Многочисленные исследования в современной онкологии, направленные на изучение механизмов опухолевого роста и прогрессирования злокачественных новообразований, закладывают фундаментальную основу поиска мишеней для терапии [1–3]. В связи с этим идет разработка новых противоопухолевых и антиметастатических средств, в основе эффективности которых лежит воздействие на эти мишени. Однако значительное число применяемых в клинике противоопухолевых средств недостаточно эффективно и безопасно, что определяет приоритетные направления экспериментальной медицины — поиск новых лекарственных субстанций.

Молекула ДНК служит главной мишенью, на которую направлено действие многих противоопухолевых и антиметастатических препаратов разных классов и разных химических групп, реализующих свою активность с помощью разнообразных механизмов. Исследования показали, что родоначальник ряда трициклических систем на основе бензимидазола, 3H-триазоло[1,5-a]бензимидазол, весьма эффективно связывается с АТФ-сайтом фермента check point kinase 2 и тем самым ингибирует его. Поскольку эта киназа играет решающую роль в активации путей передачи сигнала, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК, ее ингибирование в опухолевых клетках должно блокировать репарацию ДНК и индуцировать апоптоз злокачественных клеток [4]. Производные бензимидазола могут проявлять противоопухолевую активность и за счет влияния на другие клеточные мишени, задействованные в процессах репарации (например, ингибируя ключевой энзим системы репарации ДНК — поли(АДФ-рибоза) полимеразу (PARP-1 и -2) и потенцируя цитотоксичность повреждающих ДНК агентов) [5]. При переходе от производных бензимидазола к соединениям ряда более простой моноциклической имидазольной системы возникает возможность противоопухолевого действия за счет блокирования возможности эффективной репликации ДНК путем электростатических взаимодействий, интеркаляции и связывания с бороздками ДНК [6].

Другой весьма важной мишенью для противоопухолевых препаратов служит белок тубулин, связывание с которым препятствует критически важным, в том числе для клеточного деления, процессам его полимеризации и деполимеризации. И здесь в роли ингибиторов тубулина могут выступать различные производные бензимидазола, затрудняющие образование микротрубочек [7]. Отдельные их представители обладают хорошими фармакокинетическими свойствами и способны преодолеть множественную лекарственную устойчивость, формирующуюся у многих клеточных линий. В частности, широкий спектр активности в качестве ингибиторов β-тубулина демонстрируют производные бензимидазола2-мочевины, которые, по данным литературы, оказывают цитотоксическое действие в отношении культур клеток человека NCI-H460, Colo205, К562, А431, HepG2, Hela, MDA-MB-435S [8].

Цитотоксический эффект производных бензимидазола в отношении клеток аденокарциномы легких человека A549 в условиях гипоксии связывают с активацией их каспаззависимого апоптоза [9]. Показано, что одно из довольно сложных по структуре соединений бензимидазольного ряда обладает ингибирующей активностью в отношении онкогенных киназ MEK1 и PI3K [10].

Целью работы было исследовать влияние дигидробромида 2-(3,4-дигидроксифенил)-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2a]бензимидазола (РУ-185) на рост и метастазирование LLC.

В эксперименте использовали 55 самцов мышей линии C57Bl/6 весом 18–20 г. Животные были получены из вивария филиала «Андреевка» (Московская область).

Для проведения исследований использовали перевивную опухоль эпидермоидной карциномы LLC, для которой характерно 100%-е спонтанное метастазирование в легкие. Штамм был получен в банке опухолевых материалов лаборатории комбинированной терапии опухолей Научноисследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина. Поддержание и подкожную перевивку опухолевого штамма осуществляли в соответствии с общепринятыми методами.

Исследуемое вещество было получено из 1-диэтиламиноэтил-2-аминобензимидазола, его кватернизацией 3,4-диметоксифенацилбромидом с последующей циклизацией образующейся четвертичной соли действием 48%-й бромистоводородной кислоты при кипячении, сопровождающейся O-деметилированием [11]. Синтез РУ-185  осуществляли в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета.

Исследуемое соединение предварительно растворяли в физиологическом растворе. Введение веществ трем группам лабораторных животных осуществляли внутрижелудочно с помощью назогастрального зонда в разовых дозах 50 мг/кг (1-я группа), 220 мг/кг (2-я группа) и 500 мг/кг (3-я группа) (что соответствовало 1/40, 1/8 и 1/4 ЛД₅₀) раз в день в течение 10 дней, через 48 ч после перевивки опухоли LLC мышам указанной линии (табл. 1). Контрольную группу составляли животные с перевитой LLC, которым внутрижелудочно вводили физиологический раствор (плацебо) в аналогичных объемах и по той же схеме.

На 26-е сутки после перевивки опухоли часть животных всех групп подвергали эвтаназии в СО₂-камере и проводили некропсию. Изучение противоопухолевой и антиметастатической активности вещества выполняли в соответствии с методическими рекомендациями [12]. Степень противоопухолевой и антиметастатической активности вещества определяли по стандартным показателям, таким как объем опухоли, увеличение продолжительности жизни (Т/С%), рассчитанное как соотношение средней продолжительности жизни животных, подвергнутых воздействию, к контрольным показателям, а также количество метастатических узлов. По полученным результатам рассчитывали индекс торможения роста опухоли (ТРО%) и индекс ингибирования метастазирования (ИИМ%) [12].

Предварительно была определена величина острой токсичности ЛД₅₀ для РУ-185 при внутрижелудочном введении, которая составила 1980,4 мг/кг, что согласно гармонизированной системе классификации опасности и маркировки химической продукции (СГС) соответствует 4-й категории опасности. В соответствии с нормативными документами [13] он может быть отнесен к умеренноопасным веществам (3-й класс опасности).

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью программы STATISTICA 12.0 (StatSoft Inc.; США). Оценку нормальности распределения признаков осуществляли с помощью критерия Шапиро– Уилка и Колмогорова–Смирнова. Достоверность различий средних величин независимых выборок оценивали с помощью параметрического критерия Стьюдента. Уровень значимости для использованных методов был установлен как p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты оценки противоопухолевой эффективности РУ-185 при внутрижелудочном введении представлены в табл. 2. Применение РУ-185 в исследуемых дозах по-разному влияло на продолжительность жизни животных в трех группах. Достоверное увеличение продолжительности жизни животных наблюдали только во 2-й группе, для которой показатель Т/С составил 162,3%. Продолжительность жизни животных в 3-й группе была выше контроля, но Т/С статистически значимо не отличался от контрольных показателей. Продолжительность жизни животных в 1-й группе, наоборот, была снижена относительно контроля.

Динамику роста первичной опухоли оценивали на 1-е, 7-е и 14-е сутки после окончания введения субстанции по объемам опухоли. Объемы первичного очага различались в группах уже в 1-е сутки после перевивки опухоли. При применении РУ-185  в средней и большой дозе (2-я и 3-я группы) объем опухоли уменьшался относительно показателя контрольной группы, о чем свидетельствовал индекс ТРО. Впрочем, значимое изменение объемов опухоли к этому сроку исследования отмечено лишь для 2-й группы. В 1-й группе было обнаружено усиление роста опухоли, ее размеры превышали контроль в 1,5 раза (р < 0,05).

Измерение объемов опухолей на 7-е и 14-е сутки от момента окончания введения препаратов показало подобную динамику роста опухоли по сравнению с первыми сутками после введения в каждой исследуемой группе. Так, размеры опухоли в 1-й группе превышали контрольные показатели, тогда как во 2-й и 3-й группах они были уменьшены по сравнению с контрольной в 3,4 и 1,3 раза (на 7-е сутки) и 2,2 и 1,3 раза (на 14-е сутки) соответственно (р < 0,05). При этом индекс ТРО указывал на значимую эффективность применения субстанции в разовой дозе 220 мг/кг, торможение роста опухоли отмечалось на сроке 14 суток после окончания лечения. Важно также, что в этой же группе у 20% животных был отмечен и регресс опухоли (табл. 2), подтвержденный данными некропсии на момент вывода животных из эксперимента.

Интересно, что исследуемая субстанция при ее внутрижелудочном применении обладает и антиметастатическим действием в отношении LLC (табл. 3).

Данный эффект выражается в снижении как частоты метастазирования, так и количества метастатических узлов в легком животных, наблюдавшемся в 1-й и во 2-й группах. Выявлено выраженное снижение частоты метастазирования и количества метастатических узлов в легком животных в 1-й и 2-й группах: число метастазов в этих группах было меньше относительно контроля в 2,6 и 3,1 раза соответственно, а ИИМ составил 68,1% и 80% соответственно. В 3-й группе животных при применении большой дозы препарата также обнаружено ингибирование метастазирования.

Таким образом, можно заключить, что РУ-185  при его внутрижелудочном применении обладает противоопухолевой активностью в отношении экспериментальной злокачественной опухоли легкого, индуцируемой клеточной линией карциномы LLC, тормозя как ее рост, так и метастазирование. При разовой дозе, равной 220 мг/кг, отмечено также увеличение средней продолжительности жизни животных, а в 20% случаев у животных к 14 суткам после начала лечения наблюдался регресс опухоли. Наиболее выраженный противоопухолевый и антиметастатический эффект исследуемого производного бензимидазола отмечен при дозе 220 мг/кг. Снижение количества метастазов в легком, а также частоты метастатического поражения, характеризуемой индексом ингибирования метастазирования, наблюдавшееся для всех исследуемых доз, свидетельствует о выраженном антиметастатическом эффекте РУ-185 в отношении легочных метастазов LLC.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранние исследования влияния РУ-185 на рост и развитие подкожно перевитой меланомы В16 при внутрижелудочном введении животным показали, что субстанция оказывает большее ингибирующее влияние на метастазирование в легких, чем на рост первичной опухоли [14, 15]. Однако в настоящем исследовании выявлено выраженное противоопухолевое действие как на первичную, так и на метастатическую опухоль экспериментальной LLC. Возможно, особенности в противоопухолевой эффективности исследуемой субстанции в отношении первичной опухоли связаны с различиями фенотипических характеристик меланомы и опухоли легкого [16, 17]. Выраженное ингибирование метастазирования этих различных типов опухолей в ткань легкого наводит на мысль о существовании общих факторов, определяющих адаптацию опухолевых клеток к метастатической нише и рост метастазов в конкретной метаболической среде, обусловливая механизм действия изученной субстанции [18]. Метастатический протеом и транскриптом опухоли динамически модулируются метаболомом. Индуцированные метаболомом сигнальные каскады могут управлять опухолевой агрессией и метастазированием посредством различных путей, участвующих на каждом этапе каскада метастазирования [19]. Однако для подтверждения предположения о возможных механизмах противоопухолевого действия изученной фармакологической субстанции необходимы дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

Фармакологическая субстанция РУ-185 при введении внутрижелудочно в разовой дозе 220 мг/кг однократно в день оказывает противоопухолевое действие, что выражается в достоверном увеличении продолжительности жизни животных, снижении скорости роста первичной опухоли, а также частоты развития и количества легочных метастазов экспериментальной эпидермоидной LLC. Антиметастатическое действие субстанции в отношении данной перевиваемой опухоли показано также в дозах 50 и 500 мг/кг. Выяснение метаболических механизмов антитуморогенного и антиметастатического эффекта изученной химической субстанции позволит выявить ее терапевтические мишени и использовать в качестве фармакологического препарата в клинической практике для лечения онкопатологии легкого.