ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Регенеративные эффекты пептидов Gly-His-Lys и Gly-His-Lys-D-Ala при кожной инфицированной ране

К. К. Рахметова, Е. С. Мишина, А. О. Ворвуль, И. И. Бобынцев, М. Е. Долгинцев, А. И. Бежин
Информация об авторах

Курский государственный медицинский университет, Курск

Для корреспонденции: Игорь Иванович Бобынцев
ул. К. Маркса, д. 3, г. Курск, 305041, Россия; ur.liam@gibob

Информация о статье

Вклад авторов: К. К. Рахметова — сбор материала, разработка концепции и дизайна исследования, анализ и интерпретация данных, написание рукописи; Е. С. Мишина — проведение гистологического и морфологического исследования, анализ и интерпретация данных; А. О. Ворвуль — статистическая обработка данных, написание рукописи; И. И. Бобынцев — разработка концепции и дизайна исследования, научное редактирование рукописи; М. Е. Долгинцев — анализ и интерпретация данных, написание рукописи; А. И. Бежин — разработка концепции и дизайна исследования.

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом Курского государственного медицинского университета (протокол № 1 от 16 января 2014 г.), проведено с соблюдением принципов Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных исследованиях; «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Москва, 2012).

Статья получена: 10.02.2022 Статья принята к печати: 01.03.2022 Опубликовано online: 13.04.2022
|

Одним из актуальных направлений медицины является изучение регененераторных механизмов при раневом процессе и поиск новых путей повышения эффективности заживления. Известно, что в регенерации кожи принимают активное участие все три регуляторные системы организма — нервная, эндокринная и иммунная [1, 2]. В связи с этим представляется целесообразным изучение репаративных эффектов регуляторных пептидов, обладающих физиологической полифункциональностью и оказывающих влияние на процессы роста и дифференцировки клеток [3]. В их числе — трипептид глицил-гистидил-лизин NH2-Gly-L-His-L-Lys-COOH (GHK) [46], который наряду с влиянием на процессы регенерации ткани обладает антиоксидантными, иммунотропными, противовоспалительными и нейротропными эффектами [710]. Ранее было показано ранозаживляющее действие GHK при кожных ранах, однако его выраженность была относительно невысокой [11], вероятно, вследствие высокой протеолитической активности в ране. Поэтому нами была выполнена модификация структуры GHK путем присоединения D-аланина (D-Ala) к С-концу для повышения ее устойчивости к действию протеолитических ферментов и усиления регенераторного действия.

Целью исследования было изучить эффекты пептида GHК и его структурной модификации GHК-D-Ala в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг на процессы регенерации в условиях инфицированной кожной раны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 150 крысах-самцах Вистар массой 180–240 г в возрасте 6–8 месяцев (филиал «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом световом режиме и температуре воздуха 22 ± 2 °С. Все подопытные группы включали по 10 крыс.

Инфицированную рану моделировали нанесением на выбритом от шерсти участке спины наркотизированного животного полнослойной раны площадью 250 мм2.

В работе использовали пептиды GHK и GHК-D-Ala, синтезированные в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета.

Пептиды растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрикожно (в двух точках вокруг раны, ежедневно меняя области введения по часовой стрелке на 90°) в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг в 0,1 мл через 24 ч после моделирования инфицированной раны с последующим введением той же дозы препарата каждые 24 ч на протяжении 3, 7 или 10 суток. В контрольной серии животным в аналогичные промежутки времени вводили эквивалентные объемы физиологического раствора из расчета 1 мл на 1 кг массы тела.

Животных выводили из эксперимента путем забора крови из правого желудочка сердца под эфирным наркозом, что было обусловлено необходимостью получения достаточного количества крови для дальнейших биохимических и иммунологических исследований.

После выведения животных из эксперимента для объективной оценки характера протекания раневого процесса проводили гистологическое изучение раневых аутоптатов на 3, 7 и 10 сутки от начала эксперимента. Для морфологического исследования иссекали участок раны с прилежащей интактной кожей, фиксировали в формалине и заливали  в парафин по стандартной методике. Далее с парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 7 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.

Морфологическое исследование гистологических препаратов выполняли на микроскопе Nikon Eclipse Ci (Nicon; Япония) со штатной цифровой камерой. При описании гистологических срезов оценивали выраженность воспалительной реакции, сроки образования грануляционной ткани, появление краевой эпителизации, а также структурную полноценность вновь образованного эпителия.

Морфологическую оценку течения раневого процесса проводили на основе морфометрического исследования гистологических срезов. Для этого при увеличении ×400 на определенном участке гистологического препарата в пределах раневого дефекта под лейкоцитарнофибринозным струпом проводили подсчет числа клеток фибробластического ряда, макрофагов, гранулоцитов, лимфоцитов до 100 клеток. Результаты выражали в процентах.

Для определения стадии раневого процесса и выраженности регенерации вычисляли клеточный индекс:

формула

где КИ — клеточный индекс, Фб — клетки фибробластического ряда (префибробласты, фибробласты, фиброциты), М — макрофаги, Гр — гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), Л — лимфоциты. Если КИ > 1 (> 100%), преобладают процессы регенерации, если КИ < 1 (< 100%), преобладают воспалительные процессы.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием языка программирования R v.4.1.0 [12] в интегрированной среде разработки RStudio Desktop v. 1.4.1717 (RStudio, PBC; США). Для проверки нормальности распределения применяли критерий Шапиро–Уилка (функция shapiro.test() из стандартного пакета), а равенства дисперсий — критерий Левене (функция levene.test() из пакета lawstat). В случае подтверждения гипотез для сравнения двух групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) (функция aov() из стандартного пакета) с апостериорным тестом Данетта (функция DunnettTest() из пакета DescTools), данные представляли в виде «среднее ± стандартное отклонение» (M ± SD), М и SD вычисляли с помощью функций mean() и sd() из стандартного пакета. При отклонении применяли критерий Краскела– Уоллиса (функция kruskal.test() из стандартного пакета) с апостериорным тестом Данна (функция dunn.test() из пакета dunn.test), данные представлены в виде «Медиана [нижний квартиль; верхний квартиль]» (Me[1Q; 3Q]), которые вычисляли с использованием функций median() и quantile() из стандартного пакета. Различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установлено, что данные морфологического исследования кожной раны, полученной на 3-и сутки после ее моделирования, во всех экспериментальных группах существенно не различаются. На участках повреждения четко выражен поверхностный лейкоцитарнонекротический слой. Кожный дефект заполнен полиморфноклеточной инфильтрацией с преобладанием лейкоцитов. На границе с интактной дермой отмечены признаки отека: единичные расширенные с истонченной стенкой «пустые» сосуды, набухшие волокна, образующие сеть, более густую ближе к лейкоцитарно-некротическому слою.

На 7-е сутки эксперимента в контрольной группе на участке повреждения обнаружен лейкоцитарнонекротический слой, не всегда четко отграниченный зоной инфильтрации. В нижележащих отделах отмечены начальные этапы формирования грануляционной ткани. Клеточный состав представлен нейтрофилами, гистиоцитами и лимфоцитами. При использовании пептида GHK в дозе 0,5 мкг/кг и пептида GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг лейкоцитарно-некротический слой все еще присутствует, но он значительно меньших размеров по сравнению с контролем. На участках, где этот слой отсутствует, хорошо различимы наслоения фибрина, который четко отграничен зоной инфильтрации. Нижележащая молодая соединительная ткань богата полнокровными расширенными капиллярами округлой формы. Признаки отека выражены: эндотелий капилляров умеренно истончен, межструктурные промежутки увеличены. Клеточный состав преимущественно представлен макрофагами, фибробластами и лимфоцитами. При введении животным пептида GHK в дозе 1,5 мкг/кг и пептида GHK-D-Ala в дозе 1,5 мкг/кг отмечено уменьшение признаков отека, лейкоцитарно-некротический струп отсутствует на большем протяжении. На месте поврежения видна гралуляционная ткань и тонкими коллагеновыми волокнами, однако на фоне этого присуствует круглоклеточная инфильтрация. Кроме того, в этих группах можно наблюдать начало краевой эпителизации раны в виде утолщения краевого слоя эпидермиса с сохранненой стратификацией.

На 10-е сутки эксперимента в контрольной группе продолжают преобладать воспалительные изменения. В более глубоких слоях соединительная ткань приобретает более сформированный вид, как по клеточному составу, так и по виду и качеству волокон. Сохраняется незначительная лимфоцитарная инфильтрация. На границе с гиподермой появляется сформированная зрелая соединительная ткань. В участках, прилежащих к неповрежденной коже, непосредственно на границе с дефектом заметно утолщение базального слоя эпидермиса. При этом на большем протяжении на поверхности раны располагается клеточный детрит (рисунокА).

В группе с введением пептида GHK в дозе 0,5 мкг/кг лейкоцитарно-некротический слой присутствует только в центре раны. Ниже лежащая молодая грануляционная ткань имеет расширенные капилляры округлой формы и вертикальные капилляры слабого кровенаполнения. Волокна более зрелые, чем в контроле. Признаки отека выражены незначительно. Сохраняется незначительная полиморфноклеточная инфильтрация, но преобладают клетки фибробластического ряда. Глубже появляется сформированная зрелая соединительная ткань. В участках прилежащей неповрежденной кожи непосредственно на границе с дефектом заметны утолщение слоев эпидермиса и краевое нарастание новообразованного эпителия. Эпителий имеет нарушенную стратификацию (рисунокБ).

При введении пептида GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг на 10-е сутки лейкоцитарно-некротический слой отсутствует. Нижележащая молодая соединительная ткань богата обескровленными расширенными капиллярами округлой формы. В поле зрения преобладают клетки фибробластического ряда. Заметно прорастание эпителиального лоскута на поверхности грануляционной ткани. Эпителий оформленный, за исключением рогового слоя. По сравнению с размерами дефекта прорастание эпителиального лоскута значимо, на отдельных срезах обнаружено полное покрытие дефекта эпителием. В дерме неповрежденной кожи признаки отека сохранены, но выражены меньше, чем в контроле (рисунокВ).

В группе животных, получавших пептид GHK в дозе 1,5 мкг/кг, лейкоцитарно-некротический слой все еще присутствует, хотя и заметно меньших размеров, зачастую отслаивается в процессе приготовления препарата. В таких участках четко видны наслоения фибрина. Нижележащая молодая соединительная ткань богата обескровленными расширенными капиллярами округлой формы. Прорастание эпителиального лоскута происходит по границе между лейкоцитарнонекротическим слоем и слоем молодой грануляционной ткани. Эпителий оформленный, за исключением рогового слоя. По сравнению с размерами дефекта прорастание эпителиального лоскута значимо, на отдельных срезах отмечено полное покрытие дефекта эпителием. Под эпителиальным наростом грануляционная ткань близка по строению к типичной соединительной ткани дермы (рисунокГ).

При введении пептида GHK-D-Ala в дозе 1,5 мкг/кг лейкоцитарно-некротический слой присутствует локально. В участках прилежащей неповрежденной кожи непосредственно на границе с дефектом можно наблюдать утолщение базального и зернистого слоев эпидермиса. Прорастание эпителиального лоскута происходит по границе между лейкоцитарно-некротическим слоем и более глубоко расположенной грануляционной тканью, по размеру несколько более обширное, чем в контроле. Эпителий оформленный, кроме самого дистального участка. В дерме признаки отека сохраняются, но выражены значительно меньше, чем в контроле (рисунокД).

Проведенный морфометрический анализ подтверждает смену воспалительных изменений на регенеративную фазу (см. таблица). На всех сроках эксперимента после введения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг число гранулоцитов было достоверно ниже по сравнению как с контрольной группой (в 3–5 раз; p < 0,05–0,001), так и с животными, получавшими GHK (в 3,5–7 раз; p < 0,05–0,001), что впоследствии могло отразиться в меньшей выраженности вторичной альтерации в ране и повышении эффективности репаративных процессов. После введения пептидов в дозе 1,5 мкг/кг направленность эффектов сохранялась при меньшей степени различий между пептидами. При этом показатели у животных всех подопытных групп на всех сроках эксперимента были достоверно ниже контрольных значений.

Число макрофагов в группе, получавшей GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг, на всех сроках наблюдения было достоверно выше по сравнению с контролем (p < 0,05– 0,001), а на 3-и и 10-е сутки — и в сравнении с животными, получавшими GHK. После введения пептидов в дозе 1,5 мкг/кг во всех группах по сравнению с контрольными животными происходило достоверное увеличение числа макрофагов (p < 0,05–0,001) при несколько большей выраженности эффекта при использовании GHK (p < 0,05–0,001).

Миграция клеток фибробластического ряда в место повреждения, которая отражает начало регенеративных процессов, имела наиболее выраженный характер после введения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг на всех сроках эксперимента в сравнении как с контрольной группой, так и с животными, получавшими GHK. При использовании GHKD-Ala и GHK в дозе 1,5 мкг/кг направленность эффектов сохранялась (p < 0,05–0,01) при отсутствии значительных различий между подопытными группами (p > 0,05).

Изменение числа лимфоцитов на разных сроках эксперимента в целом согласуется с динамикой перехода воспалительной реакции в регенеративную фазу. Данный переход был отмечен и по числу других исследованных видов клеток. При введении GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/ кг на 3-и сутки наблюдается их значительное увеличение относительно обеих групп сравнения (p < 0,05–0,001), тогда как на 7-е 10-е сутки направленность эффекта имела обратный характер. Введение GHK в дозе 1,5 мкг/ кг вызывало достоверно значимые сдвиги относительно контрольных значений на всех сроках эксперимента (p < 0,05–0,001). При этом эффекты GHK-D-Ala имели менее выраженный характер.

Расчет клеточного индекса показал, что наиболее выраженные регенеративные процессы на всех сроках наблюдения развивались после введения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг (p < 0,05–0,001). При использовании GHK в данной дозе существенной активации регенерации не отмечено (p > 0,05). Однако при введении GHK в дозе 1,5 мкг/кг на 7-е и 10-е сутки значения клеточного индекса свидетельствуют о преобладании регенеративных процессов и большей выраженности эффекта, чем после введения GHK-D-Ala.

Таким образом, GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг оказывает более выраженное, чем GHK, влияние на регенеративные процессы в ране. При увеличении дозы до 1,5 мкг/кг эффекты GHK-D-Ala несколько ослабевают, а эффекты GHK — возрастают. При этом наибольшие изменения показателей, свидетельствующих об активации регенеративных процессов в ране, отмечены после применения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные свидетельствуют об усилении процессов регенерации и ослаблении воспалительной реакции в условиях инфицированной кожной раны после присоединения к С-концу GHK D-аланина. В настоящее время в литературе существуют различные точки зрения на механизмы реализации данных эффектов пептида. Так, в более ранних работах GHK рассматривали как транспортную молекулу для Cu2+. Данные катионы имеют важное значение для завершенности фагоцитоза, полного очищения раны и эффективного заживления. В частности, установлено, что Cu2+ связывается N-концом GHK, взаимодействуя с глицином и гистидином [13]. В использованной в нашей работе структурной модификации трипептида N-конец оставался интактным и, следовательно, катионы Cu2+ могли взаимодействовать с указанными аминокислотами, а GHK играть роль переносчика катионов. Более поздние исследования показали возможность «самостоятельного» действия GHK за счет способности повышать прикрепление клеток к структурам внеклеточного матрикса дермы, облегчая их передвижение и стимулирование выработки важных сигнальных и структурных молекул, например, факторов роста и декорина [4, 14].

Повышение устойчивости молекулы трипептида к деградирующему действию карбоксипептидаз могло стать основным фактором, обусловившим более высокую стимуляцию регенераторных процессов в ране структурно модифицированной молекулой. Полученные данные согласуются с результатами выполненных ранее исследований, в которых было показано выраженное влияние GHK-D-Ala на фагоцитарную активность гранулоцитов и процессы перекисного окисления липидов при кожной инфицированной ране у крыс [15]. Отмеченный при этом уровень репаративной активности GHK был близок к известному из литературых данных [11].

При анализе полученных данных необходимо также учитывать использованный способ введения пептидов. Цель введения пептидов в область раны — облегчение их доступа к клеткам, участвующим в процессе регенерации. Однако пептиды могли попадать в системный кровоток и оказывать действие на другие органы и системы. В частности, при внутрибрюшинном введении в сопоставимых дозах GHK оказывал анальгетическое и анксиолитическое действие, что может способствовать ослаблению стрессорной реакции и увеличению регенераторного потенциала с учетом нейроиммунокутанных взаимодействий [2]. Однако присоединение к С-концу трипептида D-аланина нивелировало данные эффекты [16, 17]. В связи с этим обстоятельством можно предположить, что большая эффективность GHK-D-Ala в отношении репаративных процессов в ране была достигнута без участия нейротропных эффектов, описанных для GHK.

Сохранение направленности регенеративных и противовоспалительных эффектов, характерных для GHK, после применения GHK-D-Ala свидетельствует об общности их механизмов. Так, наряду с указанными выше данными литературы, известно, что GHK увеличивает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF-2) [18]. Кроме того, трипептид улучшает заживление кожных ран и стимулирует обновление кожи за счет высвобождения факторов роста из гранул тромбоцитов (трансформирующий фактор роста β, TGFβ), которые мобилизуют иммунные клетки в области повреждения [19]. Кроме того, GHK снижает продукцию фибробластами провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) и интерлейкин 6 (IL6), что приводит к снижению активности воспаления в коже и препятствует образованию гипертрофических рубцов [20].

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование показало, что присоединение D-аланина к С-концу пептида GHK способствует усилению регенеративных процессов и ослаблению воспалительной реакции при местном введении в условиях инфицированной кожной раны на 3-и, 7-е и 10-е сутки в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг. GHK-D-Ala способствовал увеличению в ране числа клеток фибробластического ряда, макрофагов на фоне уменьшения числа гранулоцитов и лимфоцитов. Результаты настоящей работы свидетельствуют о возможности разработки на основе структурных модификаций пептида GHK эффективных средств для повышения эффективности заживления при кожных раневых процессах. Необходимо продолжать изучение механизмов пептидной регуляции регенераторных процессов.

КОММЕНТАРИИ (0)