Иммунохимическое определение антигенов в крови широко применяют в диагностике инфекционных заболеваний. Тесты на антигенемию обычно нацелены на патогены, переносимые кровью (в частности, вирусы, вызывающие хронические вирусные инфекции, включая цитомегаловирус, вирусы гепатитов В и С и вирус иммунодефицита человека [1–3]). При респираторных заболеваниях проникновение компонентов патогена (нуклеиновых кислот или белков) в нереспираторные жидкости организма возможно, но их обнаружение обычно затруднено из-за очагового характера патогенеза и его сильной связи с местным иммунитетом слизистых. Несмотря на это, некоторые респираторные инфекции можно эффективно диагностировать и контролировать путем обнаружения соответствующих антигенов в крови, например галактоманнана при легочном аспергиллезе [4] и антигена Legionella pneumophila в моче пациентов с болезнью легионеров [5]. Кроме того, сообщалось об использовании методов иммуноанализа для лечения вирусассоциированных нозокомиальных пневмоний у пациентов отделения интенсивной терапии [4, 6]. Сывороточный нуклеокапсидный антиген (N-Ag) вируса «тяжелого острого респираторного синдрома» был описан при SARS-ассоциированной пневмонии [7, 8].

Целью работы было оценить нуклеокапсидный антиген (N-Ag) вируса SARS-CoV-2 и соответствующих антител в качестве диагностического маркера и продемонстрировать общую распространенность сероконверсии N-Ag у пациентов с пневмонией, ассоциированной с SARS-CoV-2.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили в Федеральном центре исследований мозга и нейротехнологий весной 2020 г. В разгар пандемии COVID-19 стационарные учреждения Центра были перепрофилированы для экстренной госпитализации и ведения пациентов с пневмонией, ассоциированной с SARS-CoV-2. В исследовании приняли участие 425 пациентов. Критерии включения: наличие клинических признаков пневмонии COVID-19 (лихорадка с сочетанием двух и более клинических признаков, включая температуру тела ≥ 38,5 °С, частоту дыхания ≥ 30 вдохов в минуту и/или SpO₂ ≤ 93%) [9]. Образцы сыворотки крови для исследования отбирали у каждого пациента не менее двух раз; отбор проб при поступлении и при выписке проводили одновременно с обязательной процедурой рутинных анализов крови. Стационарное лечение продолжалось 20 ± 2 дня. Критерии выписки включали снижение уровня С-реактивного белка при подсчете WBC в пределах нормы (выше 4,0 × 10⁹ л) и, в частности, наличие четкой тенденции к регрессу характерных признаков, выявленных компьютерной томографией: отсутствие новых помутнений типа «матового стекла», уменьшение выраженности соответствующих изменений в легочной ткани и/или уменьшение объема или степени консолидации помутнений типа «матового стекла» (не более трех, каждое в пределах 3 см по максимальному размеру) [10]. Качественный ОТ-ПЦР-тест для обнаружения РНК SARS-CoV-2 в мазках из носоглотки осуществляли при поступлении с использованием SARS-CoV-2/SARS-CoV Multiplex Real-Time PCR Detection Kit согласно протоколу производителя («ДНК-Технология»; Россия); аналитическая чувствительность прибора — 10 экземпляров на усилительную пробку, диагностическая чувствительность — 100% (95% CI: 95,6–100%), диагностическая специфичность — 100% (95% CI: 96,7–100%).

Кодирующая последовательность нуклеокапсидного антигена SARS-Cov-2 (N-Ag)

Кодирующую последовательность нуклеокапсидного антигена SARS-Cov-2 (N-Ag) (номер присоединения NCBI 045512.2) клонировали NdeI/XhoI в вектор pET-30b(+) Novagen (EMD Millipore, США); плазмиду расширяли в E. coli Top10 и трансформировали в E. coli Rosetta (DE3) для экспрессии N-Ag.

Условия были оптимизированы для ферментации биореактора при температуре 37 °С в 3000 мл богатой среды (дрожжевой экстракт, бактоп-пептон, глюкоза и микроэлементы). После 12-часовой инкубации культуру индуцировали 2,5 мМ имидазолом в течение 4 ч. Полученную биомассу ресуспендировали в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) в соотношении 1 : 3 (масса/объем) и разрушали с помощью гомогенизатора APV-2000 (Spx Flow; США) при 1200 бар. Раствор осветляли центрифугированием при 12 000 g. Нерастворимую фракцию (тельца включения), содержащую целевой белок, последовательно промывали PBS, 2%-м Тритоном в PBS и свежей порцией PBS для удаления остаточного детергента. Белок растворяли в мочевине (8 М) с NaCl (250 мМ) и фосфатом (50 мМ), рН 10,0. Раствор инкубировали при температуре +4 °С в течение ночи и центрифугировали при 15 000 g; собранный супернатант фильтровали и добавляли 20 мМ имидазола для предотвращения неспецифичного связывания примесей. Полигистидин-меченый белок N-Ag очищали методом иммобилизованной аффинной хроматографии металлов с использованием никелевой колонки High Density Nickel #6BCL-QHNi (ABT; Испания), уравновешенной мочевинным буфером. Белок элюировали 250 мМ имидазольным буфером и стерилизовали фильтрованием через фильтры диаметром 0,45 мкм.

Сывороточные IgG-антитела к нуклеокапсидному антигену (N-IgG)

Сывороточные IgG-антитела к нуклеокапсидному антигену (N-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого рекомбинантный полноразмерный нуклеокапсидный антиген SARS-CoV-2, полученный в E. coli (XEMA; Россия), был нанесен на поверхность полистирольных микроэлементов. Сыворотки, предварительно разведенные в 100 раз в ИФАбуфере (0,1%-й Твин-20 и 1%-й гидролизованный казеин в 0,1 М PBS), помещали в лунки планшета на 30 мин при 37 °C. После трех промывок 0,1%-м Твин-20 в 0,9%-м хлориде натрия лунки подвергали воздействию конъюгата мышиных моноклональных антител XG78 против IgG человека (γ-цепь) с пероксидазой хрена (XEMA; Россия) в течение 30 мин. После пяти промывок 0,1%-м Твин-20 в 0,9%-м хлориде натрия связанный фермент выявляли добавлением субстрат-хромогенной смеси (субстрат TMБ, XEMA; Россия). Развитие цвета останавливали 5%-й серной кислотой и измеряли оптическую плотность (ОП) при 450 нм в планшетном ИФА-анализаторе Multiskan MC (Thermo Labsystems; Финляндия). Внутренний контроль (стабилизированная человеческая сыворотка, содержащая специфичные IgG-антитела) был включен во все планшеты с целью расчета порога положительности ОП для каждого запуска индивидуально. Результаты выражены в виде индексов позитивности (рассчитываются как ОП искомого образца к ОП внутреннего контроля).

Сывороточные IgM-антитела против нуклеокапсидного антигена (N-IgM)

Сывороточные IgM-антитела против нуклеокапсидного антигена (N-IgM) обнаруживали методом обратного твердофазного ИФА. Мышиное моноклональное антитело против μ-цепи IgM человека (клон X616, XEMA; Россия) адсорбировали на поверхности полистирольных микроэлементов. Разведения сывороток (приготовленных таким же образом, как и для анализа IgG) помещали в лунки планшета на 30 мин при 37 °С. После трех промывок 0,1%-м Твин-20 в 0,9%-м хлориде натрия рабочее разведение рекомбинантного полноразмерного нуклеокапсидного антигена SARS-CoV-2, конъюгированного с пероксидазой хрена в ИФА-буфере, помещали в лунки на 30 мин при 37 °С. После пяти промывок 0,1%-м Твин-20 в 0,9%-м хлориде натрия связанный меченый антиген был обнаружен субстратом ТМБ и считыванием ОП. Расчет индекса позитивности (аналогично с анализом IgG) проводили с использованием внутреннего контроля IgM+.

Определение сывороточного N-антигена (N-Ag)

Определение сывороточного N-антигена (N-Ag) проводили двухфазным твердофазным сэндвич-методом с использованием моноклональных антител (мкАт), любезно предоставленных компанией HyTest Ltd. (Турку; Финляндия). На поверхность микропланшет наносили мкАт NP1510. Образцы сыворотки крови или калибраторы (растворы нуклеокапсидного антигена в донорской сыворотке в диапазоне от 20 до 2000 пг/мл) инкубировали с меченым пероксидазой мкАт в рабочей концентрации (клон NP1517) в ИФА-буфере с добавлением гетерофильного реагента для элиминации иммуноглобулинов (10 мкг/мл, HIER-E-010, Фапон Biotech; Китай) в течение 2 ч при 37 °С при непрерывном перемешивании в режиме 600 об. в PST-60HL-4 шейкере-инкубаторе (Biosan; Латвия). Детекцию проводили с использованием субстрата TMБ (XEMA; Россия) и считывания OП. Концентрации N-Ag определяли методом калибровочной кривой с использованием программы GraphPad (Visual Data Tools, Inc.; США). Концентрации N-Ag, превышающие верхний предел калибровочной кривой (2000 пг/мл), в расчетах и графическом представлении были показаны как 2222 пг/ мл. Образцам с показаниями ОП, соответствующими значениям концентрации ниже 20 пг/мл, не имеющим разрешения от нулевого калибратора, в представленных данных условно присваивали значения 15 пг/мл.

Статистическая обработка

Результаты обрабатывали в GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc.; США) и Excel 2016 (Microsoft; США).

Референтные диапазоны определяли путем анализа образцов сыворотки крови, взятых у здоровых доноров (n = 250) до декабря 2019 г. В обоих анализах пороговые значения (cutoff) были установлены для достижения полной специфичности (ни одного из доноров не считали положительным).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммуноферментное определение сывороточного N-Ag в сочетании с соответствующими антителами подтвердило COVID-19 у 280 пациентов (66%) исследуемой когорты. ОТ-ПЦР-анализ мазков из носоглотки подтвердил COVID-19 у 76% пациентов; перехват составляет 63% и соответствует конкордации 79%.

Несколько пациентов (n = 21; 5%) были идентифицированы как отрицательные по SARS-CoV-2 с помощью как ОТ-ПЦР-тестов, так и серодиагностики и, скорее всего, представляли собой случаи пневмоний, не ассоциированных с SARS-CoV-2. Небольшое число таких пациентов объясняется тем, что исследование проводили на пике пандемии.

Согласно полученным данным, антигенемия N-Ag характерна для большинства пациентов с тяжелым течением COVID-19 (63%).

Динамика уровня N-Ag в сыворотке крови в зависимости от фазы заболевания представлена на рис. 1. Во время выписки у большинства пациентов, имевших положительный уровень N-Ag при поступлении (104 из 116; 90%), уровень N-Ag в сыворотке крови стал ниже нижней границы калибровочной кривой (< 20 пг/мл; 104 из 116 пациентов, 90%). Однако некоторые пациенты имели явно положительный уровень N-Ag даже при выписке.

К моменту выписки сероконверсия была выявлена у большинства пациентов, поступивших с положительным уровнем N-Аg (108 из 116; 93%), хотя степень сероконверсии значительно варьировала.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для определения паттернов сероконверсии мы построили график, демонстрирующий уровни N-Ag в сыворотке крови и двух изотипов антител для отдельных случаев, разделив их на две подгруппы по Aт-серопозитивности при поступлении (рис. 2А и рис. 3А против рис. 2Б и рис. 3Б). Полученные результаты указывают на реципрокные паттерны для N-Ag и соответствующих антител, что характерно для классической сероконверсии. У пациентов, Ат-серонегативных при поступлении (предположительно находящихся на более ранней стадии заболевания), были выявлены более отчетливые паттерны классической сероконверсии. Паттерны IgG-антител были более выражены, чем паттерны IgM-антител в обеих группах.

Совместное обнаружение N-Ag и анти-N-Ag антител в 92 (18%) из 503 образцов сыворотки крови показывает, что эпитоп, распознанный иммуноферментной парой, используемой для определения антигена, по крайней мере, не полностью перекрывается (маскируется) ответом человеческого антитела.

В подгруппе из 20 пациентов мы имели возможность оценить сероконверсию в течение более короткого периода в несколько дней. Согласно результатам, в большинстве случаев переход из состояния Ag+Aт– в состояние Ag–Aт+ происходил в течение 3–5 дней после экстренной госпитализации (рис. 4).

Согласно результатам исследования, госпитализация пациентов с пневмонией, ассоциированной с SARSCoV-2, в разгар пандемии чаще всего происходила до начала сероконверсии (т. е. на фоне обнаруживаемых концентраций N-Ag в сыворотке). У большинства пациентов антиген преобладал на момент поступления и «замещался» соответствующими антителами к моменту выписки. Тем не менее в некоторых случаях к моменту экстренной госпитализации уровень антител к N-Ag в крови пациента уже был высоким, что, вероятно, отражало либо отсроченную госпитализацию, либо индивидуальную вариабельность патогенеза COVID-19.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой целесообразности серодиагностики SARS-CoV-2 у экстренных больных (по аналогии с «экспресстестами» Capillus HIV-1/HIV-2®, Determine HIV-1/2® и др., предлагаемыми в настоящее время в качестве золотого стандарта диагностики ВИЧ вместо более дорогого и трудоемкого вестерн-блот анализа [11]). Аналогичные выводы были сделаны при исследовании небольших групп пациентов с подтвержденным SARS-CoV-2 c помощью различных методов иммунохимического анализа [12, 13].

Следует отметить, что ложноположительные результаты серодиагностики SARS-CoV-2 могут появляться у пациентов с высоким уровнем ревматоидного фактора или антител HAMA, что подчеркивает значимость персонифицированной комплексной диагностики для пациентов с тяжелым течением COVID-19.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты свидетельствуют о высокой актуальности проведения комбинированных тестов на определение N-антигена SARS-CoV-2 и антител к данному вирусу применительно к экстренным больным инфекционной пневмонией при поступлении, так как: 1) чувствительность и специфичность теста на N-Ag сопоставима с таковыми у ОТ-ПЦР-анализа мазков из носоглотки, а использование иммунохимических тестов в сочетании с ПЦР-тестами на SARS-CoV-2 обеспечивает значительное повышение общей чувствительности; 2) обработка образцов крови более безопасна для персонала из-за незначительного присутствия инфекционных частиц SARS-CoV-2 в крови, в отличие от мазков из носоглотки; 3) иммунохимические тесты, как правило, быстрее в исполнении, чем ОТ-ПЦР-тесты (при учете полного цикла обработки биоматериала и пробоподготовки), что ускоряет определение статуса SARS-CoV-2 для оперативного принятия решения о режиме ведения и мерах изоляции; кроме того, анализы сыворотки крови легче автоматизировать; 4) сбор образцов крови для иммуноферментной диагностики SARS-CoV-2 в условиях стационара не является дополнительной инвазивной процедурой, а проводится в рамках обязательного первичного обследования непосредственно при поступлении (а также заключительного обследования при выписке из стационара).