Субфорникальный орган (organum subfornicum) локализован вблизи свода конечного мозга (forniх) вдоль передней стенки третьего желудочка, где занимает дорсальный конец терминальной пластинки, немного выступая в просвет третьего желудочка. Важный регулятор водносолевого обмена и энергетического баланса организма, он участвует в контроле работы сердечно-сосудистой системы и иммунной регуляции [1, 2]. Это обусловливает интерес исследователей к изучению общей структуры и клеточного состава субфорникального органа, который остается на сегодняшний день одной из самых загадочных структур мозга.

Микроглия и макрофаги являются резидентами субфорникального органа. Эти два типа клеток выполняют схожие функции, однако различаются структурно (по профилю экспрессии ряда генов и иммунофенотипу) и онтогенетически (по источнику происхождения). Важность их изучения в контексте исследований субфорникального органа определяется тем, что он относится к циркумвентрикулярным органам, для которых характерно отсутствие гемато-энцефалического барьера. Вследствие этого местные макрофаги и микроглия, в отличие от аналогичных клеток в других отделах головного мозга, находятся в постоянном контакте с циркулирующими в крови молекулами [3], что подразумевает наличие у этих клеток определенных структурно-функциональных особенностей. Еще большую актуальность изучение микроглии и макрофагов субфорникального органа приобретает в связи с его возможной вовлеченностью в течение коронавирусной инфекции. В настоящее время известно, что SARS-CoV-2 обладает сильным нейротропизмом [4]. Как полагают, хроническая активация микроглии, наблюдаемая в циркумвентрикулярных органах в норме, способствует тому, что микроглия в этих областях обладает повышенной чувствительностью и гиперактивируется в ответ на любые патологические воздействия (например, на инфицирование SARSCoV-2) [5]. Следствие гиперактивации — формирование провоспалительного фенотипа микроглии, что сопровождается активным синтезом провоспалительных медиаторов и усилением фагоцитоза. В результате, при инфицировании SARS-CoV-2 в циркумвентрикулярных органах развивается нейровоспаление, приводящее к нейродегенерации. Кроме того, активацию микроглии сопровождает увеличение ее подвижности, что приводит к миграции амебоидной микроглии в другие области мозга и способствует распространению нейровоспаления [5], что может быть одной из причин развития неврологических симптомов у пациентов с коронавирусной инфекцией.

Цель работы — изучение структурных, цитохимических и функциональных характеристик микроглии и макрофагов субфорникального органа головного мозга крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на образцах головного мозга половозрелых (3–5 месяцев) крыс-самцов породы Вистар (n = 8). Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область, Россия) и содержались в виварии при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота и свободным доступом к корму и воде. Образцы головного мозга фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде [6] и заливали в парафин (Paraffin Type 6, ThermoScientific Richard-Allan Scientific; США) по стандартной методике. С парафиновых блоков на ротационном микротоме Microm HM 325 (ThermoScientific; США) изготавливали фронтальные срезы толщиной 5 мкм, содержащие область субфорникального органа, которые наклеивали на предметные стекла с адгезивным покрытием (Menzel; Германия). После стандартной процедуры депарафинирования и регидратации срезы подвергали тепловому демаскированию в 10%-м водном растворе тиосульфата натрия в течение 23 мин [7].

Для светооптического исследования микроглии и/или макрофагов применяли кроличьи поликлональные антитела к Iba1 (Biocare medical; США) в разведении 1 : 1500 и мышиные моноклональные (клон ED1) антитела к CD68 (Abcam; Великобритания) в разведении 1 : 4000. В качестве вторичного реагента использовали набор Reveal Rabbit Specific HRP-DAB Detection System в разведении производителя (Spring Bioscience; США). Для визуализации продукта реакции применяли хромоген 3'3-диаминобензидин из набора DAB+ (Agilent; США). После проведения реакции часть срезов подкрашивали квасцовым гематоксилином.

Для иммунофлуоресцентного выявления Iba1 на срезы наносили кроличьи поликлональные антитела в разведении 1 : 1000 (Biocare medical; США). Для визуализации комплекса антиген-антитело использовали сначала Reveal Rabbit Specific HRP-DAB Detection System в разведении производителя (Spring Bioscience; США), а затем козьи антитела против HRP, конъюгированные с флуорохромом Cy3 (Cy3-conjugated AffiniPure Goat antihorseradish Peroxidase, Jackson Immuno Research; США). Для подкраски ядер клеток применяли ядерный флуоресцентный краситель SYTOX Green (InvitroGen; США).

Для постановки двойной иммунофлуоресцентной реакции Iba1/CD68 на срезы наносили смесь кроличьих поликлональных антител к Iba1 в разведении 1 : 500 (Biocare medical; США) и мышиных моноклональных антител к CD68 в разведении 1 : 1000 (Agilent; США) в соотношении 1 : 1. В качестве вторичных реагентов применяли смесь антител против иммуноглобулинов кролика, меченных биотином (из набора R&D Systems; США), и реагента EnVision+/HRP-AntiMouse (Agilent; США). После инкубации в смеси вторичных антител срезы последовательно обрабатывали раствором конъюгата стрептавидина с флуорохромом Cy2 (Jackson ImmunoResearch; США) и раствором антител против HRP, конъюгированных с флуорохромом Cy3 (Jackson Immuno Research; США).

Анализ и фотографирование препаратов проводили с использованием светового микроскопа Leica DM750 (Leica; Германия), оснащенного фотокамерой ICC50 (Leica; Германия), и конфокального лазерного микроскопа LSM800 (Zeiss; Германия). Для возбуждения флуоресценции Cy2 и SYTOX Green применяли лазер с длиной волны 488 нм, для Cy3 — 561 нм. Анализ полученных изображений проводили при помощи компьютерных программ ZEN2012 и LSM Image Browser (Zeiss; Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты иммуногистохимического выявления кальций-связывающего белка Iba1

После постановки иммуногистохимической реакции на кальций-связывающий белок Iba1, являющийся маркерным белком микроглии и макрофагов, иммунопозитивные клетки в области субфорникального органа были идентифицированы во всех исследованных образцах головного мозга (рис. 1). При анализе препаратов на малом увеличении микроскопа (×10) субфорникальный орган хорошо визуализируется и выглядит как компактное клеточное скопление, вдающееся в просвет третьего желудочка (рис. 1А, SFO). Он характеризуется высокой клеточной плотностью, выявляемой за счет подкраски ядер клеток гематоксилином (рис. 1А, SFO, синий цвет), а также высокоинтенсивной реакцией на Iba1 (рис. 1А, SFO, коричневый цвет).  Уже при малом увеличении микроскопа видно, что в субфорникальном органе присутствует большое количество Iba1-иммунопозитивных элементов, распределенных относительно равномерно в пределах органа.

При анализе области субфорникального органа и его границы с прилегающим белым веществом при большом увеличении микроскопа (×40, ×100) отмечено, что продукт иммуногистохимической реакции на Iba1 сосредоточен в отростчатых клетках (рис. 1Б–Д, коричневый цвет). Морфология выявленных клеток существенно различается. В белом веществе (рис. 1Б, WM) большинство Iba1иммунопозитивных клеток имеют веретеновидную форму, которая характеризуется присутствием двух длинных неветвящихся или слабоветвящихся отростков, отходящих от разных полюсов тела клетки в противоположных направлениях. Тела и отростки этих клеток ориентированы вдоль нервных волокон (рис. 1Б, WM, коричневый цвет). В субфорникальном органе (рис. 1Б–Д, SFO) Iba1содержащие клетки визуально более крупные по сравнению с соответствующими клетками в составе белого вещества. Они имеют более сложную архитектуру отростков и обладают высокой морфологической гетерогенностью. Среди Iba1-содержащих клеток субфорникального органа можно выделить клетки веретеновидной формы, которые характеризуются небольшим телом с отходящим от него длинным неветвящимся отростком (рис. 1В, коричневый цвет). Другой морфотип Iba1-иммунопозитивных клеток субфорникального органа характеризуется наличием относительно толстых, умеренно ветвящихся в разных направлениях отростков (рис. 1Г, коричневый цвет). Наконец, вблизи сосудов субфорникального органа были выявлены периваскулярные Iba1-иммунопозитивные малоотростчатые клетки, распластанные по периметру расширенных тонкостенных сосудов (рис. 1Д, стрелка).

Аналогичные результаты были получены при иммунофлуоресцентном выявлении Iba1 (рис. 2). В области субфорникального органа отмечено присутствие большого количества клеточных элементов, выявляемых за счет подкраски ядер клеток флуоресцентным красителем Sytox Green (рис. 2, зеленая флуоресценция). Иммунофлуоресцентное выявление Iba1, как и светооптическое исследование, продемонстрировало высокую плотность Iba1-содержащих клеток в пределах субфорникального органа (рис. 2, красная флуоресценция). При изучении этих клеток на большом увеличении микроскопа была отмечена их высокая морфологическая гетерогенность. В случае использования метода иммунофлуоресценции более контрастно (по сравнению со световой микроскопией) визуализировались тонкие отростки Iba1-содержащих клеток, что позволило описать особую субпопуляцию этих клеток, локализованную в области выстилки третьего желудочка на уровне субфорникального органа. Тела этих Iba1иммунопозитивных клеток непосредственно примыкали к клеткам выстилки и часто были распластаны вдоль нее, а тонкие отростки тянулись сквозь ряды клеток выстилки и доходили до просвета третьего желудочка мозга (рис. 2Б, стрелка).

Результаты иммуногистохимического выявления CD68

При сопоставлении результатов Iba1-иммуноокрашивания (рис. 3А) и CD68-иммуноокрашивания (рис. 3Б), выполненных на серийных срезах одного и того же случая, было отмечено, что в области субфорникального органа плотность CD68-иммунопозитивных элементов визуально существенно ниже плотности Iba1-иммунопозитивных структур. В пределах субфорникального органа визуализируются лишь единичные CD68-иммунопозитивные элементы, которые локализованы в паренхиме органа или периваскулярно. В большинстве случаев продукт иммуногистохимической реакции обнаружен в виде отдельных мелких CD68-иммунопозитивных гранул, распределенных в нервной ткани (рис. 3Б, стрелка). Лишь изредка при проведении CD68-иммуноокрашивания четко визуализируются клеточные границы. В этом случае иммунопозитивные клетки имеют овальную или вытянутую форму и выраженную гранулярность в цитоплазме (рис. 3Б, выноска).

При постановке двойной иммунофлуоресцентной реакции Iba1/CD68 было показано, что большинство присутствующих в субфорникальном органе клеток являются Iba1+/CD68‒ (рис. 3В, зеленая флуоресценция). Эти клетки имеют отростчатую форму и гетерогенную морфологию, как и Iba1-иммунопозитивные клетки, выявляемые при проведении светооптического исследования. Единичные клетки субфорникального органа содержат CD68, но не имеют Iba1, т. е. являются Iba1‒/CD68+. Форма таких клеток овальная или вытянутая, отростки не визуализируются, а цитоплазма характеризуется выраженной гранулярностью (рис. 3В; стрелка, красная флуоресценция). В некоторых CD68-иммунопозитивных клетках Iba1 присутствует в небольшом количестве, но при этом он никогда не колокализован с CD68.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Субфорникальный орган остается на сегодня одной из самых мало исследованных структур головного мозга. Основные научные результаты, связанные с его изучением, были получены в 1960–80-х гг. Тогда было показано, что субфорникальный орган имеет синаптические входы от ядра одиночного пути [8], латеральной области гипоталамуса и срединного ядра [9], и сам направляет проекции в различные центры мозга, в том числе в паравентрикулярное ядро и латеральную область гипоталамуса [10], аркуатное ядро [11], срединное преоптическое ядро [9]. В те же годы была установлена важная роль субфорникального органа в осморегуляции [12] и работе сердечно-сосудистой системы [13]. Очевидно, что все эти данные, а также сведения о клеточном составе субфорникального органа, нуждаются в проверке и уточнении с применением современных иммуноморфологических методов. В 2021 г. проведено комплексное морфологическое исследование по изучению особенностей структурно-функциональной организации разных субпопуляций нейронов и астроцитов, а также клеток сосудистого русла субфорникального органа у крысы [2], однако полностью незатронутыми остались такие важнейшие клетки, как макрофаги и микроглия.

Микроглия и тканевые макрофаги мозга осуществляют иммунную функцию, формируя первую линию защиты центральной нервной системы от различных возбудителей инфекций, способных преодолевать эндотелиальный барьер. Несмотря на схожие функции, эти клеточные популяции имеют разное происхождение [14]. В эмбриогенезе предшественники микроглии образуются во внезародышевом желточном мешке в ходе первой волны кроветворения, мигрируют в развивающийся мозг до закрытия гематоэнцефалического барьера и дифференцируются в микроглиальные клетки, формируя самоподдерживающуюся популяцию. Другие макрофагальные клетки, присутствующие в мозге (менингеальные макрофаги, периваскулярные макрофаги и макрофаги сосудистого сплетения) происходят от эритро-миелоидных клеток-предшественников и гемопоэтических стволовых клеток, которые образуются в эмбриональной печени и костном мозге в ходе второй и третьей волн кроветворения. Таким образом, в отличие от других макрофагов, дифферон микроглии лишен стадии моноцитов [15–17]. Помимо происхождения, микроглиоциты отличаются от других макрофагов мозга по ряду структурных характеристик. Так, микроглия демонстрирует низкий уровень экспрессии трансмембранной тирозинфосфатазы CD45 и уникальную экспрессию молекул P2RY12, Sall1 и Tmem119. Другие макрофаги мозга характеризуются высоким (по сравнению с микроглией) уровнем экспрессии CD45 и молекул главного комплекса гистосовместимости класса II, что предполагает важную антиген-презентирующую роль этих клеток. В отличие от микроглии, периваскулярные и менингеальные макрофаги имеют высокий уровень экспрессии молекулы CD206, известной как макрофагальный маннозный рецептор [18].

Считается, что в норме (при отсутствии патологических процессов) микроглиальные клетки характеризуются наличием многочисленных тонких ветвящихся отростков, которые осуществляют постоянный мониторинг микроокружения на наличие потенциальных угроз (так называемая наблюдающая или покоящаяся микроглия). При появлении патологического стимула микроглия переходит в активированное состояние с формированием амебоидной микроглии. При трансформации отростчатой микроглии в амебоидную происходит увеличение размеров тела клетки (за счет возрастания объема перинуклеарной цитоплазмы), укорочение и утолщение отростков. Эти изменения в морфологии микроглии соответствуют увеличению ее фагоцитарной активности и/или усилению продукции цитокинов [19, 20]. Иными словами, морфологические особенности клеток микроглии отражают функциональный статус этих клеток.

В рамках проведенного нами исследования для оценки морфофункционального состояния микроглии субфорникального органа в качестве маркера был выбран кальций-связывающий белок Iba1 (ionized calciumbinding adaptor molecule 1). На сегодня он остается наиболее широко используемым иммуногистохимическим маркером микроглии [21]. Тем не менее, Iba1 не является специфичным маркером только клеток микроглии, а выявляет также в типичных тканевых макрофагах, таких как клетки Купфера [22]. Применение антител против этого белка позволяет выявлять как покоящуюся, так и активированную микроглию, а также все промежуточные состояния [20, 23]. Равномерное распределение Iba1 в цитоплазме микроглиоцитов дает возможность максимально полно охарактеризовать структурные особенности этих клеток [24]. Все это обусловливает широкое использование Iba1 в качестве маркера для изучения этой клеточной популяции. При применении антител против Iba1 в субфорникальном органе крысы нами были выявлены многочисленные отростчатые Iba1-имунопозитивные клетки, морфологически соответствующие микроглиоцитам. Были отмечены высокая плотность клеток микроглии в субфорникальном органе и их выраженная морфологическая гетерогенность. Кроме того, по сравнению с классической покоящейся микроглией, выявленные клетки имели более толстые и короткие отростки с уменьшенным ветвлением. Классической амебоидной микроглии нами не было обнаружено ни в одном из исследованных случаев. Это позволяет заключить, что все выявленные в субфорникальном органе микроглиальные клетки имеют промежуточный статус между активированной и покоящейся микроглией, который можно охарактеризовать как предактивированное состояние.

Важно отметить, что субфорникальный орган является одним из циркумвентрикулярных органов, характерной особенностью которых служит отсутствие гематоэнцефалического барьера. Ранее признаки активации микроглии в норме были отмечены для других циркумвентрикулярных органов. Так, продемонстрировано присутствие высоко активированной микроглии в циркумвентрикулярных органах у мыши в физиологических условиях [3]. Активация микроглии в данном случае выражалась в том, что общая длина и число отростков микроглиальных клеток были значительно меньше, чем в других областях мозга, а уровень экспрессии молекулмаркеров активации, наоборот, повышен. Сильная активация микроглии в норме характерна также для области срединного возвышения головного мозга крысы [25].

Вопрос о том, чем именно обусловлена хроническая активация микроглии в циркумвентрикулярных органах, остается на сегодня открытым. Очевидно, что это связано с особенностями структурно-функциональной организации этих органов. Одной из таких особенностей является присутствие здесь капилляров фенестрированного типа, вследствие чего клетки микроглии в циркумвентрикулярных органах находятся в постоянном контакте с циркулирующими в крови молекулами (в отличие от микроглии других областей мозга, где этому препятствует гематоэнцефалический барьер). Вероятной функцией микроглии в данном случае может быть фагоцитирование нейротоксических молекул, поступающих из кровеносного русла, с целью поддержания нормального микроокружения в циркумвентрикулярных органах [3]. Еще одна возможная функция активированной микроглии — участие в структурной реорганизации этих зон. Ранее было показано, что в циркумвентрикулярных органах осуществляется интенсивный ангиогенез, сопровождающийся постоянной пролиферацией и апоптозом эндотелиальных клеток кровеносных сосудов. В свою очередь, для активированной микроглии показана способность регулировать пролиферативную активность эндотелия, а также участвовать в удалении апоптотических телец, оставшихся от погибших эндотелиальных клеток [26, 27]. Наконец, микроглия может быть вовлечена в процессы нейрогенеза, и приобретает при этом активированный морфотип. Присутствие нейрональных стволовых клеток было недавно продемонстрировано для некоторых циркумвентрикулярных органов, в том числе для субфорникального органа [28, 29]. Это позволяет предполагать возможный вклад активированной микроглии в формирование в этом органе нейрогенных ниш, что ранее было отмечено для субвентрикулярной зоны боковых желудочков и субгранулярной зоны зубчатой извилины гиппокампа [30].

Интересным наблюдением в рамках проведенного нами исследования стало описание в области выстилки субфорникального органа особых клеток микроглии, направляющих свои отростки в полость третьего желудочка. Ранее аналогичные клетки были описаны в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и обозначены как субэпендимные микроглиоциты [31]. Тесный контакт субэпендимной микроглии со спинномозговой жидкостью может указывать на контроль этими клетками ее состава.

Одной из проблем, возникающих при исследовании микроглии, является морфологическое и цитохимическое сходство этих клеток с тканевыми макрофагами мозга. Микроглия и макрофаги имеют разное происхождение, но характеризуются наличием целого ряда общих маркерных белков, среди которых и Iba1 [32]. Основываясь исключительно на результатах иммуногистохимического окрашивания на белок Iba1, однозначно разделить эти две клеточные популяции представляется затруднительным. Чтобы решить вопрос о природе Iba1-иммунопозитивных клеток, присутствующих в составе субфорникального органа, нами была дополнительно поставлена иммуногистохимическая реакция на белок CD68 (трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 110 кДа). Он присутствует в мембране эндосом и лизосом, являясь маркером фагоцитарной активности клетки. CD68 высоко экспрессирован в клетках моноцитарномакрофагального ряда, и его широко используют для иммуногистохимического выявления клеток Купфера, альвеолярных макрофагов, остеокластов, клеток Лангерганса кожи и др. [33, 34].

При использовании антител против CD68 и сопоставлении полученных результатов с Iba1иммуноокрашиванием, нами было отмечено, что в субфорникальном органе присутствуют лишь единичные CD68-содержащие клетки, морфологически схожие с макрофагами. Большинство Iba1-иммунопозитивных клеток не содержит CD68, что позволяет считать эти клетки микроглией. Отсутствие у микроглиоцитов субфорникального органа молекулы CD68 указывает на малое число лизосом у этих клеток, несмотря на наличие у них морфологических признаков активации. Вероятно, функции микроглии субфорникального органа не связаны с активным фагоцитозом, а хроническая активация этих клеток обусловлена другими их функциями, которые еще предстоит изучить. Неожиданным наблюдением оказалось то, что выявленные CD68-иммунопозитивные макрофаги характеризуются полным отсутствием (или незначительным содержанием) белка Iba1. Согласно литературным данным, Iba1 присутствует в тканевых макрофагах мозга в большом количестве, что подтверждается в том числе нашими данными, полученными при исследовании других отделов головного мозга лабораторных животных и человека [35, 36]. Вероятно, отсутствие в макрофагах субфорникального органа этого белка является цитохимической особенностью именно этой региональной клеточной популяции.

ВЫВОДЫ

Большинство Iba1-содержащих клеток субфорникального органа являются микроглиоцитами, а не макрофагами. Микроглия субфорникального органа находится в предактивированном состоянии, что может быть обусловлено структурно-функциональными особенностями этого органа и специфическими функциями местной микроглии. Среди клеток субфорникального органа присутствует особая популяция субэпендимных микроглиоцитов, отростки которых проникают в полость третьего желудочка и контактируют со спинномозговой жидкостью. Помимо микроглии в состав субфорникального органа входят единичные тканевые макрофаги, которые характеризуются высоким содержанием CD68, но незначительным количеством или отсутствием Iba1. Важность дальнейшего изучения микроглии и макрофагов определяется участием этих клеток не только в регуляции нормальной работы нервной системы, но и их вовлеченностью в развитие процессов нейровоспаления и нейродегенерации. С этой точки зрения, исследования микроглии и макрофагов представляются перспективными в контексте поиска новых мишеней для направленной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний.