контрольную группу вошли здоровые добровольцы, у которых брали образцы сыворотки крови.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием SPSS Statistics v23. Межгрупповое сравнение уровней биомаркеров проводили с помощью U-критерия Манна–Уитни, при сравнении значимости изменений после курса рТМС — с помощью парного W-критерия Уилкоксона (гипотезу о различиях между группами принимали при р < 0,05). Количественные данные представлены в виде медианы и квартилей (Me [LQ, UQ]).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 26 пациентов и 21 здоровый доброволец. Демографические характеристики и структура диагнозов включенных в исследование пациентов представлены в табл. 1. Соотношение здоровых добровольцев по полу составило (М/Ж) — 8/13, средний возраст составил 30 [27; 36] лет. При сравнении с выборкой пациентов статистически значимых различий по полу и возрасту выявлено не было.

Полученные результаты анализов крови и ликвора представлены в табл. 2 и табл. 3. Согласно результатам, при сравнении общих исходных данных по уровням исследованных биомаркеров в крови у пациентов и здоровых добровольцев оказалось, что уровни BDNF, NSE, PDGF, GDNF, NT3 статистически значимо выше у пациентов с ХНС, нежели у здоровых добровольцев, а уровни NGF не различаются.

При сравнении уровней биомаркеров в группах оказалось, что концентрации BDNF, NSE, NGF, PDGF, GDNF, NT3 в сыворотке крови статистически значимо не различались ни при сравнении между группами ВС и СМС, ни при сравнении групп в зависимости от этиологии.

При анализе уровней биомаркеров в ликворе оказалось, что у пациентов с последствиями ЧМТ уровень BDNF статистически значимо выше, чем в группе с нетравматической этиологией ХНС. Уровни других исследованных маркеров в ликворе не различались между группами.

Далее нами был проведен анализ уровней биомаркеров в крови и ликворе до и после курса рТМС. Из набранной группы пациентов удалось получить образцы до и после рТМС только у 21 человека. Причиной был отзыв информированного согласия родственников, отказ от проведения повторной люмбальной пункции либо невозможность завершить полный курс рТМС. Среди пациентов было диагностировано ВС у 11, СМС — у 10 человек. В восьми случаях причиной ХНС была ЧМТ, нетравматическая природа ХНС отмечена в 13 случаях. При анализе однородности полученных выборок различия между оценкой по CRS-R до курса ТМС в группах по форме ХНС (ВС и СМС) и по этиологии обнаружено не было. Пациенты в группе посттравматических ХНС оказались статистически значимо более молодыми. По остальным показателям группы значимо друг от друга не отличались.

При анализе динамики уровней биомаркеров в сыворотке крови и ликворе после применения курса ТМС не было обнаружено статистически значимых изменений в общей выборке и при сравнении отдельно групп ВС и СМС, травматических и нетравматических ХНС. Но при этом у пациентов после ЧМТ было выявлено статистически значимое повышение BDNF в ликворе после проведения рТМС (рисунок).

После курса рТМС в группе пациентов с СМС было отмечено клиническое улучшение: оценка по CRS-R увеличилась в среднем на 2,1 балла независимо от этиологии, в группе ВС улучшений не было (подробное описание клинических результатов представлено в работе [18]). При анализе уровней биомаркеров до курса ТМС и сравнения их изменения с изменением оценки по CRS-R значимых корреляций выявлено не было.

Таким образом, показано, что у пациентов с ХНС в результате ЧМТ концентрация BDNF в ликворе значимо выше, нежели при ХНС нетравматической этиологии, и она повышается после курса рТМС в данной группе. Концентрации других исследованных биомаркеров в ликворе и сыворотке крови (NSE, NGF, PDGF, GDNF и NT3) не различались как в группах пациентов, так и после проведенного курса рТМС.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение биохимических маркеров повреждения и восстановления центральной нервной системы может способствовать более глубокому пониманию этих процессов.
В нашем исследовании были измерены уровни BDNF, NSE, NGF, PDGF, GDNF, NT3. Выявлено, что у пациентов с посттравматическим ХНС концентрация BDNF в ликворе значимо выше, нежели при ХНС нетравматической этиологии, и она повышается после курса рТМС в данной группе. При сравнении концентрации факторов в крови пациентов и здоровых добровольцев оказалось, что все факторы, кроме NGF, были статистически значимо выше в группе пациентов, что говорит о длительно существующем повреждении нервной ткани и протекающих восстановительных процессах.
В данном контексте нужно понимать, что, вероятно, на синтез и уровень нейротрофических белков у пациентов с тяжелым повреждением ЦНС влияют и непосредственная причина заболевания, его длительность и возраст пациентов, поэтому для такой гетерогенной группы, какую представляют собой пациенты с ХНС, достаточно трудно получить какие-то однородные показатели. Тем не менее можно предполагать, что тотальное повреждение головного мозга и механизмы восстановления нервной ткани у всех пациентов с ХНС будут схожими.

Известно, что нейротрофины в нервной системе участвуют в процессах выживания нейронов и их восстановления [6], поэтому у пациентов с грубым повреждением нервной ткани выявляется их повышение, которое связывают с повреждением гематоэнцефалического барьера и которое может свидетельствовать об их нейропротективной роли [19–21]. При анализе пациентов в группах статистически значимые различия обнаружены только для концентрации BDNF в ликворе. Для остальных исследованных факторов не было показано значимых различий как между ВС и СМС, пациентами с травматической и нетравматической этиологией заболевания, так и до и после курса рТМС.

Что касается BDNF, то в литературе широко обсуждают его роль как нейропротективного фактора, способствующего восстановлению нервной ткани. Так, идет активное изучение его роли в восстановлении поврежденного спинного мозга, описано повышение его уровня после травматического повреждения [22, 23]. В экспериментах на крысах были сделаны попытки восстановления спинного мозга путем введения BDNF в место травмы [7]. Описано также повышение BDNF, пропорциональное тяжести пареза после инсульта [21]; в другом исследовании описано его увеличение после ЧМТ средней степени тяжести, пропорциональное неврологическому дефициту [19]. Интересные данные опубликованы о пациентах в критическом состоянии, не имеющих повреждений головного мозга: описано повышение BDNF, которое не коррелировало с другими нейротрофинами, как и в нашем случае [24]. Авторами было сделано заключение о связи повышения данного маркера с летальностью пациентов. В другом исследовании пациентов после ЧМТ был сделан противоположный вывод — авторы не получили никакой связи между тяжестью травмы и уровнем BDNF [25].

Таким образом, данные литературы содержат противоречивые сведения о роли BDNF и изменении его уровня при разных заболеваниях. В отличие от других исследований, мы обнаружили изменение концентрации данного фактора в ликворе, а не в сыворотке крови. Этот факт может говорить о том, что у наших пациентов в хронических сроках уже восстановился гематоэнцефалический барьер, но процессы нейропластичности продолжают идти. Интересен факт, что изменения наиболее активны у пациентов после ЧМТ. Это может быть вызвано несколькими факторами. Во-первых, восстановительный период у посттраматических пациентов проходит дольше, поэтому срок, после которого нарушение сознания считают хроническим, в случае ЧМТ составляет 12 месяцев, а в случае нетравматического ХНС — три месяца [3]. Во-вторых, известно, что прогноз для восстановления у этих пациентов также более благоприятный, нежели после гипоксии [26]. Поэтому можно предполагать, что процессы восстановления протекают более активно и продолжительно, на что косвенно указывают наши результаты. Интересно, что среди пациентов из группы ЧМТ у трех человек было диагностировано ВС, а у восьми — СМС. На первый взгляд, логично предположить, что повышение уровня BDNF и связанные с ним восстановительные процессы выявлены в группе ЧМТ именно из-за большей представленности в ней пациентов с СМС, но сравнение групп ВС/САБ и СМС в нашей популяции не показало различий в концентрации BDNF, поэтому можно сделать вывод о том, что именно этиология, а не форма ХНС, обусловливает более высокий уровень BDNF в ликворе.

Выявленные изменения уровня BDNF после курса рТМС представляют особый интерес. В литературе существуют противоречивые сведения об этом явлении: описаны повышение уровня BDNF в плазме крови после проведения рТМС [27, 28], повышение уровня мРНК BDNF в гиппокампе и париетальной коре при курсовом длительном применении рТМС [29]. Считается, что магнитное поле высокочастотной рТМС может стимулировать активность глутаматергических рецепторов и запускать синтез BDNF, а низкочастотная рТМС, наоборот, ингибирует его [30]. Тем не менее проведенный метаанализ работ, касающихся изменения уровня BDNF при применении рТМC, показал противоречивые результаты [30]. Авторы отмечают, что изменение уровня BDNF может быть также связано с этиологией заболевания и возрастом пациентов, поэтому данный биомаркер, несомненно, требует более подробных исследований.

В нашем случае было зарегистрировано повышение концентрации BDNF в ликворе после курса рТМС только у пациентов с посттравматическим ХНС. Учитывая нейропротективные свойства этого белка, данный факт можно связать с механизмами, лежащими в основе более выраженного восстановления, характерного для пациентов после ЧМТ.
В числе ограничений исследования необходимо отметить небольшой размер группы пациентов, а также отсутствие контрольной группы здоровых добровольцев для оценки концентрации нейротрофических факторов в ликворе. Для получения более точных результатов, особенно для группового сравнения, необходимо дальнейшее изучение нейротрофинов с включением большего количества пациентов.

ВЫВОДЫ

В результате изучения концентраций нейротрофических факторов у пациентов с тяжелым повреждением головного мозга было показано, что уровень BDNF, NSE, PDGF, GDNF, NT3 в сыворотке крови пациентов с ХНС статистически значимо выше, чем у здоровых добровольцев. При этом уровень BDNF в ликворе пациентов с ХНС оказался выше в группе посттравматических больных, и он статистически значимо повышался после проведения курса высокочастотной рТМС в данной группе.
В целом, полученные в проведенной работе данные подтверждают имеющиеся ранее сведения о лучшем восстановлении и более благоприятном прогнозе у пациентов после ЧМТ, чем у пациентов с другой этиологией. Полученные сведения о концентрации нейротрофических факторов в ликворе пациентов с ХНС могут косвенно указывать на то, что процессы нейропластичности даже при тяжелых повреждениях головного мозга на отдаленных сроках продолжают активно происходить. Это можно считать одним из аргументов в сторону рекомендаций проведения реабилитационных мероприятий у пациентов после тяжелой ЧМТ в течение длительного времени, даже при установлении диагноза хронического нарушения сознания, так как потенциал на улучшение у данной группы может сохраняться спустя год и более.