Муцины — это высокомолекулярные гликопротеины, характеризующиеся большим количеством О-связанных олигосахаридов (О-гликанов), присоединенных к белковому остову. Обычно они локализованы на поверхности эпителия, но потенциальные участки протеолитического расщепления обнаруживают в большинстве генов муцина, что объясняет их появление в системном кровотоке [1]. Основная часть циркулирующих муцинов быстро выводится с помощью рецепторов печени, распознающих гликаны. Муцины, которые не выводятся из организма и остаются в кровотоке, наиболее часто используют в качестве клинических диагностических маркеров. Одним из таких циркулирующих муцинов является MUC16, пептидный эпитоп которого известен как антиген CA125, маркер рака яичников [2]. 

CA125 известен более трех десятилетий [3]. Ряд масштабных клинических исследований был посвящен оценке потенциального использования сывороточного CA125 в качестве маркера рака яичников (РЯ). Несмотря на то, что структура эпитопа до конца не выяснена, а диагностическая точность его как маркера рака яичников ограничена [4], CA125 остается единственным клинически надежным диагностическим маркером рака яичников [5]. Важно, не оспаривая диагностическую ценность CA125, выяснить связь уровня CA125 в плазме крови с метаболическим статусом пациентов. С тех пор, как Отто Варбург открыл, что для опухолевых клеток характерно нарушение метаболизма, взгляд на рак как на метаболическое заболевание получает все большее признание [6]. Действительно, есть веские доказательства того, что повышенное потребление глюкозы и повышенная секреция лактата в опухолях способствуют их росту [7]. По мере прогрессирования опухоли увеличиваются ее биоэнергетические потребности и потребности в структурных блоках, что сказывается на системном метаболизме, изменения которого можно обнаружить в крови пациента. Таким образом, мы предполагаем, что измеренные уровни CA125 как онкомаркера будут коррелировать или «отражаться» в метаболическом профиле плазмы крови.

Основная цель данного исследования — изучить связь между измеренными уровнями CA125 и концентрациями метаболитов в плазме крови в однородной группе пациентов с клинически подтвержденным раком яичников высокой степени злокачественности.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 67 пациентов с гистологически верифицированным серозным РЯ высокой степени злокачественности (ВСЗ), от которых были получены образцы плазмы венозной крови непосредственно перед операцией до введения антибактериальных, обезболивающих и других препаратов.

Критерии включения пациентов: возраст более 18 лет; гистологическая верификация диагноза (серозный РЯ с ВСЗ I–IV стадии по FIGO, International Federation of Gynecology and Obstetrics).

Критерии невключения: возраст менее 18 лет; прием гормональных препаратов (комбинированные оральные контрацептивы, заместительная или менопаузальная гормональная терапия) в течение 6 и более месяцев; патология по данным УЗИ органов малого таза и/или указание на наличие уже выявленных репродуктивных заболеваний; пролиферативные процессы; онкологические заболевания на момент проведения исследования или в анамнезе (любой нозологии, помимо исследуемой); перенесенные оперативные вмешательства на органах малого таза; сочетание у одной пациентки новообразований различных гистотипов; беременность.

Критерии исключения: данные пересмотра гистологических микропрепаратов о гистотипе злокачественной опухоли яичников, отличающемся от серозного РЯ с ВСЗ или сопутствующем ему; первично-множественные опухолевые заболевания, не установленные на момент обращения пациента в Центр по поводу объемного образования яичников (данные о наличии были получены в период послеоперационного наблюдения).

Количественное определение опухолевого маркера СА125 в образцах крови осуществляли иммуноферментным методом.

Приготовление образцов для ЯМР-анализа 

Все химические вещества, используемые для буферных растворов, были приобретены у Sigma-Aldrich (США), за исключением тяжелой воды D2O (Cortecnet; Франция) и натриевой соли 3-(триметилсилил)пропионовой2,2,3,3-d4 кислоты (TSP) (Cambridge Isotope Laboratories Inc., Великобритания). Были приготовлены два буферных раствора. Буферный раствор A представлял собой натрийфосфатный буфер в H₂O/D2O (80/20) с pH 7,4, содержащий 6,15 ммоль/л NaN₃ и 4,64 ммоль/л TSP. Буферный раствор B представлял собой натрий-фосфатный буфер в D2O (pH 7,4), содержащий 1,5 моль/л K₂HPO₄, 2 ммоль/л NaN₃ и 4 ммоль/л TSP. 96-луночные планшеты Ritter Deepwell были приобретены у Novaveth B.V. (Нидерланды), пробирки для ЯМР — у Bruker Biospin Ltd. (Германия). Образцы плазмы размораживали при 4 °C и перемешивали, переворачивая пробирки 10 раз. Затем образцы (120 мкл) смешивали с 120 мкл буферного раствора. Для каждого образца 190 мкл смеси буфера и плазмы переносили в пятимиллиметровые пробирки с использованием модифицированной станции наполнения пробирок Gilson 215 и выдерживали при 6 °C в устройстве для смены образцов.

ЯМР-анализ и обработка спектральных данных

1H-ЯМР анализ проводили на спектрометре Bruker 700 МГц AVANCE NEO (Bruker; Германия), оснащенном пятимиллиметровой головкой криогенного зонда Prodigy. Устройство для смены образцов Bruker SampleJet (Bruker; Германия) использовали для подачи и извлечения образцов (согласно двум протоколам ЯМР: один — для образцов плазмы и один — для всех остальных образцов).

Все эксперименты выполняли при 300 К, за исключением образцов плазмы, которые анализировали при 310 К. Свежий образец 99,8%-го метанола-d4 использовали для калибровки температуры. Осевое шиммирование оптимизировалось автоматически перед каждым измерением. Продолжительность 90°-импульсов была автоматически откалибрована для каждого отдельного. Для каждого образца плазмы проводили эксперимент Карра–Парселла–Мейбума–Гилла (CPMG). Стандартную 1D-последовательность импульсов CPMG с предварительным насыщением использовали для получения T2-фильтрованных спектров. Применяли последовательность из 128 импульсов перефокусировки с задержкой отдельного спинового эха 0,6 мс, в результате чего общая задержка фильтрации T2 составила 78 мс. После применения четырех фиктивных сканирований было собрано в общей сложности 73 728 точек данных, охватывающих спектральную ширину 12 019 Гц.

Идентификация и количественное определение метаболитов

Идентификацию метаболитов проводили путем поиска по полным 1D- и 2D-данным JRES с использованием запатентованного кода Bbiorefcode (Bruker Biospin Ltd.; Германия).

Количественное определение метаболитов и гликогена в образцах крови выполняли в полуавтоматическом режиме с помощью программного обеспечения Chenomx NMR Suite 9.0 (Chenomx Inc.; Канада). Результаты полуавтоматической количественной оценки обрабатывали вручную. Концентрации рассчитывали на основании известной концентрации TSP (0,4 ммоль / л).

Анализ данных

Все данные были проанализированы в программной среде R (http://www.r-project.org/, версии R 4.1.1, 4.1.2).

Начальную обработку таблиц данных производили с помощью пакетов tidyverse (версия 1.3.1) и readxl (1.3.1). Для визуализации результатов использовали ggplot2 (версия 3.3.5) и ggforestplot (версия 0.1.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В выборку вошли 67 пациентов, из них 11 пациентов с I или II стадией и 56 пациентов — с III или IV стадией. Пациенты были сопоставимы по возрасту и индексу массы тела (ИМТ; табл. 1). Медианы возраста пациентов составили 53 (46; 59) года и 54 (49; 61) года, что сопоставимо с данными популяционных исследований [8]. Медианы ИМТ пациентов составили 24 (21; 27) кг/м2 и 25 (23; 28) кг/м².

На рис. 1 показана гистограмма уровней CA125 для исследуемой выборки в исходном (A) и логарифмическом масштабе (Б). Распределение, основанное на необработанных значениях, сильно смещено вправо (медиана — 200 ед./мл, среднее — 742,2 ед./мл); таким образом, чтобы оставаться в рамках основных допущений линейных моделей, были использованы логарифмически преобразованные значения CA125.

Чтобы получить представление о содержании метаболитов в плазме, использовали профилирование методом 1H-ЯМР, в результате чего было количественно определено 33 метаболита. В табл. 2 представлены значения их медиан и межквартильные интервалы. Чтобы расширить набор параметров, связанных с метаболическим статусом пациентов, к анализируемым данным были добавлены физиологически значимые соотношения. Эти соотношения могут быть информативны для понимания метаболизма аминокислот и ферментативных взаимопревращений (например, аланин / глутамин), глюконеогенеза (например, аланин / цитрат) и кетогенеза (например, ацетат / ацетоацетат). Все рассчитанные отношения, их медианы и межквартильный размах представлены в табл. 3.  

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Чтобы изучить связи между метаболитами и их соотношениями, были использованы модели линейной регрессии, в которых метаболиты выступали в качестве зависимой переменной, а CA125 — в качестве предиктора.

Для исключения влияния конфаундеров при построении модели были учтены показатели возраста и ИМТ пациентов. Чтобы обеспечить прямое сравнение величины ассоциаций между всеми метаболитами и их отношениями, выполнили масштабирование значений. На рис. 2 показана сводная информация по всем моделям. Данные отсортированы в порядке убывания стандартизированных значений коэффициентов. Закрашенные точки соответствуют статистически значимым ассоциациям (для статистической значимости p учтена поправка на множественное тестирование гипотез). Характеристики модели для каждой ассоциации представлены в табл. 4 и на рис. 3. Результаты указывают на то, что уровень CA125 обратно пропорционально связан с несколькими метаболитами в плазме крови (см. рис. 2). Из всех ассоциаций только наличие метанола может вызвать вопросы. Тем не менее метанол является нормальным компонентом плазмы человека [9]. Он появляется в основном как результат определенных предпочтений в диете (употребление свежих фруктов и ферментированных напитков), а также связан с некоторым вкладом микрофлоры кишечника. В нормальных условиях такие низкие или «физиологические» концентрации метанола метаболизируются в печени [10]. Отрицательная связь между метанолом и CA125 кажется противоречивой, но изменения в диетических привычках пациентов и снижение активности микробиоты на поздних стадиях онкологических заболеваний могут объяснить это наблюдение. Значимая отрицательная связь между CA125 и триметиламиноксидом, который часто интерпретируют как специфический для микробиоты метаболит [11], служит дополнительным аргументом в пользу микробиотического происхождения метанола. Установленные значимые ассоциации ряда метаболитов (глюкоза, глутамин, аланин, бетаин и серин) соответствуют изменениям в системном метаболизме на поздних стадиях рака. Механизм феномена сниженного содержания глюкозы и аминокислот (особенно глутамина и аланина) в физиологических жидкостях пациентов со злокачественными новообразованиями остается неизученным. Снижение уровня аланина по мере прогрессирования заболевания может быть объяснено его повышенным использованием в качестве основного глюконеогенного предшественника для удовлетворения высокого потребления глюкозы клетками опухоли [12].

Снижение уровня глутамина может быть связано с усилением глутаминолиза, необходимого для обеспечения предшественников для синтеза нуклеиновых кислот [12, 13]. Нет простого механистического объяснения роли бетаина в физиологии злокачественных новообразований. Тем не менее недавно проведенный метаанализ показал, что уровни бетаина снижают риск онгологических заболеваний раком [14]. Действительно, в качестве основного донора метильной группы в реакции превращения гомоцистеина в метионин бетаин играет значимую роль при патологиях, связанных с измененным системным метаболизмом гомоцистеина, фолиевой кислоты и витаминов группы B.

Несмотря на установленную статистическую значимость, модели описывают только 10–15% дисперсии данных — скорректированный R2 (табл. 4, рис. 3), что может быть объяснено размером выборки пациентов, а также неучтенными конфаундерами (особенности диеты, медикаменты).

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования были установлены статистически значимые ассоциации между измеренными уровнями эпитопа CA125 и концентрациями ряда метаболитов в плазме. Обнаруженная связь между CA125 в плазме и метаболическим составом плазмы является первым свидетельством того, что метаболом плазмы может отражать содержание циркулирующих муцинов. Это, в свою очередь, позволяет выдвинуть гипотезу о возможности включения метаболических показателей в общую оценку прогрессирования рака яичников на основе CA125. Интеграция метаболических показателей в перечень диагностических методов, используемых при раке яичников I–IV стадий, является перспективной, поскольку с момента открытия CA125 понимание биологии РЯ изменилось: опухоли классифицируют не только на основе гистологических признаков, но и на основе молекулярного фенотипа. Таким образом, в качестве следующего или параллельного шага можно предложить учитывать метаболический фенотип как отражение различных процессов, происходящих в организме пациентов с раком яичников.