Активация свободнорадикального окисления является одним из основных механизмов повреждения клетки при стрессорном воздействии на организм [1, 2], что обуславливает актуальность поиска эффективных подходов к цитопротекции при стрессе. Одним из перспективных направлений в решении обозначенной выше проблемы может быть использование пептидных молекул [3, 4]. Преимуществом применения препаратов на основе регуляторных пептидов является отсутствие у них токсичности и аллергенности при наличии широкого спектра физиологического и фармакологического действия [5]. К числу таких молекул принадлежат регуляторные пептиды из группы N-концевых аналогов адренокортикотропного гормона (АКТГ). Известно, что препарат семакс, действующей субстанцией которого является синтетический пептид АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro, у стрессированных крыс оказывает корригирующее действие на гистоархитектонику и процессы свободнорадикального окисления в печени, а также на уровень сывороточных трансаминаз [6]. Кроме того, в условиях ишемии мозга семакс оказывает нейропротективное действие за счет повышения уровня экспрессии мозгового нейротрофического фактора (BDNF) [7].

Структурно и функционально родственным семаксу пептидом является His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro (АКТГ (6-9)-Pro-Gly-Pro). Последовательность His-Phe-Arg-Trp, соответствующая участку АКТГ(6-9), является активным центром АКТГ, который взаимодействует со всеми типами меланокортиновых рецепторов (MCR), кроме MC2R [8]. При этом присоединение трипептида Pro-Gly-Pro к С-концу этой молекулы повышает ее устойчивость к действию карбоксипептидаз на фоне сохранения нейротропных эффектов. Подобно семаксу, АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro обладает широким спектром нейротропных эффектов, в т. ч. и на моделях со стрессорной нагрузкой, и в сопоставимых дозах способен проявлять более выраженную активность [9].

В связи с этим целью исследования было изучить влияние пептида АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro на процессы свободнорадикального окисления у крыс в условиях хронического иммобилизационного стресса (ХИС).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные

В опыте были использованы 55 крыс-самцов Вистар массой 280–300 г. В помещении, где содержали животных, поддерживали температуру воздуха 22 ± 2 °C, влажность 60 ± 5% и 12-часовой режим (свет с 8:00 до 20:00). Животные были обеспечены кормом и водой ad libitum. Крыс разделили на пять групп по 11 особей в каждой: 1 — интактные животные (введение физиологического раствора (ФР) без стрессирования), 2 — контрольная группа (ХИС + ФР), 3 — ХИС + АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro 5 мкг/кг, 4 — ХИС + АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro 50 мкг/кг, 5 — ХИС + АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro 500 мкг/кг.

Хронический иммобилизационный стресс

ХИС моделировали путем помещения крыс в тесные прозрачные пластиковые боксы с отверстиями для вентиляции, размер которых подбирали индивидуально под каждое животное. Животных подвергали стрессу в течение 2 ч (с 11:00 до 13:00 ч) на протяжении 14 дней (рис. 1) [10].

Пептид

В исследовании использовали N-концевой аналог

АКТГ, АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro (His-Phe-Arg-Trp-Pro-Gly-Pro), синтезированный в Институте молекулярной генетики НИЦ «Курчатовский институт» РАН, который растворяли в ФР и вводили внутрибрюшинно в дозах 5, 50 и 500 мкг/кг ежедневно за 12–15 мин. до начала каждого стрессорного воздействия в объеме из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Интактные и контрольные животные ежедневно получали эквивалентные объемы ФР. Использованные в эксперименте дозы пептида и протокол введения были выбраны в соответствии с имеющимися литературными данными об их эффективности [9, 11].

Получение сыворотки крови

Через 24 ч после заключительного стрессорного воздействия проводили эвтаназию животных путем забора крови из правого желудочка сердца после двусторонней парастернальной торакотомии под эфирным наркозом с помощью вакуумной системы S-Monovette с прокоагулянтом (SARSTEDT; Германия). Проводили забор 7,0–7,5 мл крови, положение иглы вакуумной системы оценивали визуально. Собранную кровь центрифугировали при 1500 g в течение 15 мин. Полученную сыворотку аликвотировали по 200 мкл в индивидуальные чистые микропробирки и замораживали при –20 °С, затем хранили при –80 °С для дальнейшего исследования. Перед анализом аликвоты размораживали при комнатной температуре в течение 4 ч.

Оценка интенсивности свободнорадикальных процессов и выраженности стресс-реакции

В качестве маркера окислительного повреждения клеточной ДНК был выбран метаболит нуклеиновых кислот 8-оксо-2'дезоксигуанозин (8-OHdG), который исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора DNA/RNA Oxidative Damage (High Sensitivity) ELISA Kit (589320, Cayman Chemical; США). Кроме того,  определяли концентрацию экстрацеллюлярной супероксиддисмутазы (СОД3) методом ИФА с использованием набора ELISA Kit For Superoxide Dismutase 3, Extracellular (SEA117Ra, Cloud-Clone Corp.; США) и продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), флуориметрическим методом с помощью набора TBARS (TCA Method) Assay Kit (700870, Cayman Chemical; США).

Для оценки выраженности стресс-реакции определяли содержание кортикостерона в сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием набора Corticosterone ELISA kit (ADI-900-097, Enzo Life Sciences; США).

Все исследования проводили в соответствии с протоколами производителей. Абсорбцию и флуоресценцию регистрировали и анализировали с помощью многофункционального планшетного анализатора Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific; США) и программного обеспечения SkanIt (Thermo Fisher Scientific; США).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием языка программирования R v.4.1.0 [12] в интегрированной среде разработки RStudio Desktop v. 1.4.1717 (RStudio, PBC; США; https://www.rstudio.com). Для подтверждения гипотезы о нормальности распределения применяли критерий Шапиро–Уилка, а для подтверждения гипотезы о равенстве дисперсий — критерий Левене. В случае подтверждения гипотезы для сравнения двух групп использовали t-критерий Стьюдента с поправкой Уэлча, а для четырех групп — однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) с апостериорным тестом Ньюмана–Кейлса. При отклонении применяли U-критерий Манна–Уитни для двух групп, а критерий Краскела–Уоллиса с апостериорным тестом Данна — для четырех групп. Для снижения эффекта множественных сравнений использовали поправку Бенжамини–Хохберга. Различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе исследования установлено, что ХИС приводит к развитию окислительного стресса (рис. 2). Так, на фоне ХИС отмечалось значимое повышение уровня 8-OHdG на 18,4% (p = 0,01) на фоне значимого снижения содержания СОД3 на 14,3% (p = 0,01). При этом концентрация ТБК-РП не изменялась (p = 0,43).

При этом показано, что АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro корригирует вызванный ХИС окислительный стресс. Отмечены достоверные различия уровней 8-OHdG в сыворотке (p = 0,0004) между контрольными стрессированными животными и теми, кому вводили пептид. Однако значимые различия уровня СОД3 (p = 0,2) не обнаружены.

Апостериорный анализ установил, что при введении АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro в дозах 5 и 50 мкг/кг содержание 8-OHdG в сыворотке крови значимо снижалось на 19,8% (p = 0,03) и 30% (p = 0,001) соответственно. При этом пептид, вводимый в максимальной дозе 500 мкг/кг, не влиял на уровень 8-OHdG (p = 0,72).

На основании полученных данных также установлено, что при моделировании ХИС имело место значимое повышение уровня кортикостерона на 27% (p = 0,009). Применение АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro приводило к значимым изменениям уровня гормона (p = 0,003). Проведенный апостериорный анализ показал, что АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro в дозах 5, 50 и 500 мкг/кг приводил к значимому снижению содержания кортикостерона на 34,9% (p = 0,004), 16,4% (p = 0,04) и 28,6% (p = 0,01) соответственно.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе настоящего исследования было изучено влияние пептида АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro на процессы свободнорадикального окисления у крыс в условиях ХИС. Выбор маркеров свободнорадикального окисления, использованных в исследовании, связан с их диагностическим и патофизиологическим значением. Так, 8-OHdG является надежным биомаркером генерализованного и клеточного окислительного стресса, выступающим в качестве важного индикатора окислительного повреждения мозга при остром ишемическом инсульте, атеросклероза, сердечнососудистых заболеваний, нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, а также психических расстройств, таких как шизофрения и т. д. [13]. Другим выбранным маркером окислительного стресса является малоновый диальдегид (МДА) — продукт перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот и индикатор опосредованного активными формами кислорода повреждения клеточных мембран, уровни которого измеряют посредством оценки ТБК-РП [14]. СОД является антиоксидантом первой линии, инициирующим активацию процессов защиты от активных форм кислорода [15]. Описаны три изоформы СОД, однако преобладающим антиоксидантным ферментом в сыворотке является внеклеточная СОД3, а ее роль не ограничивается только удалением радикалов, но  включает влияние на иммунные реакции и передачу клеточного сигнала [16]. В связи с этим для оценки изменений концентрации СОД3 в условиях ХИС и на фоне введения пептида в качестве надежного и специфичного метода исследования, позволяющего точно идентифицировать именно данную изоформу фермента, использовали ИФА.

В ходе исследования было показано, что ХИС привел к значимому увеличению содержания продуктов свободнорадикального окисления ДНК/РНК в сыворотке экспериментальных животных. Подобные результаты были получены в аналогичной модели хронического стресса на мышах C57BL/6J [17]. Кроме того, ХИС привел к снижению содержания СОД3. Следует отметить, что активация свободнорадикального окисления и снижение концентрации СОД3 происходили на фоне повышенного содержания в крови кортикостерона. Известно, что повышенный уровень кортикостерона сопровождается снижением активности ферментов антиоксидантной системы [18]. Таким образом, использованная в исследовании модель хронического стресса вызвала активацию процессов свободнорадикального окисления.

Было установлено, что ХИС не вызвал достоверных изменений уровня ТБК-РП. При этом в литературе имеются противоречивые данные о содержании этого маркера в сыворотке крови при продолжительном стрессорном воздействии. Так, в ряде исследований хронический стресс вызывал значимое повышение концентрации сывороточных ТБК-РП [19, 20]. Однако отмеченные изменения происходили на фоне хронического непредсказуемого стресса, характеризующегося раздражителями различной силы, в то время как нами была использована модель с монотонным стрессорным воздействием. В то же время имеются работы, в которых уровень сывороточных ТБК-РП в сходных с нашими экспериментальных условиях существенно не изменялся, несмотря на значимое повышение концентрации МДА в органах и тканях [18, 21]. Также важно отметить, что, несмотря на быстроту и простоту, флуориметрические и спектрофотометрические методы определения ТБКРП не всегда надежны в гетерогенных системах в силу способности альдегидов, отличных от МДА, генерировать производные, поглощающие свет в том же диапазоне длин волн [14]. В то же время отсутствие значимых сдвигов ТБК-РП в сыворотке крови в условиях хронического стресса также может быть связано с повышением к окончанию эксперимента активности антиоксидантных механизмов, не изученных в нашей работе. Поэтому для более полного выяснения механизмов установленных нами изменений в процессах свободнорадикального окисления необходимо в дальнейшем выполнить определение ряда дополнительных маркеров в сыворотке крови.

АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro в дозах 5 и 50 мкг/кг снизил интенсивность процессов свободнорадикального окисления, что отразилось в значимом снижении уровня 8-OHdG. В связи с этим следует отметить, что имеющий близкие с АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro структурные и функциональные свойства АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (семакс) в сопоставимых дозах оказывает цитопротективное действие на нейроны головного мозга в условиях ишемии, в частности, за счет повышения в них экспрессии BDNF [6, 22, 23]. Учитывая, что инсульт сопровождается активацией окислительного стресса [24, 25], установленная нами коррекция процессов свободнорадикального окисления при применении АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro также может иметь определенное значение в цитопротекции.

Кроме того, механизмы цитопротективных эффектов пептида могут быть связаны с модуляцией активности генов NF-κB и активацией редокс-чувствительного NRF2-сигнального пути, которые были установлены при исследовании защитного действия АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro на клетки SH-SY5Y в условиях цитотоксичности, вызванной пероксидом водорода [26].

Кроме того, известно, что гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковая ось, которая регулирует выработку и высвобождение кортизола, может увеличивать окислительный стресс за счет модуляции генерации активных форм кислорода и митохондриального кальциевого гомеостаза. При этом уровень кортизола имеет положительную корреляцию с концентрацией 8-OHdG в плазме крови [27]. Учитывая имеющуюся у АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro нейротропную активность [9], можно предположить, что его противострессорные эффекты также могут быть связаны с модуляцией стресс-реакции уже на уровне центральной нервной системы, что подтверждается установленном в настоящем исследовании одновременным снижением уровней кортизола и 8-OHdG.

Различие в эффектах АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro в зависимости от введенной дозы, в частности, отсутствие активности в максимальной использованной дозе (500 мкг/кг), характерно для регуляторных пептидов [5, 9]. Так, для меланокортинов показано, что передача сигнала с MCR осуществляется за счет взаимодействия с аденилатциклазой и активации цАМФ-сигнального пути [28]. Однако пути передачи сигнала могут зависеть от концентрации лиганда и передаваться с включением других систем вторичных мессенджеров, что может отражаться   на направленности и             выраженности эффектов. Например, сигнал с MС3R может передаваться по фосфоинозитольному пути [29], а с сигнал с MС5R — с участием Jak/STAT [30].

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование показало, что хронический (14-дневный) иммобилизационный стресс приводит к активации процессов свободнорадикального окисления у животных. Введение АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro в дозах 5 и 50 мкг/кг снижало выраженность стресс-реакции и оказывало ингибирующее влияние на стрессиндуцированные процессы свободнорадикального окисления. Результаты настоящей работы и данные других исследований эффектов N-концевых аналогов АКТГ свидетельствуют о необходимости продолжения изучения механизмов их влияния на состояние стрессиндуцированного свободнорадикального окисления с использованием комплексной оценки более широкого спектра маркеров про- и антиоксидантных систем.