Система репарации неспаренных оснований — уникальный биологический механизм восстановления повреждений ДНК, возникающих в процессе клеточного деления [1]. Работу данной системы обеспечивают белковые продукты шести ключевых генов (MSH2, MLH1, PMS2, MSH3, MSH6 и MLH3). Наследственная или спорадическая генетическая мутация или иное эпигенетическое событие (например, гиперметилирование промотера MLH1) способно инактивировать любой из генов и нарушить функционирование всего механизма [2]. Непосредственный результат данных изменений — накопление большого количества неисправленных мутаций в геноме, а также изменение длины микросателлитов (коротких последовательностей, состоящих из 2–9 пар нуклеотидов и располагающихся в эухроматиновой части генома) [3]. Следствием этого может быть сдвиг рамки считывания в кодирующей последовательности (если микросателлит располагается в интроне) с последующей инактивацией различных генов. Таким образом, нарушение работы системы репарации неспаренных оснований ДНК ведет к появлению такого фенотипического состояния генома, как микросателлитная нестабильность (MSI) [1].

Менее агрессивную природу MSI-положительных опухолей связывают с высокой скоростью мутирования, что приводит к большому уровню антигенной нагрузки, стимулирующей противоопухолевый иммунный ответ. В итоге опухоли с MSI должны лучше реагировать на иммунотерапию ингибиторами контрольных точек (ИКТ), что и было подтверждено в отношении меланомы, рака желудка и колоректального рака (КРР). Однако прогностическое значение MSI на поздних стадиях КРР (IV) остается противоречивым [4].

Таким образом, на сегодняшний день MSI является ценным предиктором ответа опухоли на иммунотерапию независимо от локализации первичной опухоли [1].

Универсальность данного маркера способствует тому, что наряду с расширением показаний для применения ИКТ, определение статуса MSI становится необходимой диагностической опцией, единогласно одобренной крупнейшими мировыми онкологическими сообществами, такими как ASCO, ESMO, NCCN, RUSSCO [2]. Так, статус MSI имеет немаловажное значение при выборе тактики ведения пациентов с КРР на ранних стадиях, что отражено в ныне действующих клинических рекомендациях по лечению данной патологии [5].

В отношении нейроэндокринных новообразований (НЭН) толстой кишки не было проведено ни одного рандомизированного клинического исследования по изучению эффективности применения иммунотерапии в различных режимах. Кроме того, распространенность MSI среди НЭН толстой кишки, в частности, и желудочнокишечного тракта (ЖКТ), в целом, недостаточно изучена, так же, как и ее влияние на прогноз.

Мы предполагаем, что НЭН толстой кишки с MSI-положительным статусом представляют собой обособленную категорию опухолей с иным клиническим течением и прогнозом. Ввиду относительной редкости НЭН толстой кишки существуют некоторые трудности с набором большой выборки пациентов. В наиболее масштабных молекулярно-генетических исследованиях НЭН толстой кишки число включенных пациентов не превышало в среднем 100 человек. Так, в одной из более ранних работ при изучении распространенности MSI в нейроэндокринных карциномах (НЭК) (n = 53) и смешанных нейроэндокринных карциномах ЖКТ (n = 36) MSI-статус был подтвержден в 12,4% случаев (11/89), в том числе в НЭК толстой кишки, желудка, двенадцатиперстной кишки [6]. Авторы выделили некоторые клинико-патологические и молекулярно-генетические особенности MSI-позитивных опухолей: MSI-позитивные карциномы демонстрировали выраженный паттерн метилирования генов (40,6% против 20,2% метилированных генов соответственно), из которых преимущественно эпигенетическим изменениям подвергались гены MLH1, p16, PAX6, PAX5, THBS1, TP73, DAPK1, MGMT, PYCARD, CDH13, HIC1 и TIMP3. При этом MSI коррелировала с наличием мутации гена BRAF [6]. Представленные результаты наглядно демонстрируют то, что MSI-статус сочетается с определенным набором молекулярных характеристик опухоли. В их изучении мы видим перспективу для дальнейшей исследовательской деятельности. Целью нашего исследования было изучить статус MSI в НЭН толстой кишки в зависимости от локализации первичной опухоли, степени дифференцировки, а также стадии заболевания.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследование было включено 29 пациентов, которые были прооперированы в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии (г. Ростов-на-Дону) в период с 2015 по 2018 г. по поводу НЭН толстой кишки. Из них мужчины — 15 человек, женщины — 14 человек, средний возраст постановки диагноза — 62,5 лет. Средний период наблюдения за пациентами составил 3,8 лет. Критерии включения в исследование: подтвержденный иммуногистохимическим методом профиль экспрессии маркеров нейроэндокринной дифференцировки (хромогранин А, синаптофизин); подписанное пациентами информированное согласие на участие в научном исследовании. Все гистологические препараты были пересмотрены согласно критериям классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2019 г.

Для работы использовали парафиновые блоки операционного материала, из которых осуществляли экстракцию ДНК. Основные этапы экстракции ДНК включали отделение 10 слайсов от массива парафинового блока, содержащего операционный биоптат опухолевой или условно нормальной ткани, с помощью микротома; депарафинизацию в ксилоле, инкубацию в лизирующем буфере в присутствии фермента протеиназы К до полного лизиса ткани (экспозиция при 58 °С в течение 6–12 ч), выделение и доочистку препарата тотальной ДНК с использованием реактива набора «ДНКсорб В» («АмплиСенс»; Россия) согласно инструкции производителя. Концентрацию ДНК измеряли флуориметрически на Qubit 2.0 (LifeTechnologies; США).

MSI определяли методом фрагментного анализа выделенной ДНК с использованием пяти мономорфных микросателлитных локусов (NR21, NR24, NR27, BAT25 и BAT26). На матрице каждой выделенной тотальной ДНК проводили пять реакций амплификации. В состав ПЦР-смеси входило: 20 мкл с 10–20 нг ДНК, 0,175 мкМ каждого праймера, 2 мМ dNTP, 15 мМ MgCl₂ и 0,5 ед. Taqполимеразы. Амплификацию проводили с соблюдением следующих условий: начальная денатурация 5 мин при 94 °C,  затем денатурация 40 циклов по 30 с при  94 °C, отжиг при 59 °C, элонгация при 72 °C и заключительная элонгация 45 с при 72 °C. Диапазон размеров ПЦРпродукта составил от 50 до 350 пн.

Флуоресцентно меченный ПЦР-продукт детектировали посредством фрагментного анализа. Для этого смешивали 1 мкл ПЦР-продуктов с 19 мкл Hi-Di формамида и 0,5 мкл GeneScan™ 600 LIZ® Size Standard (Thermo Fisher; США).

Пробы инкубировали в твердотельном термостате CH-100 (Biosan; США) в течение 5 мин при 95 °C, затем загружали в генетический анализатор ABI PRISM 3500 (Aplied Biosystems; США). Запуск осуществляли по протоколу, рекомендованному производителем. Полученные данные анализировали в GeneMapper Software (Thermo Fisher; США). Минимальный предел обнаружения пика составлял 50 относительных флуоресцентных единиц (RFU). При условии полиморфности двух и более локусов регистрировали MSI. Метилирование гена MLH1 определяли методом пиросеквенирования бисульфитконвертированной ДНК с помощью набора PyroMark Q24 CpG MLH1 согласно инструкции производителя (QIAGEN; Германия).

С помощью программного обеспечения Statsoft Statistica 10,0 (StatSoft; США) в среде операционной системы Windows 10 проводили статистическую обработку данных. Для первичной математической обработки полученных данных использовали методы описательной статистики (расчет мер центральной тенденции и мер изменчивости).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

НЭН толстой кишки были разделены по локализациям. Из них НЭН слепой кишки составили 55% (n = 16), прямой кишки — 17% (n = 5), восходящей ободочной кишки — 17% (n = 5), печеночного изгиба оболочной кишки — 7% (n = 2), аппендикса — 4% (n = 1) (рис. 1).

У большинства пациентов, включенных в исследование, была установлена III стадия заболевания (52%, n = 15) (рис. 2).

НЭК толстой кишки были диагностированы чаще других гистологических подтипов (55%, n = 16), частота их выявления была прямо пропорциональна повышению стадии заболевания. Распределение пациентов в соответствии с гистологическим подтипом НЭН и стадиями заболевания продемонстрировано ниже (рис. 3).

Микросателлитная стабильность (MSS) была подтверждена в 83% случаях (n = 24), тогда как MSIпозитивный статус — в 17% (n = 5). Все MSI-позитивные опухоли соответствовали высокодифференцированным G1 (n = 2) и G2 (n = 3) нейроэндокринным опухолям прямой кишки на I стадии.  Отметим, что микросателлитная нестабильность была определена по всем пяти тестируемым STR-локусам во всех случаях.

Уровень метилирования гена MLH1 характеризовался гиперметилированием всех образцов с MSI (Ме = 20%, диапазон 14–42%) и гипометилированием образцов с MSS-статусом (Ме = 4%, диапазон 4–14%). На основании полученных данных можно заключить, что ведущей причиной MSI-статуса в НЭН толстой кишки стало ингибирование транскрипции ключевого гена системы репарации неспаренных оснований ДНК посредством гиперметилирования его промотора. Данный механизм описан для спорадических колоректальных аденокарцином.

Распределение НЭН толстой кишки с подтвержденным статусом MSS в соответствии с локализацией и стадией заболевания продемонстрировано на рис. 4 и рис. 5.

Трехлетняя выживаемость пациентов с MSSпозитивными НЭН толстой кишки составила на II стадии 50%, на III стадии — 33%, на IV стадии — 0%. Трехлетняя выживаемость пациентов с MSI-H-позитивными НЭН прямой кишки на I стадии была равна 100%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучая распространенность микросателлитной нестабильности среди НЭН толстой кишки, нельзя не сравнить полученные данные с теми, которые на сегодняшний день представлены для колоректального рака. В недавно проведенном исследовании отечественных авторов в российской когорте пациентов с КРР (n = 359) MSI-статус был обнаружен в 6,4% случаев (23/359), причем он коррелировал с более молодым возрастом пациентов (p = 0,023), наличием первично-множественных опухолевых поражений (p = 0,0299), наличием муцинозного компонента (p < 0,0001), а также низкой степенью дифференцировки (p = 0,0025) и с правосторонней локализацией опухоли в толстой кишке (p < 0,0001) [7]. По нашим данным, все выявленные MSI-позитивные НЭН (n = 5) локализовались в прямой кишке и имели высокую степень дифференцировки.

В настоящее время для КРР четко установлена тенденция снижения частоты выявления MSI с увеличением стадии опухолевого процесса [1, 3–5]. В нашем исследовании все выявленные случаи MSI-позитивных НЭН толстой кишки соответствовали I стадии заболевания. При расширении выборки с включением достаточного числа пациентов на каждой стадии заболевания будет возможным достоверно судить о проявлении данной тенденции в отношении НЭН толстой кишки.

Ранее нами была изучена микросателлитная нестабильность в высокодифференцированных (G1/ G2) нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы. Сравнивая полученные результаты, можно утверждать, что характер MSI-статуса и частота его встречаемости среди НЭН поджелудочной железы и толстой кишки имеет некоторые различия. Так, MSI-статус был подтвержден в 14% случаев НЭН поджелудочной железы [8]. В настоящем исследовании мы получили 17% MSI-положительных НЭН толстой кишки. Кроме того, в случаях MSI-положительных нейроэндокринных опухолей поджелудочной железы не было установлено ассоциации с метилированием промотора гена MLH1, напротив, для НЭН толстой кишки MSI-позитивный статус был связан исключительно с гиперметилированием MLH1. Возможно, этот эпигенетический механизм, характерный как для аденокарцином, так и для НЭН толстой кишки, связан со специфичностью колоректального происхождения опухолей.

В контексте НЭН ЖКТ очень важен критерий дифференцировки, что нашло отражение в модернизированной классификационной системе, принятой ВОЗ в 2019 г. НЭН высокой и низкой степени дифференцировки представляют собой совершенно гетерогенные по своим генетическим характеристикам подгруппы. К тому же НЭН различного органного происхождения также различаются по набору основных молекулярных маркеров. В связи с этим остро стоит вопрос, есть ли связь между степенью дифференцировки НЭН (соответственно, НЭО и НЭК), локализацией первичной опухоли и распределением MSI. Существующие на сегодняшний день в литературе данные остаются довольно противоречивыми. Так, из 239 изученных НЭН желудочно-кишечного тракта и легких только четыре опухолевых образца (НЭО G3 поджелудочной железы (n = 1) и НЭК толстой кишки (n = 3) оказались MSI-позитивными [9]. В другом исследовании, где преобладающими локализациями первичной НЭК были желудок (n = 21) и поджелудочная железа (n = 6), ни в одном случае (n = 33) не выявлена MSI [10]. В то же время по данным метаанализа, включившего 33 ретроспективных исследования и восемь клинических сообщений, MSI в среднем встречалась в 10%  НЭК желудка и толстой кишки [11]. MSI-статус не был также подтвержден ни в одном случае высокодифференцированных НЭО прямой кишки (n = 56), тонкой кишки (n = 14), толстой кишки (n = 38) и поджелудочной железы (n = 16) [9, 12–15]. По сообщениям других авторов, MSI-статус в НЭО поджелудочной железы встречается в 10–33% случаев [9]. В нашем исследовании большинство образцов были представлены НЭК толстой кишки (55%, n = 16), однако ни в одном из них не был зарегистрирован статус MSI. В то же время, согласно литературным данным, MSI-статус НЭК толстой кишки был подтвержден в 16, 7, 10 и 14% случаев соответственно [6, 9, 17–21]. Анализируя данные литературы, можно сделать вывод о том, что частота встречаемости MSI выше среди низко дифференцированных форм НЭН. Однако результаты нашего исследования с подтверждением MSI только в высокодифференцированных G1 и G2 НЭО прямой кишки свидетельствуют об обратном. И все-таки достоверно судить о характере распределения MSI в НЭН толстой кишки будет возможным только после расширения выборки пациентов.

ВЫВОДЫ

Таким образом, при изучении частоты встречаемости микросателлитной нестабильности в НЭН толстой кишки в зависимости от степени дифференцировки опухолей, их первичной локализации и стадии заболевания было выявлено 17% MSI-позитивных образцов, все из которых соответствовали высокодифференцированным G1 и G2 НЭО с локализацией в прямой кишке на I стадии заболевания. Результаты, полученные нами при расчете трехлетней выживаемости пациентов, свидетельствуют о снижении данного показателя прямо пропорционально стадии заболевания. В настоящее время принято считать, что распространенность MSI среди НЭН соответствует таковой для аденокарцином той же органной принадлежности. Сопоставляя полученные нами данные с частотой встречаемости MSI в КРР, можно сказать, что для НЭН толстой кишки, а именно для их высокодифференцированных форм, может быть характерен больший процент MSI-положительных случаев (17% против 10–15%). В связи с этим стоит заметить, что в отличие от КРР, тестирование на MSI-статус НЭН не входит в диагностический стандарт, закрепленный действующими клиническими рекомендациями, что, по-нашему мнению, несправедливо. Полученные нами результаты позволяют с осторожным оптимизмом говорить о том, что в отношении данной категории опухолей применение новейших иммунотерапевтических препаратов могло бы быть эффективным.