Рак пищевода (РП) считается одним из наиболее агрессивных злокачественных новообразований и занимает ведущие позиции по заболеваемости и смертности во всем мире [1]. Пятилетняя выживаемость пациентов после момента постановки диагноза РП составляет примерно 10–15%, что объясняется высокой степенью метастазирования данной нозологии в лимфатические узлы [2]. К факторам риска развития РП относятся: употребление очень горячей или холодной пищи и напитков, курение, злоупотребление алкоголем, вдыхание токсических газов, употребление питьевой воды с содержанием тяжелых металлов, проглатывание едких веществ [3].

РП представлен в основном двумя гистологическими подтипами: плоскоклеточный рак и аденокарцинома пищевода (АП) [4]. В России чаще всего диагностируется плоскоклеточный рак пищевода, реже — аденокарцинома. В последние годы наблюдается тенденция к увеличению заболеваемости аденокарциномой, которая локализуется преимущественно в дистальной части пищевода и пищеводно-желудочном переходе [5, 6]. Основной особенностью АП в отличие от плоскоклеточной карциномы является раннее метастазирование в регионарные лимфатические узлы и субсерозное распространение с вовлечением сальниковой сумки. Печеночные метастазы наблюдаются редко [7]. Также АП распространяется в подслизистую оболочку грудного отдела пищевода с инвазией в диафрагму, плевру и перикард. Для АП часто характерен экзофитный рост, что значительно затрудняет хирургическое лечение и делает его малоэффективным [8].

На сегодняшний день наиболее удовлетворительным подходом к лечению рака шейного отдела пищевода является химиолучевая терапия. Хирургическое вмешательство при данной локализации опухоли включает в себя экстирпацию органа с формированием фарингогастроанастомоза, что часто приводит к послеоперационным осложнениям и ухудшению состояния больного. Пятилетняя выживаемость пациентов после курса химиолучевого лечения составляет 27% [9]. В схемы терапии рака пищевода может входить как дистанционная лучевая терапия, так и облучение контактным методом (брахитерапия). Лучевую терапию могут назначать до и после операции или комбинировать с химиотерапией. При этом приборная база, а также сама методология проведения лучевой терапии претерпели значительные усовершенствования. Несмотря на это проблема развития радиорезистентности опухолей, включая РП различных гистотипов, остается нерешенной.

Использование высоких доз лучевого воздействия теоретически подразумевает повышение вероятности цитотоксического эффекта. На практике это приводит к интоксикации организма продуктами распада опухоли и нарушению гомеостаза организма. Поэтому вопрос о способах и оптимальных дозах облучения с целью получения максимального противоопухолевого эффекта с наименьшими побочными осложнениями остается актуальным.

Одним из факторов, препятствующих повышению эффективности лечения АП человека, является отсутствие надежных доклинических моделей для трансляционных исследований [10]. Традиционные экспериментальные модели, такие как ксенотрансплантаты клеточных линий, введенные подкожно либо в стенку пищевода иммунодефицитным мышам, не воспроизводят сложной внутриопухолевой гетерогенности биоматериала донора [11], поэтому ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (patient-derived xenograft, PDX), являются перспективными модельными организмами для исследования новых терапевтических стратегий лечения рака [12].

При создании PDX-модели фрагмент опухоли донора имплантируют в организм иммунодефицитной мыши [13]. В трансляционных исследованиях рака используют специальных бестимусных мышей линии Bald/с nude, характерной особенностью которых является мутация в гене Foxn1 [14, 15]. Ослабление иммунитета по причине дефицита Т-лимфоцитов значительно облегчает приживление и метастазирование опухолевых клеток в ксенотрансплантатах после имплантации [16]. Модели PDX сохраняют морфологические характеристики и гетерогенность первичной опухоли донора и вследствие этого чувствительность к лечению может быть спрогнозирована лучше, чем с помощью ксенотрансплантатов клеточных линий [17]. Несмотря на то что строма человека в ксенографте заменяется стромой мыши, PDX хорошо сохраняют внутриопухолевую гетерогенность, в том числе при многократном пассировании [18].

Применение гетеротопических (подкожных) PDX очень распространено в трансляционных исследованиях рака, что объясняется технической простотой исполнения. Тем не менее подкожные ксенотрансплантаты не воспроизводят исходное микроокружение опухоли донора, опухолевые узлы в организме мыши-реципиента инкапсулируются, вследствие чего имеют локальный экспансивный рост и не метастазируют [19].

Ортотопическую PDX-модель АП человека создают путем непосредственной имплантации опухолевого фрагмента донора в стенку дистального отдела пищевода мыши. Ксенографт и действие облучения легко обнаружить при разрастании опухолевого узла, однако создание модели рака этого типа чрезвычайно сложно технически из-за анатомического расположения и размера пищевода мыши [20]. Другим преимуществом этого способа трансплантации является специфическое внутриорганное микроокружение опухоли, что способствует воспроизведению патоморфологических и молекулярных параметров опухоли пациента [21]. Поэтому ортотопические PDX используют в изучении поведения опухоли в отношении различных терапевтических подходов. В ходе нашего эксперимента степень противоопухолевого воздействия лучевой терапии определяли, вычисляя показатель торможения роста опухоли (ТРО) [22].

Цель исследования состояла в изучении эффективных доз и оценки противоопухолевой активности лучевой терапии на ортотопической PDX-модели АП человека, полученной путем ксенотрансплантации фрагмента опухоли донора в шейный отдел пищевода иммунодефицитных мышей.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование провели на базе ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России. Для создания ортотопических ксенотрансплантатов использовали свежий опухолевый материал от пациента с АП. При создании шестого пассажа PDX-моделей для трансплантации использовали самок мышей линии Balb/c nude (n = 25, возраст 6–8 недель, масса тела 21–25 г). На подготовительных этапах исследования использовали 12 самок мышей линии Balb/c nude. Мышей содержали в SPF-виварии при температуре 22–24 °С и относительной влажности воздуха 60%, при световом режиме день–ночь, в искусственно вентилируемых клетках. В конце эксперимента проводили эвтаназию животных в СО₂-камере с последующим отбором опухолевого материала для исследований.

Исследование лучевого воздействия проводили на ортотопических PDX АП человека 6-го пассажа (рис. 1). Облучение начинали проводить при размерах ксенографтов не менее 100 мм³, на 30-е сутки после трансплантации. Животных разделили на 5 групп (контроль, 1, 2, 3 и 4 группа) с различными режимами воздействия, по 5 особей в каждой группе. В первой группе разовая доза облучения мышей составила 4 Гр (суммарная доза 12 Гр), во 2, 3 и 4 группах режимы облучения составили 6 (18), 8 (24) и 10 (30) Гр соответственно. Эксперимент выполняли в течение 7 дней, облучение проводили в 3 приема с кратностью 1 раз. Однократное облучение проводили с использованием аппарата Xstrahl 150 (Xstrahl; UK) с фильтром 1 (Al 0,2) и аппликаторами 1,5 и 2 см.

Измерение размеров опухолевых узлов проводили с помощью штангенциркуля. Расчет объемов опухолевых узлов осуществляли по формуле Шрека для эллипсоида: V = а × b × с × π/6, где V — объем опухоли (мм³); а, b, с — максимальные диаметры эллипсоида в трех плоскостях (мм).

Степень торможения роста опухоли рассчитывали с применением показателя ТРО  по формуле:

ТРО, % = (Vконтроль – Vопыт) / Vконтроль × 100.

Гематологический анализ крови выполняли с помощью ветеринарного анализатора Exigo (BouleMedical; USA). Анализ биохимических показателей проводили на анализаторе VETSCANVS2 (Zoetis; USA).

Статистический анализ данных проводили с помощью программного пакета STATISTICA 10. Количественные переменные приводятся в виде средних величин и стандартных отклонений от среднего M ± SD. Для исследования достоверности различий средних величин для двух независимых выборок использовали критерий Манна–Уитни и критерий Уилкоксона–Манна–Уитни.

Ортотопическая трансплантация образцов опухоли в пищевод иммунодефицитной мыши

Перед хирургическим вмешательством проводили премедикацию животных препаратом на основе ксилазина гидрохлорида в дозе 20 мг/г внутримышечно. Затем через 15 мин мышей наркотизировали внутримышечно препаратом, содержащим в качестве действующих веществ тилeтaминa гидpoxлopид и зoлaзeпaмa гидрохлорид, в дозе 22,57 мг/г.

Образцы опухоли донора перед трансплантацией разделяли на фрагменты объемом примерно 27 мм³, участки некротизированной ткани заранее удаляли. Опухолевый материал трансплантировали через 30 мин после резекции. Непосредственно перед операцией кожу мыши в области рассечения обрабатывали 10% раствором повидон-йода.

Для обеспечения доступа к пищеводу выполняли рассечение кожи шеи от основания правого уха до основания левого уха. Затем тупым способом проводили выделение трахеи и лежащего под ней пищевода. С помощью скальпеля рассекали адвентициальномышечный слой пищевода. Над выполненным разрезом к стенке пищевода подшивали фрагмент опухоли с использованием лигатуры Пролен 5-0. Далее скорняжным швом при помощи лигатуры Пролен 4–0 ушивали операционную рану [23].

После того как опухолевый узел ортотопической модели достигал объема 150–250 мм³, выполняли перевивку ксенографта до 6-го пассажа описанным выше способом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Зарегистрировали увеличение степени приживления опухолевого материала у иммунодефицитных мышей с каждым последующим пассажем. При 1, 2 и 3 пассаже наблюдали 55, 70 и 80% приживления соответственно. Начиная с 4-го и до 6-го пассажа у ортотопических ксенографтов прививаемость биоматериала донора достигла 100%.

Гистологическая верификация PDX-моделей АП человека

Опухоль пациента гистологически идентифицировали как умеренно дифференцированную аденокарциному. Наряду с типичными клетками аденокарциномы в препарате обнаружили атипичные клетки веретенообразной формы с кариопикнозом и кариорексисом клеточного ядра. Гистотип ксенографтов 1-го пассажа в достаточной степени точно повторял основные характеристики опухоли-донора и был представлен также умеренно дифференцированной аденокарциномой, значительная доля клеток которой была типичной формы с дегенеративно измененными ядрами или патологическими митозами (рис. 2).

Влияние лучевого воздействия на ортотопические ксенографты АП человека

Средние объемы ксенографтов и средний вес мышей контрольной и опытных групп представлены в табл. 1. В группе 1 (4 Гр) после первого и третьего сеансов облучения наблюдали статистически значимые отличия показателей (р ≤ 0,01) средних объемов ксенографтов от показателей животных контрольной группы, не подвергавшейся облучению. При этом в опытных группах с разовой дозой облучения 6, 8 и 10 Гр средние объемы опухолевых узлов мышей статистически значимо отличались (р ≤ 0,01) от аналогичных показателей животных контрольной группы после каждой из трех процедур лучевого воздействия. В группах с разовой долей излучения в 6, 8 и 10 Гр на 7-е сутки эксперимента зафиксировали остановку роста опухоли до объемов 248,1, 227,8 и 198,9 мм³ соответственно, что существенно отличалось от объема опухолевых узлов у животных контрольной группы.

При оценке динамики веса мышей с имплантированными PDX АП человека достоверных различий во всех группах в течение всего эксперимента не зарегистрировали. Средняя масса тела животных составила от 19,7 ± 3,0 до 23,5 ± 0,5 г. Можно сделать вывод, что исследуемые дозы лучевого воздействия не повлияли на изменение массы тела мышей.

Показатель ТРО на момент окончания эксперимента в четырех опытных группах ортотопических PDX-моделей АП человека составил 46,4, 88,4, 89,3 и 90,7% соответственно (рис. 3). По результатам расчетов можно сделать вывод, что уже при суммарной дозе в 18 Гр наблюдается значительное торможение роста опухоли на моделях у мышей, и дальнейшее повышение дозы лучевого воздействия может быть неэффективным в связи с наносимым негативным воздействием на общее состояние организма животного.

На момент клинического осмотра животных из 4-й группы с суммарно полученной дозой излучения 30 Гр был замечен некроз опухоли с выделениями молочного цвета и изъявлением поверхности опухолевого узла. При этом опухолевые узлы мышей контрольной группы были значительно крупнее, бордово-синего цвета с ярко выраженной кровеносной сетью, без некротизации ткани и изъязвлений.

С помощью гистологического анализа опухолевого материала ортотопической PDX-модели АП человека после суммарной дозы облучения 30 Гр зарегистрировали трансформацию железистых опухолевых клеток без ороговений, сопровождающуюся значительной некротизацией ткани (около 50% препарата) и очагами патологического митоза. Обнаружили также клетки с карио- и цитолизисом (рис. 4).

Гематологический и биохимический профиль крови ортотопических PDX АП человека после лучевого воздействия

В ходе эксперимента мы исследовали гематологические показатели у мышей всех групп после завершения лучевой терапии (табл. 2).

Среднее содержание гемоглобина в крови животных уменьшалось по мере увеличения дозы радиации, при этом наблюдали статистически значимое отличие показателей животных групп 1–4 от показателей животных контрольной группы (p < 0,01). Общее содержание эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов в крови также уменьшилось во всех исследуемых группах. В группах 2, 3 и 4 число лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов статистически значимо отличалось (p < 0.01) от аналогичных показателей животных группы контроля. Содержание эритроцитов и лейкоцитов у мышей всех опытных групп статистически значимо отличалось (p < 0,01) от контрольных животных.

Также мы провели биохимический анализ крови иммунодефицитных мышей с ксенографтами РП (табл. 3). Концентрация белка в крови мышей 2, 3, 4 групп статистически значимо отличалась от аналогичных показателей животных контрольной группы (p < 0,01). После увеличения дозы радиации у животных наблюдали плавное повышение содержания в крови мочевины, креатинина и аланинаминотрансферазы, при этом облучение в дозе 8 и 10 Гр привело к появлению статистически значимых отличий (p < 0,01) от показателей группы мышей, не подвергшихся облучению. Данные сдвиги в биохимическом профиле крови животных опытных групп можно объяснить процессами активной некротизации опухолевых узлов под воздействием лучевой терапии. При мониторинге уровня глюкозы в крови животных статистически значимых отличий не выявлено. Содержание щелочной фосфатазы в крови мышей 1, 2, 3, и 4 групп статистически значимо отличалось (p < 0,01) от аналогичных показателей животных контрольной группы по мере увеличения дозы радиации. Снижение активности щелочной фосфатазы в данном случае можно объяснить параллельным снижением концентрации гемоглобина в крови опытных групп животных. После воздействия радиации в суммарной дозе 24 Гр изменения жизненно важных параметров крови у экспериментальных животных сопровождались снижением их активности и сутулой позой.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Особый интерес из ранее опубликованных исследований вызывает работа, в которой изучили противоопухолевый эффект фракционированной лучевой терапии (3 × 2 Гр) в сочетании с препаратом TH-302 (50 мг/кг, внутрибрюшинное введение) в отношении подкожных ксенографтов клеточных культур плоскоклеточного РП ОЕ21 и АП ОЕ19 [24]. Показана значительная задержка роста опухоли в карциномах OE19 (p = 0,02) и OE21 (p = 0,03) при комбинированном лечении TH-302 с лучевой терапией по сравнению только с лучевой терапией. Модели, полученные путем подкожной имплантации раковых клеточных линий, не обладали интратуморальной гетерогенностью клонов клеток, свойственной опухоли человека, по причине чего данные доклинических исследований могут значительно расходиться с результатами последующих клинических испытаний [12].

В другой работе показано, что комбинация PI3Kαселективного ингибитора CYH33 и радиационного излучения синергически подавляла рост подкожных ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с плоскоклеточным РП [25]. Несмотря на то, что подкожные ксенографты, созданные с использованием фрагментов человеческой опухоли, сохраняли гетерогенность клеточного состава биоматериала донора, гетеротопический сайт имплантации не позволял имитировать микроокружение опухоли человека, что препятствовало метастазированию и не воспроизводило основные сигнальные пути, задействованные в онкогенезе.

В нашей работе по исследованию эффективных доз радиационного воздействия в качестве объекта впервые была использована ортотопическая пациенто-подобная модель АП человека как наиболее приближенная к клиническому ответу донорской опухоли [26]. Это позволило нам изучить влияние лучевого воздействия на рост ксенографтов и определить его дозозависимый эффект. В ранее опубликованных исследованиях PDXмодели различных опухолей человека изучали как модели метастазирования и не использовали для оценки лучевого воздействия [27].

ВЫВОДЫ

Средние объемы опухолевых узлов PDX-моделей опытных групп с разовой дозой облучения 6, 8 и 10 Гр статистически значимо отличались (р ≤ 0,01) от аналогичных показателей группы контроля после каждой из трех процедур лучевого воздействия. При этом показатель ТРО на момент окончания эксперимента в четырех опытных группах ортотопических PDX-моделей АП человека составил 46,4, 88,4, 89,3 и 90,7% соответственно. Несмотря на отсутствие изменений веса мышей на протяжении эксперимента, общий анализ крови и анализ биохимических показателей позволяет сделать вывод о негативном дозозависимом эффекте лучевой терапии на организм животного. Суммарная доза, превышающая 18 Гр, приводила к снижению содержания гемоглобина, количества эритроцитов и лейкоцитов в крови и повышению деградации белковых молекул в процессе некротизации опухоли. Таким образом, для дальнейших исследований лучевой терапии и ее комбинации с различными противоопухолевыми субстанциями в эксперименте in vivo на мышиных моделях АП человека применение суммарных доз радиации, превышающих 18 Гр, нецелесообразно с точки зрения вреда, наносимого организму животного.