Вспышка тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом SARS-CoV-2, началась в Ухане (Китай) в 2019 г. и быстро привела к всемирной пандемии, которая поставила системы здравоохранения стран перед необходимостью оказания интенсивной терапии огромному числу пациентов. Из-за быстрого распространения число заболеваний во всем мире увеличивается каждый день. Только в России на сегодняшний день зарегистрировано более 4 700 000 подтвержденных случаев заражения COVID-19. Беременные женщины представляют собой уязвимую группу населения, восприимчивую к инфекции COVID-19 из-за физиологических изменений иммунологических показателей и показателей кровообращения. Дети от матерей, инфицированных COVID-19, подвержены риску заражения, а также высокому риску осложнений в раннем неонатальном периоде и отдаленных последствий для здоровья. Непосредственно для COVID-19 такие последствия еще не изучены, однако исследования, выполненные для вируса гриппа, позволяют предположить их потенциальную возможность [1, 3]. До сих пор мало известно о перинатальной и неонатальной инфекции COVID-19, а текущая информация основана преимущественно на отчетах о единичных случаях. Одно из первых и самых крупных исследований касается 33 новорожденных от матерей с подтвержденным диагнозом COVID-19 [3]. Было постулировано несколько путей передачи вируса, включая послеродовую передачу (горизонтальную), транс-плацентарную передачу, а также через околоплодные воды и грудное молоко [4–12]. Первое исследование, описывающее клинические характеристики и изучающее возможность вертикальной передачи SARS-CoV-2 у девяти беременных с лабораторно подтвержденным COVID-19, продемонстрировало  отсутствие доказательств вертикальной передачи [11, 13]. Однако в последнее время в литературе появляются сообщения о единичных случаях вертикальной передачи вируса, а также о тяжелых заболеваниях в антенатальном периоде  у беременных [14, 15]. Так, продемонстрирована трансплацентарная передача вируса, подтвержденная комплексными вирусологическими тестами на плаценте, а также симптомами и клиническими проявлениями у новорожденных [16].

По фундаментальным причинам метаболом является более чувствительным и динамичным индикатором биохимического статуса клетки и организма, чем протеом или транскриптом [17]. Метаболомный анализ образцов пациентов с инфекцией COVID-19 дает возможность понять биохимические изменения, связанные с плохо изученными процессами, поскольку он показывает воздействие вируса на хозяина, а не просто присутствие инфекционного агента. Метаболомные исследования могут предоставить набор маркеров, потенциально имеющих важное значение для подтверждения инфекции SARS-CoV-2, а также для определения тяжести заболевания и возможного исхода. Недавно показано, что 204 метаболита в плазме крови пациентов с COVID-19 коррелируют с тяжестью заболевания [18]. Аминокислоты, являющиеся частью метаболома, незаменимы во всех процессах жизнедеятельности человека. Биологическая роль около трехсот аминокислот в нашем организме неоценима. Без необходимого количества аминокислот организм не может эффективно развиваться. Именно поэтому существуют оптимальные уровни аминокислот в организме, обеспечивающие сбалансированные обменные процессы. Отклонение концентрации аминокислот от референсных значений может указывать на развитие конкретного заболевания. Так, концентрации аминокислот изменяются при инфицировании вирусом песчаной мухи [19], при пневмонии, вызванной вирусом гриппа H1N1 [20], при хронической обструктивной болезни легких [21]. Ряд неонатальных патологий выявляют путем анализа аминокислот в сухой капле крови [22]. Исследования низкомолекулярных промежуточных продуктов метаболизма в биологических системах приобретают все большее значение в последние годы, поскольку позволяют лучше понять взаимодействие и регуляцию метаболических путей человека. Связанные с заболеваниями изменения метаболических профилей физиологических жидкостей человеческого организма исследуют для выяснения патофизиологии сложных заболеваний. Например, метаболомный анализ показал, что  изменение метаболизма аминокислот коррелирует с изменением гомеостаза кислорода у пациентов с COVID-19 [23]. Еще в одном исследовании аминокислотных профилей у взрослых и детей с COVID-19 выявлены изменения, которые могут быть связаны с эндотелиальной дисфункцией и нарушением регуляции Т-лимфоцитов [24]. Различные метаболические процессы могут быть охарактеризованы путем измерения концентраций аминокислот [25].

Таким образом, целью исследования было определить влияние COVID-19 на аминокислотный состав амниотической жидкости и плазмы пуповинной крови для разработки диагностической панели и влияние возможных последствий на состояние новорожденного, к которым могут привести изменения метаболизма аминокислот.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В период с марта по май 2020 г. в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова была создана «красная зона», где проходили лечение и обследование пациенты с диагнозом COVID-19, в том числе беременные женщины. Подготовлено 190 коек для лечения пациентов с COVID-19 и 60 коек акушерского профиля.

В исследование были включены 46 беременных, которые поступили и были родоразрешены в НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова. Основную группу составили 29 пациенток c подтвержденным диагнозом COVID-19; контрольную группу составили 17 соматически здоровых женщин с беременностью без осложнений. Диагноз COVID-19 был подтвержден с помощью ПЦР-теста («ДНКТехнология»; Россия). Включение в группу происходило по мере обращения. Критерии включения в I группу: наличие COVID-19, установленной по данным молекулярногенетического обследования (ПЦР); критерии включения во II группу: отсутствие COVID-19 по данным клинического обследования, результатам ПЦР-исследования. Критерии исключения: многоплодная беременность; отсутствие резус- и AB0-изоиммунизации, хромосомных аномалий, генетических мутаций и врожденных пороков развития у плода. Для анализа были собраны пуповинная плазма и амниотическая жидкость.

Образцы биологических жидкостей собирали у всех пациентов на базе 1-го инфекционного отделения НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова «красная зона» с проведением предварительной подготовки и хранения образцов. Транспортировку и последующий анализ осуществляли на территории НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова в помещениях, сертифицированных для работы с пробами 2-го класса опасности. В работе использовали стандартный набор и модифицированный протокол для приготовления и последующего анализа 31 аминокислоты в физиологических жидкостях (JASEM; Турция). Набор содержит две различных калибровочных смеси лиофилизированных аминокислот, смесь внутренних стандартов, лиофилизированную смесь для контроля качества анализа, подвижные фазы A и B, «Реагент 1» (кат. № JSM-CL-503), используемый при приготовлении образцов плазмы, а также колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) аминокислот (кат. № JSM-CL-575).

В процессе подготовки к анализу 50 мкл образца смешивали с 50 мкл раствора внутренних стандартов, перемешивали в течение 5 с, добавляли 700 мкл Реагента-1, перемешивали повторно 15 с, центрифугировали 3 мин со скоростью 3000 об./мин, после чего переносили надосадочную жидкость в хроматографическую виалу. Подготовку и хранение анализируемых образцов и вспомогательных растворов производили в соответствии с руководством JASEM.

Анализ образцов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе 1260 Infinity II (Agilent; США) с детектированием на масс-спектрометре 6460 Triple Quad (Agilent; США).

Транзитные переходы между родительскими ионами и дочерними фрагментами для анализируемых аминокислот, соответствующие им хроматографические времена удержания, концентрации внутренних стандартов, а также сведения о чувствительности и воспроизводимости анализа представлены в руководстве JASEM.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R (R Core Team, Vienna, Austria, в Rstudio; R. RStudio, Inc.; Boston).

Статистический анализ проводили с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Для описания количественных данных использовали медианы (Me) и квартили Q₁ и Q₃ в формате Me (Q₁; Q₃). Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. Если значение p было меньше 0,001, то p указывали в формате p < 0,001.

Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании исследуемых параметров были разработаны модели логистической регрессии. В качестве зависимых переменных в моделях рассматривали все возможные комбинации аминокислот. В качестве независимой переменной выступала принадлежность пациентки к группе. Из всех разработанных моделей выбирали четыре с наибольшей величиной площади под ROC-кривой (AUC). Для каждой модели были определены критерий Вальда, 95%-й доверительный интервал (ДИ), отношение шансов (ОШ) и его доверительный интервал. Качество разработанных моделей определяли путем построения ROC-кривой, определения площади под ROC-кривой, а также расчета чувствительности и специфичности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 46 женщин, из которых

29 пациенток находились в стационаре с подтвержденным COVID-19, и 17 женщин, не болевших данной вирусной инфекцией (группа контроля). Средний возраст пациентов составил 30,7 ± 4,9 года, в первой группе средний возраст пациенток 29,9 ± 5,03, в группе контроля 32,0 ± 5,03. Индекс массы тела в обеих группах значимо не отличался: в первой группе 27,85 ± 4,52, во второй 26,12 ± 3,16.

Основными клиническими симптомами были кашель (41,38%), потеря обоняния (24,14%) и гипертермия (41,38%) (табл. 1). Бессимптомное течение COVID-19 зарегистрировано в 8 (28,59%) случаях. Легкие, средние и тяжелые случаи составили 22 (75,86%), 6 (20,69%) и 1 (3,45%) случаев соответственно.

По данным компьютерной томографии (КТ) в 25% случаев характерные признаки вирусной пневмонии отсутствовали (CT-0). Высокая вероятность вирусной пневмонии с минимальным объемом пораженной легочной ткани была выявлена у 40% женщин (CT-1). Высокая вероятность вирусной пневмонии с поражением 25–50% объема легочной ткани (CT-2) отмечена у 10% женщин. Высокая вероятность вирусной пневмонии с поражением 50–75% объема легочной ткани (CT-3) была выявлена у 10% пациенток, с критическим объемом пораженной легочной ткани > 75% (CT-4) — в 15% случаев.

 группе пациенток с подтвержденным COVID-19 срок родоразрешения 38 ± 1,52 недель беременности достоверно отличался, в сравнении с группой контроля 39,42 ± 1,14 недель (p = 0,001). Вероятно, это связано с тем, что в группе COVID-19  в четырех случаях (13,8%) были преждевременные роды, однако причины досрочного родоразрешения не связаны с тяжестью вирусного заболевания COVID-19. Причинами преждевременного родоразрешения послужили в одном случае неготовность мягких родовых путей и наличие рубца на матке, в другом — нарастание тяжести преэклампсии и еще в двух случаях — преждевременное излитие околоплодных вод и начало родовой деятельности. Кесарево сечение выполнено в 13 (44,8%) случаях (ОР: 0,9 [0,5;1,6]), вакуум-экстракция проведена в связи с дистрессом плода в одном (3,5%) случае, остальные роды протекали нормально через естественные родовые пути. В группе контроля было произведено 9 (52,9 %) операций кесарева сечения, в остальных случаях роды произошли через естественные родовые пути. Причинами для операции кесарева сечения послужили наличие одного или более рубца на матке, неправильное положение плода, анатомические особенности таза и заключение смежных специалистов (врача офтальмолога, ортопеда, невролога). В группе COVID-19 средний вес при рождении составил 3332 ± 484 г, в группе контроля — 3585 ± 424 г, средняя длина новорожденных составила 52,4 ± 2,66 см и 53,1 ± 2,29 см соответственно. В обеих группах состояние новорожденных на первой минуте по шкале Апгар оценено в 8 (8; 8) баллов и на пятой минуте 9 (9; 9) баллов (табл. 2).

Случаев COVID-19 у новорожденных не зарегистрировано. Новорожденные сразу после рождения были изолированы от их матерей. При получении двух отрицательных результатов SARS-CoV-2 у матерей им разрешали грудное вскармливание. Все новорожденные были протестированы на SARS-CoV-2 сразу после рождения, а также на 3-й и 10-й дни после рождения. Все новорожденные получили отрицательные результаты анализов, которые могут свидетельствовать об отсутствии вертикальной передачи инфекции. Случаев перинатальной смерти не зарегистрировано.

На лабораторном этапе работы был применен метод целевой метаболомики с использованием набора для количественного определения 31 аминокислоты методом ВЭЖХ-МС в образцах амниотической жидкости и плазмы пуповинной крови, собранных в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика Кулакова. Настоящее исследование было проведено для описания изменений уровня аминокислот новорожденных от матерей, у которых был положительный результат теста на инфекцию COVID-19.

Амниотическая жидкость

При анализе амниотической жидкости была определена концентрация 31 аминокислоты. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить восемь аминокислот, содержание которых статистически значимо отличалось при COVID-19 (табл. 3; рис. 1): 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, аргинин, цистатионин, цистин, глутамин, гистидин, транс-4-гидроксипролин.

С учетом полученных результатов ВЭЖХ-МС-анализа интерес представляло рассмотрение возможности разработки математической модели, позволяющей отличить амниотическую жидкость пациентов группы COVID-19 от группы контроля. Для этого были построены модели логистической регрессии на базе аминокислот со статистически значимой разницей между исследуемыми группами. Для построения моделей использовали все возможные комбинации аминокислот. Для каждой из моделей был выполнен ROC-анализ и выбраны четыре модели с характерной наибольшей площадью под ROC-кривой (AUC). В табл. 4 представлены параметры полученных моделей, а на рис. 2 — соответствующие им ROC-кривые. Наибольшее значение AUC, равное 0,89, было у модели, построенной на базе аргинина, цистина, гистидина и транс-4-гидроксипролина (табл. 5). Эта модель характеризуется чувствительностью 0,84 и специфичностью 0,93. Несколько более высокие значения чувствительности и специфичности, 0,84 и 1 соответственно, были у модели, построенной на базе 1-метилгистидина, цистина, транс-4-гидроксипролина (табл. 5).

Пуповинная плазма

На следующем этапе работы был проведен анализ аминокислотного профиля пуповинной плазмы в двух группах. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить четыре аминокислоты, концентрации которых статистически значимо отличались при COVID-19 (табл. 6; рис. 3): 1-метилгистидин, бета-аланин, цистин, гистидин.

Аналогично исследованию амниотической жидкости были построены модели логистической регрессии, позволяющие отличить пуповинную плазму пациентов группы COVID-19 от группы контроля. Результаты разработки и анализа полученных моделей представлены на рис. 4 и в табл. 7, табл. 8. Во все построенные модели вошел цистин, очевидно, как аминокислота наиболее различающаяся между группами. Все модели характеризуются AUC, равным 1, а также чувствительностью и специфичностью, равными 1 (табл. 8).  

Особый интерес представляло сравнение аминокислот в амниотической жидкости и пуповинной плазме, которые статистически значимо различаются в группах контроля и COVID-19. В двух точках (амниотическая жидкость и пуповинная плазма), комплексно отображающих метаболом плода, были выявлены и статистически значимо отличались при COVID-19 три аминокислоты: 1-метилгистидин, цистин и гистидин (табл. 9).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вирусные инфекции вызывают характерные изменения в метаболизме клеток-хозяев, чтобы обеспечить эффективную репликацию вируса [19]. Более того, результирующее метаболическое воздействие и клеточное перепрограммирование варьируют между вирусами (даже в пределах одного семейства) и типом клетки-хозяина.

Полученные данные свидетельствуют о статистически значимом различии концентраций восьми аминокислот в амниотической жидкости и четырех в пуповинной плазме между пациентками с COVID-19 и группой контроля. Причем концентрации восьми аминокислот били снижены у пациенток с COVID-19. Сходные изменения концентраций аминокислот были обнаружены при исследовании плазмы крови взрослых и детей с COVID-19 [24].

Авторы этой работы искали подтверждение своей гипотезе о возможном снижении концентрации аргинина при COVID-19. Известно, что эндотелиальная дисфункция играет роль в развитии повреждения легких при COVID-19 как у взрослых, так и у детей [27, 28], а низкая биодоступность аргинина связана с развитием эндотелиальной дисфункции и дисрегуляции Т-клеток [29, 30] и вносит вклад в патофизиологию множества заболеваний [31]. Действительно, у больных COVID-19 было обнаружено ожидаемое снижение концентрации аргинина. Кроме того, были значимо снижены и концентрации цитруллина, глутамина, аланина, глицина, гистидина, пролина и нескольких других аминокислот, однако авторы статьи затрудняются объяснить механизмы такого эффекта [24]. Снижение концентрации аминокислот было выявлено и при некоторых других патологиях [19, 21–24, 32, 33].  

Особый интерес в нашем исследовании представляло сравнение уровней аминокислот в амниотической жидкости и пуповинной плазме, которые статистически значимо различаются в группах контроля и COVID-19.

Одновременно в двух точках (амниотическая жидкость и пуповинная плазма), комплексно отображающих метаболом плода, были выявлены и статистически значимо отличались при COVID-19 три аминокислоты: 1-метилгистидин, цистин и гистидин.

Одной из трех аминокислот, выявленных сразу в двух средах плода (амниотической жидкости и плазме пуповинной крови), обладающей высокой дифференцирующей значимостью, был L-цистин. Это некодируемая аминокислота, представляющая собой продукт окислительной димеризации цистеина. В ходе посттрансляционной модификации белков она играет крайне важную роль в формировании и поддержании третичной структуры белков и пептидов и, соответственно, их биологической активности. Так, например, такие гормоны, как вазопрессин, окситоцин, инсулин и соматостатин, приобретают биологическую активность после образования внутримолекулярных дисульфидных мостиков.

Двумя другими аминокислотами со статистически значимой разницей, выявленной в амниотической жидкости и плазме пуповинной крови новорожденных от матерей с COVID-19, были L-гистидин и его производное 1-метилгистидин.

L-гистидин — гетероциклическая альфа-аминокислота, одна из 20 протеиногенных аминокислот и одна из двух условно-незаменимых аминокислот (наряду с аргинином). Первоначально считалось, что незаменима она только для детей. Остаток гистидина входит в состав активных центров множества ферментов. Гистидин является предшественником в биосинтезе гистамина. Гистамин играет важную роль в развитии воспаления и некоторых аллергических реакций. Гистидин, одна из незаменимых аминокислот, способствует росту и восстановлению тканей, участвует в синтезе эритроцитов и лейкоцитов, а также в формировании миелиновых оболочек нервных клеток. Нехватка гистидина может вызвать ослабление слуха, дегенеративные заболевания, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера. 

Наши результаты показали, что вирус может вызывать выраженные изменения в метаболоме амниотической жидкости и плазме пуповинной крови, что чревато риском нарушения программирования производства белковых молекул. При этом COVID-19 может никак не проявлять себя при рождении. Изменения метаболических процессов путем нарушения необходимого соотношения аминокислот на территории плода, могут быть связаны с репликацией вируса, воспалительной реакцией хозяина и изменениями энергетического метаболизма. Вероятно, данные нарушения метаболома могут проявиться и на момент родоразрешения, но не были зафиксированы в нашем исследовании, ввиду критериев включения в основную группу. Все роженицы болели COVID-19 на момент родоразрешения. И, возможно, именно данный факт не позволил вирусу реализовать на территории плода все свои негативные потенции.

ВЫВОДЫ

В данном исследовании мы использовали методы целевой метаболомики для обнаружения изменений концентрации аминокислот беременных, инфицированных COVID-19, в момент госпитализации. Такие изменения были выявлены. Было обнаружено, что концентрации восьми аминокислот в амниотической жидкости (1-метилгистидин, 3-метилгистидин, аргинин, цистатионин, цистин, глутамин, гистидин, транс-4-гидроксипролин) и четырех аминокислот в пуповинной плазме (1-метилгистидин, бета-аланин, цистин, гистидин) статистически значимо различаются между группой пациентов, инфицированных COVID-19, и контрольной группой. Наша цель состояла в том, чтобы не только найти маркеры заболевания, но и

понять, какое влияние инфекция COVID-19 оказывает на метаболом плода. Оказалось, что нарушение метаболизма выявленных аминокислот проявляется при ряде серьезных патологий, таких как острый респираторный дистресс-синдром у пациентов с тяжелым сепсисом, пневмония при гриппе H1N1, бактериальная пневмония, серповидноклеточная анемия, талассемия, малярия, острая астма, муковисцидоз, легочная гипертензия, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые виды рака и др. Эти результаты могут быть использованы для выбора направления дальнейших исследований возможных последствий для здоровья новорожденных от матерей, перенесших COVID-19, и определения требований к лечению и медицинской помощи беременным женщинам и новорожденным после постановки диагноза COVID-19, так как отдаленные последствия для здоровья данной когорты новорожденных могут включать в себя эндокринные, нервные и аллергические расстройства, обусловленные метаболомными нарушениями программирования производства белковых молекул в антенатальном периоде.