В настоящее время считается, что четверть населения мира инфицирована туберкулезом; ежегодно регистрируется более 10 млн новых случаев болезни и 1,2 млн смертей от туберкулеза. По данным Всемирной организации здравоохранения, 15–20% наблюдений туберкулеза приходится на его внелегочные формы, а туберкулезный перитонит (ТП) прочно занимает среди них шестое место [1, 2].

Представления о патогенезе внелегочного туберкулеза сформировались в 30–60-х гг. прошлого века на основе клинических наблюдений, экспериментальных работ и результатов аутопсий. ТП рассматривали в рамках полисерозита с одновременным вовлечением в специфический процесс брюшины, перикарда, плевры и синовиальных оболочек крупных суставов [3, 4], что являлось типичным проявлением прогрессирующего первичного туберкулеза.

Наблюдаемый в последние десятилетия ТП у подавляющего большинства пациентов развивается в поздние сроки туберкулезной инфекции; его патогенез изучен недостаточно и, вероятно, обусловлен лимфогематогенным распространением микобактерий туберкулеза (МБТ) из легких, внутрибрюшных лимфатических узлов, кишечника, маточных труб [5, 6]. До сих пор остается неясным, почему в таких случаях генерализация инфекции вовлекает в воспалительный процесс те или иные органы и каковы условия, благоприятствующие развитию патологических изменений именно в данной анатомической области.

Основными из таких условий до недавнего времени считали микроциркуляторные расстройства, когда первоначальные очаговые поражения органов возникали лишь при определенной функциональной перестройке микроциркуляторного русла: большой объем последнего, замедленный кровоток, тесный контакт с тканями (полузамкнутый характер системы микроциркуляции, наличие пор и фенестр в стенках капилляров) [7].

Известно, что у каждой формы внелегочного туберкулеза имеется свой locus minoris resistentiae, где в строго закономерной последовательности развиваются первоначальные очаговые поражения. Так, в брюшной полости это илеоцекальная зона, где минимизации кровотока способствуют замедленный кишечный пассаж (илеостаз) и относительно большая масса лимфоидной ткани в мезентериальных лимфатических узлах и пейеровых бляшках, которые «заболачиваются» при низкой скорости кровотока [3, 8].

Нарушения микроциркуляторного русла не могут не играть существенную роль в развитии ТП, хотя, безусловно, и не исчерпывают его патогенез до самого конца. Как и во всяком ином патологическом процессе, определенная роль здесь принадлежит малоизученным иммунным защитным механизмам. Применительно к ТП речь идет о защитной роли брюшины, с которой взаимодействуют МБТ, а также о местном иммунитете [9].

Эти недостаточно исследованные механизмы могут быть изучены в экспериментальных условиях на моделях, воспроизводящих ТП человека во всех его характерных особенностях. Есть основание полагать, что при таком подходе удастся понять, каким образом и в какой мере повреждение брюшины и защитные реакции в ней интегрируются и уравновешиваются в системе целостного организма.

При использовании поисковой системы PubMed нам не удалось выявить в текущей литературе публикаций, касающихся способов моделирования ТП. При более глубоком поиске в работах XIX и первой половины ХХ веков [10, 11] были найдены немногочисленные описания неудачных попыток внутрибрюшинного заражения лабораторных животных культурой МБТ с целью экспериментального воспроизведения ТП.

Целью работы было изучение патогенеза туберкулезного перитонита с помощью создания воспроизводимой биологической модели.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на 18 кроликах-самцах породы «Советская шиншилла» массой 2,60–3,25 кг, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» («Курчатовский институт»; Россия). Использовали животных без внешних признаков заболевания, прошедших двухнедельный карантинный режим в условиях сертифицированного вивария СанктПетербургского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии. Животных содержали в одинаковых условиях на стандартном пищевом режиме при доступе к воде ad libitum.

Все кролики были разделены на две группы: экспериментальную и контрольную, в каждую из которых входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно.

ТП моделировали по оригинальной, разработанной нами методике путем интраперитонеальной инокуляции 6 мл суспензии стандартизованного вирулентного тест-штамма M. tuberculosis H₃₇Rv, содержавшей 10⁶ микобактериальных клеток. Использовали суспензии МБТ в физиологическом растворе или в геле гидроокиси алюминия для заражения соответственно контрольных и экспериментальных групп животных. Культивирование тест-штамма M. tuberculosis H₃₇Rv (TBC # 1/47, Институт гигиены и эпидемиологии; Прага, 1976) из коллекции Научного центра экспертизы средств медицинского применения проводили на среде Левенштейна–Йенсена (Becton, Dickinson аnd Company; США). Подготовку микобактериальной суспензии трехнедельного (вторая генерация) тест-штамма M. tuberculosis H₃₇Rv выполняли ex tempore в день заражения животных.

Внутрибрюшинное заражение осуществляли в условиях иммунодефицита. Для этого, с одной стороны, снижали концентрацию фактора некроза опухолей TNFα (основного цитокина, регулятора образования и устойчивости гранулем) путем внутривенного введения ингибитора TNFα инфликсимаба (химерного мышино-человеческого моноклонального антитела) («БИОКАД»; Россия). С другой стороны, подавляли фагоцитарную активность агранулоцитов брюшины (перитонеальных макрофагов) путем внутрибрюшинного введения железа (III) гидроксида сахарозного комплекса (Ferric (III) hydroxide sacharose complex) («ФАРМАСИНТЕЗ»; Россия). Этот препарат выбран как донатор трехвалентного железа для создания эффекта «перегрузки железом» иммунокомпетентных клеток, которые поглощают избыточное нетрансферриновое железо [12, 13].

В экспериментальную группу вошли 10 кроликов, которым за сутки до внутрибрюшинного заражения культурой МБТ вводили однократно в краевую ушную вену инфликсимаб из расчета 16 мг/кг [14], а за 1 ч до заражения — внутрибрюшинно 5 мл раствора железа (III) гидроксида сахарозного комплекса.

Восемь кроликов контрольной группы были заражены аналогичным образом, однако ингибитор TNFα и железосахарозный комплекс они уже не получали.

После заражения осуществляли мониторирование массы тела животных (взвешивали один раз в 10 дней), наблюдали за их поведением, выполняли постановку внутрикожных проб с антигеном туберкулезным рекомбинантным (Диаскинтест®) для подтверждения развития туберкулезной инфекции. Выведение животных из эксперимента проводили на 45-е сутки от момента заражения с помощью передозировки средств для наркоза: тиопентала натрия 250 мг и пипекурония бромида 1 мг внутривенно.

При проведении аутопсии оценивали наличие выпота в серозных полостях и бугорковых образований на серозных покровах печени, селезенки, кишечника и легких, а также форму и величину внутригрудных и внутрибрюшных лимфатических узлов, размеры и структуру почек. Забирали материал для микроскопического исследования париетальной брюшины, печени, почек, селезенки, легких, сердца и лимфатических узлов. Весь материал заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также специальными методами по Ван Гизону (для идентификации коллагеновых волокон) и по Перлсу (качественная реакция на трехвалентное железо). Кроме того, проводили бактериоскопическое исследование после окраски срезов по Цилю–Нельсену для обнаружения МБТ. Дополнительно выполняли молекулярно-генетическое тестирование тканей брюшины и сальника методом ПЦР для детекции ДНК МБТ с использованием набора реагентов «Амплитуб-РВ» («Синтол»; Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе динамического наблюдения за животными после их внутрибрюшинного заражения суспензией МБТ потери веса не отмечено; напротив, все кролики прибавляли в весе в среднем на 132 ± 42,6 г за весь период эксперимента. Проба с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (Диаскинтест®) на 20–22-е сутки после заражения была гиперергической у всех 18 кроликов.

При аутопсии и гистологическом исследовании материала обнаружены существенные и значимые различия между кроликами экспериментальной и контрольной групп.

В контрольной группе на 45-е сутки с момента внутрибрюшинного заражения серозный покров брюшной полости оставался интактным как на макро-, так и на микроскопическом уровне; специфические изменения не были выявлены ни в паренхиматозных органах брюшной полости, ни в почках. ДНК МБТ методом ПЦР в брюшине и сальнике не обнаружена.

Вместе с тем, у трех животных (37,5%) имелись четкие признаки туберкулезного воспаления легких. При микроскопии в легочной ткани были обнаружены нечеткие, сливавшиеся друг с другом макрофагальные гранулемы с небольшими участками некроза и слабо выраженной лейкоцитарной инфильтрацией по периферии, изредка — более крупные очаги казеозного некроза, инфильтрированные распадавшимися лейкоцитами. В прилегавшей легочной ткани были обнаружены дистелектазы с преобладанием ателектазов, очаговая экссудативная реакция, явления продуктивного васкулита (рис. 1А, В). В таких участках плевра была утолщена за счет отека и мононуклеарной инфильтрации. При окраске по Ван Гизону инкапсуляции очагов казеозного некроза не найдено, признаков организации в участках туберкулезного воспаления не зафиксировано. При окраске по Цилю–Нельсену были выявлены микроколонии МБТ в очагах некроза (рис. 1Б).

Стоит отметить слабовыраженные реактивные изменения в отдельных лимфатических узлах брюшной полости и средостения без признаков специфического туберкулезного лимфаденита. При микроскопическом исследовании была обнаружена очаговая неспецифическая инфильтрация брюшины, где при бактериоскопии МБТ не определялись. Их отсутствие в таких участках брюшинного покрова было подтверждено и при ПЦР-диагностике.

В экспериментальной группе у всех животных на первой неделе после заражения были выявлены клинические симптомы интоксикации: гиподинамия, отсутствие аппетита и снижение массы тела на 75–110 г (в среднем 84 г). В последующие 35 дней отмечена положительная динамика с восстановлением обычной двигательной активности, увеличением массы тела и нормализацией аппетита.

На аутопсии через 45 суток после заражения у всех животных из экспериментальной группы отмечены характерные макроскопические признаки ТП: желтоватый серозный выпот в брюшной полости, не превышавший по объему 5 мл, плотные и рыхлые спайки разной степени зрелости между петлями тонкой кишки, большим сальником и передней брюшной стенкой, множественные мелкие и крупные бугорки размерами 2–6 мм на париетальной и висцеральной брюшине (рис. 2). При гистологическом исследовании спаек и фрагментов серозного покрова были выявлены макрофагальные гранулемы с единичными гигантскими многоядерными клетками Лангханса, а также обширные очаги казеозного некроза с перифокальным скоплением сливающихся друг с другом макрофагальных гранулем (рис. 3А, Б). Подобные изменения имелись также в брыжейке тонкой кишки и в большом сальнике.

У 9 из 10 (90%) экспериментальных животных был выявлен активный туберкулез легких в виде очагов казеозного некроза с небольшими скоплениями лимфоцитов по периферии и образованием специфических грануляций. При окраске по Ван Гизону признаков организации в очагах туберкулезного воспаления в легких не найдено. При окраске по Цилю–Нельсену в казеозных массах обнаружены микроколонии МБТ.

При окраске по Перлсу выявлены множественные скопления макрофагов с большим содержанием железа в цитоплазме, как в тканях брюшины, так и в тканях легких (рис. 3В, Г). В одном случае был обнаружен туберкулезный спленит (10%), в другом — туберкулезный гепатит (10%). В лимфатических узлах брыжейки тонкой кишки выявлены как специфические изменения, так и неспецифическая реактивная гиперплазия лимфоцитов. Наряду с этим у всех кроликов определялись дистрофические изменения в эпителии извитых канальцев почек, в печени и в миокарде, которые сопровождались выраженным полнокровием и отеком стромы органов.

Изменения со стороны серозной оболочки кишечника были двоякого рода: в одних случаях выявлялся продуктивный туберкулезный перитонит без признаков организации, а в других — неспецифическое реактивное воспаление. В серозной оболочке желудка специфические воспалительные изменения не выявлены. При детекции ДНК МБТ в тканях большого сальника во всех 10 случаях получены положительные результаты.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Выбор кролика (Oryctolagus cuniculus domesticus) как лабораторного животного при разработке экспериментальной модели ТП далеко не случаен. По словам Клода Бернара, удачный выбор животного часто достаточен, для того чтобы разрешить самые сложные общие вопросы.

Было показано, что у кроликов, считающихся резистентными к инфекции, вызванной M. tuberculosis, в определенных условиях заражения этим возбудителем закономерно развивается специфическое хронически прогрессирующее гранулематозное воспаление или латентная туберкулезная инфекция в зависимости от вирулентности МБТ [15–17]. В морфологическом дискурсе речь идет об эволюции гранулем — их формировании, созревании и распаде, аналогично тому, как это происходит у человека. Эксперименты с кроликом как с достаточно крупным лабораторным животным позволяют провести надежный мониторинг патофизиологических изменений с самого начала инфекционного процесса и вплоть до его завершения, даже не прибегая к эвтаназии [18].

Согласно нашим наблюдениям, при внутрибрюшинном заражении МБТ у кроликов с интактным иммунным статусом развивается не ТП, а туберкулезное воспаление легких и лимфатических узлов средостения. Заболевает лишь половина зараженных животных, причем изменения в легких и лимфоузлах носят у них преходящий характер и спустя 1,5 месяца после заражения сходят на нет. Наряду с исчезновением воспалительных изменений в этих органах исчезают и МБТ. Отсутствие воспалительных изменений в брюшной полости является следствием того, что серозная оболочка фигурирует в патологическом процессе как механический барьер, роль которого играет, к примеру, большой сальник, самостоятельно ограничивающий воспалительные очаги в брюшной полости, и как орган гуморальной и клеточной защиты sui generis.

В настоящее время общепризнано, что инвазии микроорганизмов в брюшной полости противостоят три клеточные системы: лимфоциты, мезотелиоциты и перитонеальные макрофаги, обеспечивающие первую линию защиты через фагоцитарную активность и выработку воспалительных цитокинов [19]. Защитную роль играет и секреторная функция мезотелия, наблюдаемая в нормальных и патологических условиях [20], благодаря которой МБТ высвобождаются в свободную брюшную полость, где погибают в экссудате, содержащем комплемент, свободные антитела, перитонеальные макрофаги и нейтрофильные лейкоциты, которые в совокупности обеспечивают его бактериостатические и бактерицидные свойства. Иными словами, мы рассматриваем брюшину не как морфологически сложившееся статически постоянное образование, а в качестве органа гуморального и клеточного иммунитета [21].

Очевидно, что физиологическая активность перитонеальных макрофагов играет далеко не последнюю роль в реализации защитных свойств брюшины, так как в условиях ее подавления инфликсимабом (ингибитором TNFα) и «перегрузки железом» нам удалось воспроизвести хронически прогрессирующий ТП с формированием альтеративных и гранулематозных изменений на фоне размножения МБТ. Говоря о значении защитных реакций в патогенезе ТП, мы имеем в виду не только фагоцитоз возбудителей макрофагами, но и дальнейшую судьбу тех и других. В цитоплазме макрофагов МБТ частично или полностью погибают, сами же пораженные клетки удаляются в процессе физиологического очищения: из брюшины в результате секреции в свободную брюшную полость, а из легких — клиренсом. 

Таким образом, для развития ТП, помимо наличия этиологического фактора в брюшной полости, необходима инактивация перитонеальных макрофагов и регулирующих цитокинов, главным из которых является TNFα. Последний важен для защиты от туберкулеза и у людей. Он выполняет множество иммунорегуляторных функций, включая раннюю индукцию хемокинов, приводящую к привлечению лейкоцитов, а также принимает участие в морфогенезе гранулем, которые являются обязательной морфологической структурой любого микобактериального заболевания у человека [22, 23].

Генетические исследования показали, что значительно влияют на восприимчивость (соответственно устойчивость) к туберкулезу toll-подобные рецепторы, например такие, как TLR-2. Варианты их полиморфизма изучали в основном при легочном туберкулезе, однако обнаружена существенная связь между полиморфизмом TLR-2 Arg753Gln и частотой развития ТП. Это свидетельствует о том, что лица с генетическим полиморфизмом части Arg753Gln TLR-2 находятся в зоне повышенного риска возникновения ТП [24].

Наше экспериментальное моделирование ТП позволило выявить ряд важных особенностей его патогенеза.

1. При использовании ингибитора TNFα и сахарозного комплекса гидроксида железа (III) у всех животных закономерно развивается распространенное активно прогрессирующее туберкулезное воспаление брюшины с преобладанием гранулематозно-некротических изменений, местами переходящих в казеоз. О его массивном характере можно судить по тому, что помимо париетальной брюшины и большого сальника туберкулезное воспаление охватывает висцеральную брюшину брыжейки и петель кишечника.
2. При описанном способе моделирования ТП развивается также деструктивный туберкулез легких с лимфаденопатией внутригрудных и внутрибрюшных лимфатических узлов, в которых обнаруживаются специфические гранулематозные и неспецифические гиперпластические изменения.
3. Другие органные поражения гематогенного генеза (печени, селезенки, почек) встречаются при данном способе моделирования ТП лишь в единичных случаях как свидетельство гематогенной генерализации инфекции.

На нашей экспериментальной модели ТП надежно воспроизведены клинико-морфологические и патогенетические особенности туберкулезного поражения брюшины у человека. Их можно наблюдать при гематогенной диссеминации легочного туберкулеза, развивающегося на том или ином коморбидном фоне, когда имеется нарушение местного иммунитета брюшины и/или развивается общая иммуносупрессия.

По данным литературы и собственных клинических наблюдений, туберкулез брюшины развивается при беременности, у больных сахарным диабетом, при циррозе печени, болезнях сердца и сосудов, сопровождающихся асцитом, при перитонеальном диализе, при врожденных и приобретенных иммунодефицитах.

Беременность всегда сопровождает иммуносупрессия, связанная со сложной системой иммунологического взаимодействия матери и плода. Прогестерон и кортизол, уровни которых повышаются при беременности, подавляют Т- и В-клеточный иммунитет, и после разрешения беременности, ко 2–3 месяцу после родов наступает истощение пула агранулоцитов [25]. Оно затрагивает количество и активность перитонеальных макрофагов, на что указывает частота развития ТП в первые месяцы после рождения ребенка.

У больных сахарным диабетом, как в фазе декомпенсации углеводного обмена, так и при достижении компенсации отмечается достоверное повышение спонтанной и снижение индуцированной продукции IL1 и TNFα мононуклеарами периферической крови по сравнению со здоровыми лицами [26], что приводит к нарушению морфогенеза гранулем и снижает их устойчивость. Это объясняет случаи выявления ТП у таких больных.

Длительно существующий асцит при вышеперечисленной патологии, а также при канцероматозе приводит к хроническому асептическому воспалению брюшины, при исходе которого значительно уменьшается численность макрофагов, в том числе перитонеальных, и снижается локальная концентрация TNFα [27].

Напрямую связан с развитием туберкулеза брюшины и хронический перитонеальный диализ. Диализные растворы содержат повышенную концентрацию глюкозы и имеют нефизиологичное значение рН, что влечет за собой нарушение функциональной активности фагоцитов и лимфоцитов в брюшине [28].

Иммунодефицитные состояния, как врожденные, так и приобретенные, в том числе после применения иммуномодулирующих препаратов (ингибиторы TNFα) и глюкокортикостероидов, влекут за собой снижение числа агранулоцитов и синтеза TNFα. Низкие концентрации TNFα и инактивация макрофагов в брюшине напрямую способствуют развитию ТП. И, конечно, пусковым звеном в патогенезе туберкулеза брюшины может стать ВИЧинфекция c характерной для нее иммуносупрессией [29, 30].

Анализируя результаты нашего эксперимента и принимая во внимание клинические наблюдения и данные литературы, можно предложить следующую схему патогенеза ТП у человека. Стрессорные воздействия, такие как недоедание, беременность, внезапная смена социального статуса, иммуносупрессивные заболевания и др., приводят к реактивации первичного туберкулезного очага с деструкцией ранее образованных гранулем и лимфогематогенным распространением МБТ [31]. Анатомическая область, где развивается вторичный очаг внелегочной туберкулезной инфекции, напрямую зависит не только от особенностей микроциркуляции в данном регионе, но и от местной иммунной защиты (местного иммунитета по А. М. Безредка). Так, для брюшины таким необходимым и достаточным условием развития вторичного очага является уменьшение численности пула перитонеальных макрофагов и снижение цитокиновой продукции. Схема патогенеза ТП представлена на рис. 4.

ВЫВОДЫ

Клинические проявления, методы выявления, диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания хорошо изучены и полноценно освещены в научно-медицинской литературе. Туберкулез в основном поражает легочную паренхиму, в то же время при определенных условиях, связанных с изменениями местного и гуморального иммунитета, процесс может локализоваться практически во всех органах и тканях человека. Предметом описания оказывается, как правило, активно прогрессирующий туберкулез легких, в то время как внелегочным проявлениям инфекции с тяжелыми деструктивными изменениями уделяется существенно меньше внимания. Последние десятилетия около 15% случаев выявленного туберкулеза во всем мире являются внелегочными. Их клиническая диагностика чревата объективными трудностями, поскольку при внелегочном туберкулезе результаты золотого стандарта диагностики — выявления МБТ в мокроте часто оказываются отрицательными. И самым парадоксальным образом наличие M. tuberculosis во внелегочных очагах зачастую вызывает широкий спектр неспецифических симптомов, тем самым создавая дополнительные трудности диагностики.  Одной из таких сложных для диагностики и лечения внелегочных форм туберкулеза является ТП. В проведенной работе экспериментально показана роль перитонеальных макрофагов в формировании местного протективного иммунитета, а также TNFα в обеспечении гуморального звена защитных процессов. Полученные данные позволят улучшить понимание особенностей современного патогенеза туберкулезного перитонита, разработать диагностические критерии и лечебную, в том числе хирургическую тактику ведения таких пациентов.

Конфликт интересов: Д. В. Плоткин, Т. И. Виноградова, М. Н. Решетников, Ю. Р. Зюзя, М. В. Синицын, Е. М. Богородская, П. К. Яблонский — подали заявку в Федеральную службу по интеллектуальной собственности «Федеральный институт промышленной собственности» на регистрацию заявления о выдачи патента Российской Федерации на изобретение «Способ моделирования туберкулезного перитонита» (регистрационный № 2021114954 от 25 мая 2021 г.). Б. М. Ариэль, В. Ю. Журавлев — заявляют об отсутствии у них конфликта интересов.