В настоящее время рак желудка занимает пятое место по заболеваемости и третье по смертности не только в Российской Федерации, но и во всем мире. Значительный рост числа молодых пациентов с данным заболеванием стал поводом для проведения многочисленных исследований, направленных на выявление ранних предикторов канцерогенеза и критических факторов риска малигнизации [1, 2].

Среди патогенных факторов рака желудка инфицирование Helicobacter pylori (HP) является основной причиной этого заболевания. Доказано, что у 80% больных раком желудка в анамнезе отмечалось присутствие HР [3, 4]. Нет сомнений, что HР является одним из решающих факторов в каскадном процессе канцерогенеза, инициируя развитие острого гастрита, пролонгацию его в хронический с последующей атрофической, метапластической и диспластической трансформацией, что в конечном счете приводит к развитию аденокарциномы [5].

В последние годы все больше исследований сосредоточено на изменениях в опухолевом микроокружении. Особый интерес вызывает изучение опухоль-ассоциированных макрофагов (ОАМ) [6]. ОАМ связаны с возникновением опухолей, играя ключевую роль в метастазировании, а также иммунной регуляции новообразований. В настоящее время установлен факт функциональной неоднородности макрофагов. Выделяют макрофаги 1-го типа, инициирующие развитие провоспалительных реакций, и 2-го типа с ремоделирующей направленностью, которые могут стимулировать миграцию и инвазию опухолевых клеток за счет активации неоангиогенеза [7–9].

Известно, что HР способна активно рекрутировать макрофаги, моноциты и дендритные клетки в слизистую оболочку желудка — она заставляет их секретировать провоспалительные цитокины и хемокины, вызывая воспаление и повреждение слизистой оболочки желудка [10, 11]. В ряде исследований сообщали о влиянии НРинфекции на поляризацию макрофагов за счет стимуляции процессов свободнорадикального окисления. По результатам ряда научных исследований установлено, что под воздействием бактериальных факторов происходит усиленная генерация активных форм кислорода и гипоксией индуцированного фактора-1 α [8, 9]. Кроме того, HP обладает способностью синтезировать большое количество индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), способствуя поляризации макрофагов по фенотипу М2, которые, в отличие от М1, обладают довольно слабой фагоцитарной активностью, что таким образом способствует дальнейшей  персистенции возбудителя [12].

В настоящее время эндоскопическое исследование с прицельной биопсией является основным методом диагностики атрофического гастрита и его осложнений. Однако для НР-ассоциированного атрофического гастрита весьма характерен очаговый характер изменений, поэтому для получения правильного морфологического заключения о направленности патологического процесса необходимо обеспечить адекватное получение биоптационного материала, что в условиях амбулаторного звена нередко бывает затруднительно [13]. Вместе с тем, раннее выявление атрофии и последующих предраковых изменений (кишечной метаплазии и дисплазии) является непременным условием профилактики рака желудка. Одним из путей решения этой проблемы может служить иммуногистохимическая верификация морфологических изменений иммунных клеток слизистой оболочки желудка.

В связи с вышесказанным целью настоящей работы было оценить предиктивный потенциал иммуногистохимического фенотипирования макрофагальной популяции при ранней малигнизации HР-ассоциированного хронического гастрита.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Морфологические исследования проводили в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Молекулярная биология» Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» при поддержке программы развития КФУ. Материалом для исследования послужили гастробиоптаты пациентов обоего пола в возрасте 49 ± 7,2 лет, разделенных на три группы: хронический неатрофический гастрит (ХНГ, n = 10), хронический атрофический гастрит (ХАГ, n = 10), тубулярная аденокарцинома желудка G1-G2, кишечный тип по Лаурен (АКЦ, n = 10). Критерии включения в исследуемые группы: положительный анализ на HP. Критерии исключения: отрицательный анализ на HP или отсутствие анамнестических сведений о выполнении указанного анализа. Согласно анамнестическим данным, все пациенты были НР-положительными. Верификацию НР осуществляли на основании количественного определения иммуноглобулинов класса G (IgG) к НР в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа и быстрого уреазного дыхательного теста.

Контрольную группу составили фрагменты визуально интактной слизистой желудка 10 пациентов, умерших от причин, не связанных с патологией желудочно-кишечного тракта, без гистологических признаков гастрита и не инфицированных НР.

Для проведения морфологического исследования биопсийного и секционного материала фрагменты слизистой желудка фиксировали в 10%-м растворе нейтрального формалина. Проводку и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике, с последующей окраской гематоксилином и эозином [14].

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) проводили на срезах толщиной 3–4 мкм с применением двойного пероксидаза-антипероксидазного метода в соответствии с протоколами компании Thermo Scientific (США), используя систему визуализации Leica Biosystems (Novocastra; США) и DAB Chromogen (Abcam; Великобритания) с последующим докрашиванием ядер гематоксилином. Макрофагальную популяцию визуализировали с помощью панмакрофагального/моноцитарного маркера CD68 (клон PG-M1, разведение 1:50, DAKO; Дания) и маркера типичных репаративных макрофагов 2α фенотипа CD163 (клон EPR-19518, разведение 1 : 500, Abcam; Великобритания). Согласно данным метаанализа, именно изучение маркеров СD68 и CD163 более информативно по сравнению с исследованием другого М2 маркера — CD206 [15]. При этом CD163 может экспрессироваться как дополнительный поверхностный маркер моноцитов крови, также способных к фенотипической поляризации. Однако моноциты демонстрируют более низкий уровень экспрессии указанного маркера по сравнению с макрофагами.

Интенсивность неоангиогенеза определяли с использованием маркера эндотелия сосудов CD31 (клон 1A10, Leica Bond; CША) путем оценки суммарной площади поперечного сечения сосудов.

Полученный материал анализировали при помощи светового микроскопа CX41 (Olympus; Япония).

Морфометрические исследования проводили с помощью программы Image J (NIH; США) на стандартизованной площади цифрового изображения гистологического среза. Для каждого маркера макрофагов считали клетки с позитивной цитоплазматической реакцией в 10 полях зрения при увеличении 20х/0,50 объектива UPlanFL N (Olympus; Япония) с последующим подсчетом среднего количества клеток в биоптате.

Статистический анализ проводили с применением программы STATISTICA 10.0 для Windows (StatSoft Inc.; США). Для определения нормального распределения использовали коэффициент нормальности Колмогорова– Смирнова. Определяли основные статистические характеристики: среднее (M), ошибку среднего (m). Межгрупповые сравнения морфологических показателей проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа (One-Way ANOVA) с применением критерия Даннета (Q) для сравнения малых по численности выборок с контрольной группой. Межгрупповые различия считали значимыми при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Согласно данным серологического исследования, в группе больных с ХНГ у 33% обследуемых выявляли титр антител, равный 1 : 5, у 67% — выше 1 : 10. У пациентов с ХАГ титр антител 1 : 5 наблюдался лишь у 10% больных; у 49% обследуемых титр антител был выше 1 : 10, а остальные 41% демонстрировали высокий титр антител — от 1 : 20 до 1 : 80. У 77% пациентов с верифицированной АКЦ титр антител был равен 1 : 20 и выше, а у 23% титр антител составлял от 1 : 5 до 1 : 10.

По данным морфологического исследования, слизистая оболочка желудка в контрольной группе имела типичное строение, представленное выстилкой из цилиндрического эпителия правильной формы, образующего желудочные ямки без признаков гастрита (рис. 1А). В подслизистом слое локализовались единичные резидентные макрофаги как первого, так и второго фенотипа (рис. 1Б, В). Сосудистый рисунок был четким, умеренно-выраженным. Сосуды были преимущественно представлены капиллярами и венулами (рис. 1Г).

При проведении обзорного окрашивания установлено, что гастробиоптаты пациентов с ХНГ характеризовались различной степенью выраженности лимфоплазмоцитарной инфильтрации (от слабовыраженной до умеренной), а также формированием единичных гиперплазированных лимфоидных агрегатов в строме, повышенной мукоидизацией покровно-ямочного цилиндрического эпителия и фовеолярной гиперплазией. В некоторых зонах биоптатов определялись очаги гиперплазии кислотопродуцирующих желез фундального типа (рис. 2А).

По данным ИГХ-исследования биоптатов группы пациентов с ХНГ, CD68⁺-клетки были равномерно распределены в собственной пластинке слизистой желудка, около половины из них составляли моноциты/ макрофаги 2-го типа. Соотношение CD163 : CD68 составило 0,67 ± 0,02 (рис. 2Б, В), значимо превышая значения, полученные для контрольной группы (р < 0,05). По мнению авторов, сдвиг индекса соотношений моноцитарно-макрофагальных популяций по сравнению с контрольной группой свидетельствует об инициации каскада противовоспалительных реакций.

Суммарная площадь поперечного сечения сосудов при ХНГ составляла 3590,92 ± 356,27 мкм², что свидетельствовало о статиcтически незначимой интенсификации неоангиогенеза по сравнению с образцами контрольной группы (р > 0,05). При этом варианте гастрита показатель сосудистой площади был минимальным по сравнению с группами пациентов с ХАГ и АКЦ (рис. 2Г; таблица).

Биоптаты пациентов с ХАГ также демонстрировали полиморфизм гистологических изменений. Атрофия железистого компонента была обусловлена двумя принципиально разными процессами — фиброзной трансформацией стромы или кишечной метаплазией (тонко-/толстокишечной либо комбинацией этих типов метаплазии). Атрофический гастрит с фиброзом собственной пластинки слизистой характеризовался выраженной лимфо-плазмоцитарной инфильтрацией, зачастую с наличием лимфоидных фолликулов с расширенными герминативными центрами (рис. 3А).

Моноцитарно-макрофагальная популяция так же равномерно распределялась во всей толще биоптатов — как в области фовеолярных зон, так и вблизи лимфоидных скоплений. Большая часть клеток демонстрировала иммунофенотип моноцитов/макрофагов 2-го типа.

Соотношение CD163 : CD68 составило 0,81 ± 0,04 (рис. 3Б, 3В). При этом площадь микроциркуляторного русла в биоптатах данной подгруппы значимо возрастала по сравнению с показателями как группы ХНГ, так и контрольной группы (рис. 3Г).

Морфологические и иммуногистохимические изменения в биоптатах пациентов с верифицированной тубулярной аденокарциномой были максимально показательными с позиции функционального перепрофилирования макрофагальной популяции и интенсивности неоангиогенеза. Среди тубулярных структур с явлениями клеточной и ядерной атипии, а также участков солидного строения определялось наличие десмопластически измененной стромы с умеренным и выраженным густоклеточным воспалительным инфильтратом из лимфоидных клеток, гистиоцитов, нейтрофилов (рис. 4А).

Количество клеток моноцитарно-макрофагальной популяции увеличилось вдвое по сравнению с показателями ХАГ и вчетверо по сравнению с ХНГ. Соотношение экспрессии CD163 : CD68 составило 0,88 ± 0,03 (рис. 4Б, В).

Площадь микроциркуляторного русла также была максимальной, значимо превышая контрольные значения (рис. 4Г), что могло свидетельствовать об интенсификации процессов неоангиогенеза в опухоли для формирования комфортного микроокружения и способствовало метастастатической диссеминации опухолевых клеток [16].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известные на сегодняшний день молекулярные биомаркеры моноцитов/макрофагов демонстрируют довольно широкие диагностические возможности и могут служить предикторами риска малигнизации за счет специфического выявления той или иной субпопуляции имунных клеток, что позволяет спрогнозировать течение ряда заболеваний. Доказано, что за счет различных фенотипов макрофаги могут играть двоякую роль в воспалительных процессах в зависимости от сигналов их микроокружения [17].

Хронический НР-ассоциированный гастрит сопровождается динамическим увеличением общей популяции клеток моноцитарно-макрофагального ряда, покольку известно, что НР активно стимулирует запуск цитокинового каскада, который играет основную роль в реализации хронических воспалительных и деструктивных

процессов в слизистой оболочке желудка [4]. Во время острой воспалительной реакции макрофаги обычно поляризуются по М1 фенотипу интерфероном-γ и микробными продуктами, такими как липополисахарид, и оказывают мощное антимикробное действие за счет выработки бактерицидных компонентов (оксида азота и кислородных радикалов) [9]. Однако данная бактерия способна ингибировать действие активных веществ макрофагов за счет их нейтрализации каталазой и супероксиддисмутазой, что способствует ее выживанию. При этом активные формы кислорода, в избытке вырабатываемые макрофагами, приводят к гибели собственных клеток слизистой оболочки желудка, что увеличивает риск развития атрофии [18].

Согласно данным проведенного исследования, атрофический гастрит сопровождается векторным перераспределением моноцитов/макрофагов во 2-й функциональный тип. Макрофаги М2 индуцируются T-хелперами 2-го типа или противовоспалительными цитокинами и факторами роста, включая IL4, IL10 [6]. Очевидно, сдвиг поляризации моноцитов/макрофагов в сторону М2 по мере прогрессирования воспаления должен обеспечивать регенерацию тканей и усиливать гуморальный ответ. Однако длительная усиленная выработка факторов патогенности НР может приводить к снижению способности макрофагов элиминировать бактериальные антигены, что приводит к длительной персистенции патогена и хронизации воспаления [19, 20]. С другой стороны, хроническое воспаление с персистирующей поляризацией моноцитов/макрофагов М2 ассоциировано с повышенным риском развития рака желудка [1, 13, 21].

Таким образом, в ходе настоящего исследования наблюдалось динамическое увеличение панмакрофагальной популяции, с прогрессирующим перепрофилированием макрофагов во 2-й функциональный тип по мере трансформации хронического неатрофического гастрита в атрофический и пиковыми значениями в биоптатах с аденокарциномой желудка. По нашему мнению, такие изменения связаны с ремоделирующей функциональной активностью альтернативно активированных моноцитов/ макрофагов М2 за счет повышенной экспрессии проангиогенных факторов роста, что способствует, с одной стороны, фиброзной трансформации стромы желудка в условиях прогрессирующего хронического воспаления и тканевой гипоксии, а с другой — создает комфортное микроокружение для диспластических и неопластических изменений эпителия железистого компонента [11, 22]. Кроме того, известно, что определенные популяции М2 макрофагов обладают выраженными опухольстимулирующими функциями, поскольку участвуют в локальной иммуносупрессии иммунокомпетентных клеток, приводя к ускользанию опухолевых клеток из-под иммунного надзора [23].

Многообразие фенотипов моноцитов/макрофагов требует дальнейшего изучения и стандартизации их предикторного потенциала. Для этого необходимо провести исследования на более объемных выборках пациентов, а также оценить другие макрофагальные маркеры, характерные для клеток моноцитарномакрофагального ряда. В частности, помимо основных поверхностных маркеров CD1 и CD16 моноциты способны экспрессировать дополнительные поверхностные маркеры CD163, CD204, что может быть выявлено путем двойного иммуноокрашивания [24]. Кроме того, несмотря на общепринятое разделение макрофагов на классические и альтернативные, были описаны другие подтипы макрофагов, включая профиброзные М2-подобные макрофаги, которые продуцируют факторы роста, и фибролитические М2подобные макрофаги, индуцированные ишемией, которые секретируют протеазы [12].

 В целом, выявление механизмов функционального программирования ОАМ позволит выявить мишени для терапевтического воздействия и разработать новые основанные на сочетании химиопрепаратов и иммуномодулирующих агентов подходы в лечении онкологических больных, направленные на активацию иммунного ответа на опухоль [13]. Синергическое действие этих модальностей может существенно повысить эффективность противоопухолевой терапии.

ВЫВОДЫ

Хронический H. pylori-ассоциированный гастрит сопровождается динамическим увеличением общей популяции макрофагов по мере нарастания атрофических и неопластических процессов. Атрофический гастрит и аденокарцинома сопровождаются векторным перераспределением макрофагов во 2-й функциональный тип. Усиленная экспрессия моноцитарно-макрофагального маркера CD163 может служить одним из предикторов малигнизации хронического гастрита в комплексе с гистологической оценкой степени атрофии и метаплазии эпителия железистого компонента.