Инсомния является широко распространенным в общей популяции состоянием и сопряжена с многочисленными медицинскими и социальными последствиями [1, 2]. В настоящее время инсомнию рассматривают как психобиологическое расстройство, связанное с психологическими, нейроэндокринными, нейроиммунными, электро- и нейрофизиологическими, структурными и функциональными изменениями [3]. В современной литературе активно обсуждается участие в развитии инсомнии таких биомаркеров, как кортизол [4], мелатонин [5] и IL6 [6].

В последние годы появляется все больше данных, указывающих на тесное взаимодействие кишечной микробиоты и центральной нервной системы. Оно реализуется посредством оси «микробиота–кишечник– мозг» и выполняет роль центрального звена в перекрестных нейроиммуноэндокринных взаимодействиях [7, 8]. В ряде экспериментальных и клинических работ показана связь микробиоты кишечника со сном. Так, сообщалось, что в группе лабораторных мышей вмешательство в режим сна вызывало изменения структуры и разнообразия кишечной микробиоты [9]. Аналогичные изменения в структуре микробного сообщества наблюдали и у вахтовых рабочих [10]. Кроме того, показано, что лечение дисбиоза кишечной микробиоты способствовало увеличению продолжительности сна и повышению его эффективности [11, 12]. Однако многие аспекты взаимосвязи микробиоты кишечника с воспалительными и гормональными биомаркерами у лиц с хронической инсомнией остаются не до конца изученными. Отсутствуют сведения о взаимосвязи между представителями микробиоты кишечника и уровнем кортизола при хронической инсомнии.

В ряде исследований указывается, что инсомния индуцирует системное гипоэргическое воспаление, характеризующееся повышением уровня провоспалительных цитокинов. В данном аспекте особый интерес представляет IL6, рассматриваемый рядом авторов как значимый сомногенный фактор [13]. Показано, что у пациентов с инсомнией повышение сывороточного уровня IL6 характеризуется отрицательной взаимосвязью с субъективным качеством сна [:lit_6]. Кроме того, имеются данные о связи дисбиоза кишечника и изменениями концентрации IL6 [13, 14]. Однако сведения относительно влияния родового состава кишечной микробиоты на уровень IL6 противоречивы. Так, у лиц мужского пола, страдающих инсомнией, была описана положительная взаимосвязь численности Proteobacteria и IL6 [13]. Установлена ассоциация между численностью бактерий Faecalibacterium и Blautia и уровнем IL6 у лиц с хронической инсомнией [14]. Таким образом, проблема взаимосвязи микробиоты кишечника и хронической инсомнии остается актуальной.

Целью исследования было изучить изменения таксономического состава микробиоты кишечника и характер их взаимосвязи с кортизолом, мелатонином и IL6 у лиц с хронической инсомнией.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проведено сравнительное проспективное одномоментное исследование. Методом сплошной выборки в исследование были включены 55 лиц с ранее установленной хронической инсомнией (основная группа) (32 женщины (58,2%), 23 мужчины (41,8%); средний возраст составил 31,6 ± 7,4 лет), обратившиеся за помощью в Сомнологический центр г. Симферополя, и 50 здоровых добровольцев без инсомнии (контрольная группа, КГ) (34 женщины (68,0%), 16 мужчин (32,0%); средний возраст — 33,2 ± 6,6 лет), проходивших ежегодный профилактический медицинский осмотр на базе медицинского центра «Гемокод» г. Симферополя, соответствующих критериям включения/невключения. Группы были сопоставимы по полу (р = 0,95; χ²), возрасту (р = 0,91; χ²) и индексу массы тела (р = 0,055; χ²).

Критерии включения пациентов в исследование: наличие установленного диагноза хронической инсомнии (продолжительность инсомнии более трех месяцев); возраст 18–45 лет.

Критерии исключения: температура тела выше 36,9 °С; наличие сахарного диабета I и II типа; ожирение; инфаркт миокарда, тяжелые нарушения ритма сердца, сердечная недостаточность; гипертоническая болезнь, транзиторная ишемическая атака в анамнезе; острое нарушение мозгового кровообращения (за предшествующие шесть месяцев до начала исследования); тяжелые или декомпенсированные сопутствующие соматические заболевания, которые могут затруднять участие больного в исследовании и влиять на его результаты; синдром раздраженного кишечника; хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, печени; гематологические и онкологические заболевания; бактериальные и вирусные инфекционные заболевания, микозы; наличие нарушений стула (запоры/диарея) в предшествующий месяц до начала исследования; психические расстройства, алкоголизм или наркомания в анамнезе; прием антибиотиков, пробиотиков, пребиотиков, симбиотических или кислотоподавляющих препаратов, психотропных или других препаратов, влияющих на сон, в предшествующие три месяца до начала исследования; прием препаратов, влияющих на стул, в предшествующий месяц до начала исследования; психотерапевтическое лечение инсомнии в предшествующие 3 месяца до начала исследования; работа посменно или при смене часовых поясов в предшествующий месяц до начала исследования.

Критерии включения здоровых добровольцев: возраст 18–45 лет; отсутствие депрессивного расстройства (по шкале депрессии опросника оценки здоровья пациента «Patient Health Questionnaire» (PHQ) — PHQ-9 < 5 баллов), тревоги (по шкале тревоги опросника PHQ — GAD-7 < 5 баллов), соматоформного расстройства (по шкале соматических симптомов опросника PHQ — PHQ-15 < 5 баллов); отсутствие хронических заболеваний и аллергических реакций; отсутствие инфекционных и острых заболеваний в течение двух предыдущих месяцев перед исследованием; отсутствие нарушений стула (запоры/диарея) в предшествующий месяц до начала исследования; отсутствие работы посменно или при смене часовых поясов в предшествующий месяц до начала исследования; не принимавшие пробиотики, пребиотики, симбиотические препараты в предшествующие три месяца до начала исследования; не принимавшие препараты, влияющие на стул, в предшествующий месяц до начала исследования; отсутствие психических расстройств, алкоголизма или наркомании в анамнезе; информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения здоровых добровольцев: температура тела выше 36,9 °С; работа посменно или при смене часовых поясов в предшествующий месяц до начала исследования.

Для диагностики инсомнии использовали критерии Международной классификации расстройств сна версии 3 (2014) [15]. Качество сна оценивали с помощью Питтсбургского опросника качества сна «Pittsburgh Sleep Quality Index» (PSQI) [16]. Выраженность инсомнии определяли с помощью опросника для оценки тяжести инсомнии «Insomnia Severity Index» (ISI) [16].

Для анализа таксономического состава микробиоты кишечника брали образцы кала утром (с 8.00 до 11.00), замораживали и хранили в одноразовых пластиковых контейнерах при температуре –80 °C до проведения метагеномного анализа. Выделение тотальной ДНК проводили методом фенольной экстракции. Нуклеотидную последовательность выделенной ДНК устанавливали методом шотган-секвенирования с использованием высокопроизводительного секвенатора SOLiD5500 Wildfire (Applied Biosystems; США) [17].

Фильтрацию прочтений по качеству и их таксономическую классификацию проводили с помощью программного обеспечения QIIME версии 1.9.1 (Caporaso labs; США) [18]. Для определения таксономической принадлежности прочтений применяли подход, включающий в себя использование двух таксономических баз данных. На первом этапе осуществляли подбор референсного набора операционных таксономических единиц бактерий (ОТЕ) на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 [19]. На втором этапе с использованием алгоритма RDP определение таксономической принадлежности данных ОТЕ проводили на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb [20].

Изучение качественного и количественного составов микробиоты кишечника осуществляли на основании определения видов, родов и фил микроорганизмов. Оценку α-разнообразия сообщества путем расчета индекса Chao1, показателя числа обнаруженных таксонов (Sobs) и показателя, оценивающего реальное количество таксонов (ACE), проводили с помощью программы Mothur v.1.22.0 (http://www.mothur.org).

Уровень кортизола и IL6 в сыворотке крови изучали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), используя набор тест-системы («Вектор-Бест»; Новосибирск, Россия). Забор крови из периферической вены выполняли натощак в утренние часы (7.00–9.00) в состоянии покоя (не менее 15 мин).

Определение продукции мелатонина на основании экскреции его основного метаболита 6-сульфатоксимелатонина (6-СОМТ) в ночной порции (сбор в 6.00 ч) и дневной порции мочи (сбор в 20.00 ч) проводили с помощью твердофазного ИФА с помощью стандартного набора тест-систем Elisa (Buhlmann; Швейцария). Использовали полуавтоматический анализатор StatFax

2100 (Awareness Technology; США). Пробирки с сывороткой крови и мочой хранили в замороженном состоянии при температуре –20 °С.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft. Inc.; США). При нормальном распределении показателей определяли среднее значение и стандартное отклонение; при распределении, отличном от нормального, — медиану, 25-й и 75-й процентили. Нормальность распределения проверяли при помощи распределения Гаусса. Для качественных признаков определяли долю и абсолютное количество значений. Сравнительный анализ для нормально распределенных количественных признаков проводили c помощью параметрического t-критерия Стьюдента; при распределении, отличном от нормального, — с помощью U-критерия Манна–Уитни, для качественных признаков — с помощью критерия χ² (хи‒квадрат). Для оценки взаимосвязи признаков рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Кроме того, проводили корреляционный анализ и множественную ранговую корреляцию, достоверность корреляционных связей проверяли при помощи таблиц достоверности корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика обследованных с наличием и отсутствием инсомнии представлена в табл. 1. Длительность инсомнии у лиц основной группы варьировала от 5 месяцев до 3,5 лет (в среднем составила 1,7 лет [1,1; 2,4]). В анамнезе лечение по поводу инсомнии имело место у 21 (38,6%) обследованного основной группы. С целью лечения инсомнии 10 обследованных (47,6%) применяли седативные растительные средства, 8 (38,1%) — препараты на основе мелатонина и у 3 (14,3%) — осуществляли психотерапевтические интервенции.

При изучении таксономического состава микробиоты кишечника обнаружено, что у лиц с хронической инсомнией по сравнению с лицами без инсомнии наблюдалось статистически значимое снижение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1; p = 0,016). Индексы ACE и Sobs в группе лиц с инсомнией по сравнению с КГ также были несколько снижены, при этом статистически значимых различий не найдено (р = 0,054; р = 0,052 соответственно) (рис. 1). Статистически значимые различия между группами обследованных установлены по представленности типа Actinobacteria: у лиц с хронической инсомнией по сравнению с КГ наблюдалась более высокая численность бактерий филы (р = 0,0003).

При сравнении родового состава кишечной микробиоты в группах обследованных у лиц с хронической инсомнией по сравнению с КГ выявлено статистически значимое cнижение численности Faecalibacterium (p = 0,048), Prevotella 9 (p = 0,0002) и Lachnospira (p = 0,036) и повышение численности Blautia (p = 0,012) и Eubacterium hallii (p = 0,003) (рис. 2).

Значения IL6 и кортизола у лиц с инсомнией по сравнению с показателями КГ статистически значимо выше. Уровень мелатонина был ниже показателя в КГ, однако различия между группами не достигали статистической значимости (табл. 2).

В ходе уточнения взаимосвязи изменений микробиоты кишечника с гормональными и воспалительными биомаркерами у лиц с хронической инсомнией получены статистически значимые корреляционные связи значений IL6 с численностью бактерий Faecalibacterium (r = –0,44; p = 0,001) и Blautia (r = 0,42; p < 0,001), концентрации кортизола и численности бактерий Lachnospira (r = –0,41; p = 0,048).

В ходе корреляционного анализа выявлена также сопряженность численности бактерий Faecalibacterium, Blautia с более высокими баллами по опроснику PSQI (r = –0,47, p = 0,001; r = 0,45, p < 0,001 соответственно) и опроснику ISI (r = –0,51, p = 0,002; r = 0,48, p < 0,001 соответственно). Численность бактерий Faecalibacterium обратно коррелировала с более высокими баллами по опроснику депрессии (r = –0,44; p < 0,001) и численность бактерий Lachnospira — с более высокими баллами по опроснику тревоги (r = –0,51; p < 0,001) и опроснику ISI (r = –0,52; p < 0,001).    

Получены статистически значимые корреляционные связи значений IL6 с численностью бактерий

Faecalibacterium (r = –0,44; p = 0,001) и Blautia (r = 0,42; p < 0,001). Удалось также установить связь между численностью бактерий (Faecalibacterium, Blautia) и оценкой качества сна по опроснику PSQI (r = 0,37; p = 0,001; r = 0,54; p = 0,011 соответственно). Выраженность инсомнии по опроснику ISI имеет прямую корреляционную связь с численностью указанных выше бактерий (r = 0,67; p = 0,005; r = 0,29; p = 0,0001 соответственно). Выраженность депрессивных расстройств по опроснику PHQ-9 имеет корреляционную связь с показателями численности бактерий (Faecalibacterium, Blautia) при r = 0,19; p = 0,005; r = 0,32; p = 0,003 соответственно. Выявлена взаимосвязь уровня кортизола с численностью бактерий Lachnospira и выраженностью инсомнии по опроснику ISI (r = 0,37; p = 0,002.)

Кроме того, в ходе корреляционного анализа выявлена сопряженность численности бактерий Lachnospira с более высокими баллами по опроснику ISI (r = –0,38; p < 0,001) и опроснику GAD-7 (r = –0,47; p < 0,0001). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Перспективным направлением исследовательского поиска является изучение особенностей метаболической интеграции, реализующейся посредством оси

«микробиота–кишечник–мозг» (gut-brain axis), выполняющей роль центрального звена в перекрестных нейроиммуно-эндокринных взаимодействиях [21]. Сегодня многие мировые ученые сходятся во мнении о значимой роли изменений в микробиоте кишечника в развитии психических расстройств и нарушений физиологического гомеостаза [22, 23]. В ряде работ показана связь микробиоты кишечника со сном. Так, вмешательство в режим сна вызывало изменение в составе микробиоты кишечника [9]. Лечение дисбиоза кишечной микробиоты способствовало увеличению продолжительности сна и повышению его эффективности [11]. Вместе с тем многие аспекты взаимосвязи микробиоты кишечника и гормональных, воспалительных биомаркеров у лиц с хронической инсомнией остаются не до конца изученными.

По результатам настоящего исследования, составы микробиоты кишечника у лиц, страдающих хронической инсомнией, и у лиц без инсомнии значительно различаются: у лиц с хронической инсомнией по сравнению с лицами без инсомнии наблюдается более низкое бактериальное α-разнообразие, что подтверждается статистически более низким индексом Chao1 и согласуется с результатами ранее выполненного исследования [24]. У лиц с хронической инсомнией дисбиотические изменения кишечника характеризовались снижением численности анаэробных бактерий — представителей типа Faecalibacterium, Prevotella 9 и Lachnospira, являющихся продуцентами короткоцепочечных жирных кислот, которые, как известно, обладают противовоспалительным действием [25, 26], и повышением численности потенциальных патобионтов — бактерий Blautia и Eubacterium hallii, характеризующихся способностью к индукции дисрегуляторных изменений в иммунном ответе с участием регуляторных T-клеток (Treg) кишечника, противовоспалительного IL10 и восстанавливающего островкового белка 3γ (REGIIIγ, REG3G). Полученные результаты частично соотносятся с данными работы, в которой снижение относительной численности бактерий Lachnospirа было характерно для лиц, страдающих острой инсомнией [14]. Контрастирование полученных данных может быть обусловлено различиями в методологии включения обследованных в эксперимент. Группы значительно различались по возрасту —

31,6 ± 7,4 лет в нашем исследовании против 43,5 ± 6,9 лет в работе коллег. Кроме того, мы не включали в настоящее исследование лиц с психическими расстройствами с целью нивелирования их влияния на результаты исследования, в то время как в сравниваемой работе [14] наличие психической патологии не являлось критерием исключения.

Установленная в нашей работе сопряженность сниженного содержания бактерий Faecalibacterium и повышенного содержания Blautia с более высокими баллами по опроснику PSQI и опроснику ISI позволяет предположить, что изменения численности данных бактерий характерны для хронической инсомнии. Кроме того, возможно, что терапевтическое повышение численности Faecalibacterium и снижение численности Blautia эффективны в отношении выраженности инсомнии, однако для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных исследований с соответствующим дизайном.

Анализ гормональных и воспалительных биомаркеров показал у лиц с хронической инсомнией по сравнению с лицами без инсомнии статистически значимые различия в уровнях кортизола и IL6. У лиц с инсомнией установлены статистически значимые корреляции биомаркеров с численностью некоторых представителей микробиоты кишечника, что может свидетельствовать о наличии связи состава и численности микробиоты кишечника с нарушениями сна. Так, выявлены обратные корреляции показателей кортизола и численности бактерий Lachnospira. Полученные нами результаты противоречат данным исследования, в котором сообщалось об отсутствии значимой корреляции между кортизолом и разнообразием микробиоты кишечника при инсомнии [13]. Несогласованность полученных данных, возможно, обусловлена тем, что в нашем исследовании выборка обследованных включала лиц обоих полов, в то время как в работе коллег принимали участие только лица мужского пола [13]. Эти данные позволяют сделать предположение о существовании генедерных различий ассоциаций уровня кортизола и состава микробиоты кишечника. Данный вопрос необходимо дополнительно изучать.

Настоящее исследование не подтвердило сопряженность экскреции основного метаболита мелатонина 6-СОМТ с изменениями микробиоты кишечника у лиц с хронической инсомнией. Мы не встретили работ, посвященных изучению данного вопроса при хронической инсомнии. Вместе с тем, имеются подтверждения роли мелатонина в регуляции состава микробиоты кишечника [27]. Противоречивость данных, возможно, обусловлена тем, что в упомянутом исследовании концентрацию мелатонина изучали по уровню экскреции 6-СОМТ в моче, который в свою очередь характеризует количественную продукцию эпифизарного мелатонина [28], в то время как в ранее выполненной работе [29] авторы изучали уровень энтерального мелатонина в ЖКТ, вырабатываемого энтерохромаффинными клетками кишечника.

Хроническое воспаление может быть значимым патогенетическим звеном, связывающим микробиоту кишечника и регуляцию сна. Так, показано, что хроническая депривация сна связана с повышением концентрации IL6 в плазме крови [30]. Обнаружено, что с уровнем IL6 в плазме крови прямо коррелирует продолжительность сна [31]. Наличие дисбиоза может запускать формирование иммунологического и воспалительного ответа с ростом уровня системных провоспалительных цитокинов. Отмеченная в исследовании [14] корреляция уровня IL6 с численностью бактерий Faecalibacterium и Blautiaу у лиц с хронической инсомнией подтвердилась в нашей работе, что позволяет предположить значимую роль данных бактерий в поддержании воспалительной реакции и, как следствие, в усугублении инсомнии и ее последствий. Несмотря на то что роль бактерий Blautia в развитии воспаления доказана, данные о их взаимосвязи неоднозначны. Так, одни авторы указывают на наличие прямой корреляционной связи между численностью Blautia и воспалительной дисрегуляцией [32], другие пишут об обратной [33]. Полученные нами результаты показали, что увеличение численности бактерий Blautia способствует повышению уровня IL6 в плазме крови. При этом необходимо отметить, что ограничение анализа только определением уровня цитокина IL6 не позволяет нам охарактеризовать воспалительный статус в целом у пациентов с хронической инсомнией.  

ВЫВОДЫ

У лиц с хронической инсомнией выявлены выраженные нарушения численности и таксономического состава микробиоты кишечника. Обнаруженные статистически значимые корреляции некоторых представителей микробиоты с PSQI и гормональными, воспалительными биомаркерами свидетельствуют в пользу концепции о связи между численностью и составом микробиоты кишечника и хронической инсомнией. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения значимой роли микробиоты кишечника в патогенезе хронической инсомнии. Актуальным остается вопрос о связи изменений микробиоты кишечника и гормональными биомаркерами. Целенаправленная коррекция микробиоты кишечника может способствовать повышению эффективности терапии хронической инсомнии.