Одним из актуальных направлений медицины является изучение регененераторных механизмов при раневом процессе и поиск новых путей повышения эффективности заживления. Известно, что в регенерации кожи принимают активное участие все три регуляторные системы организма — нервная, эндокринная и иммунная [1, 2]. В связи с этим представляется целесообразным изучение репаративных эффектов регуляторных пептидов, обладающих физиологической полифункциональностью и оказывающих влияние на процессы роста и дифференцировки клеток [3]. В их числе — трипептид глицил-гистидил-лизин NH₂-Gly-L-His-L-Lys-COOH (GHK) [4–6], который наряду с влиянием на процессы регенерации ткани обладает антиоксидантными, иммунотропными, противовоспалительными и нейротропными эффектами [7–10]. Ранее было показано ранозаживляющее действие GHK при кожных ранах, однако его выраженность была относительно невысокой [11], вероятно, вследствие высокой протеолитической активности в ране. Поэтому нами была выполнена модификация структуры GHK путем присоединения D-аланина (D-Ala) к С-концу для повышения ее устойчивости к действию протеолитических ферментов и усиления регенераторного действия.

Целью исследования было изучить эффекты пептида GHК и его структурной модификации GHК-D-Ala в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг на процессы регенерации в условиях инфицированной кожной раны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 150 крысах-самцах Вистар массой 180–240 г в возрасте 6–8 месяцев (филиал «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище при 12-часовом световом режиме и температуре воздуха 22 ± 2 °С. Все подопытные группы включали по 10 крыс.

Инфицированную рану моделировали нанесением на выбритом от шерсти участке спины наркотизированного животного полнослойной раны площадью 250 мм².

В работе использовали пептиды GHK и GHК-D-Ala, синтезированные в НИИ химии Санкт-Петербургского государственного университета.

Пептиды растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрикожно (в двух точках вокруг раны, ежедневно меняя области введения по часовой стрелке на 90°) в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг в 0,1 мл через 24 ч после моделирования инфицированной раны с последующим введением той же дозы препарата каждые 24 ч на протяжении 3, 7 или 10 суток. В контрольной серии животным в аналогичные промежутки времени вводили эквивалентные объемы физиологического раствора из расчета 1 мл на 1 кг массы тела.

Животных выводили из эксперимента путем забора крови из правого желудочка сердца под эфирным наркозом, что было обусловлено необходимостью получения достаточного количества крови для дальнейших биохимических и иммунологических исследований.

После выведения животных из эксперимента для объективной оценки характера протекания раневого процесса проводили гистологическое изучение раневых аутоптатов на 3, 7 и 10 сутки от начала эксперимента. Для морфологического исследования иссекали участок раны с прилежащей интактной кожей, фиксировали в формалине и заливали  в парафин по стандартной методике. Далее с парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 7 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином.

Морфологическое исследование гистологических препаратов выполняли на микроскопе Nikon Eclipse Ci (Nicon; Япония) со штатной цифровой камерой. При описании гистологических срезов оценивали выраженность воспалительной реакции, сроки образования грануляционной ткани, появление краевой эпителизации, а также структурную полноценность вновь образованного эпителия.

Морфологическую оценку течения раневого процесса проводили на основе морфометрического исследования гистологических срезов. Для этого при увеличении ×400 на определенном участке гистологического препарата в пределах раневого дефекта под лейкоцитарнофибринозным струпом проводили подсчет числа клеток фибробластического ряда, макрофагов, гранулоцитов, лимфоцитов до 100 клеток. Результаты выражали в процентах.

Для определения стадии раневого процесса и выраженности регенерации вычисляли клеточный индекс:

формула

где КИ — клеточный индекс, Фб — клетки фибробластического ряда (префибробласты, фибробласты, фиброциты), М — макрофаги, Гр — гранулоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы), Л — лимфоциты. Если КИ > 1 (> 100%), преобладают процессы регенерации, если КИ < 1 (< 100%), преобладают воспалительные процессы.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием языка программирования R v.4.1.0 [12] в интегрированной среде разработки RStudio Desktop v. 1.4.1717 (RStudio, PBC; США). Для проверки нормальности распределения применяли критерий Шапиро–Уилка (функция shapiro.test() из стандартного пакета), а равенства дисперсий — критерий Левене (функция levene.test() из пакета lawstat). В случае подтверждения гипотез для сравнения двух групп использовали однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA) (функция aov() из стандартного пакета) с апостериорным тестом Данетта (функция DunnettTest() из пакета DescTools), данные представляли в виде «среднее ± стандартное отклонение» (M ± SD), М и SD вычисляли с помощью функций mean() и sd() из стандартного пакета. При отклонении применяли критерий Краскела– Уоллиса (функция kruskal.test() из стандартного пакета) с апостериорным тестом Данна (функция dunn.test() из пакета dunn.test), данные представлены в виде «Медиана [нижний квартиль; верхний квартиль]» (Me[1Q; 3Q]), которые вычисляли с использованием функций median() и quantile() из стандартного пакета. Различия считали значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установлено, что данные морфологического исследования кожной раны, полученной на 3-и сутки после ее моделирования, во всех экспериментальных группах существенно не различаются. На участках повреждения четко выражен поверхностный лейкоцитарнонекротический слой. Кожный дефект заполнен полиморфноклеточной инфильтрацией с преобладанием лейкоцитов. На границе с интактной дермой отмечены признаки отека: единичные расширенные с истонченной стенкой «пустые» сосуды, набухшие волокна, образующие сеть, более густую ближе к лейкоцитарно-некротическому слою.

На 7-е сутки эксперимента в контрольной группе на участке повреждения обнаружен лейкоцитарнонекротический слой, не всегда четко отграниченный зоной инфильтрации. В нижележащих отделах отмечены начальные этапы формирования грануляционной ткани. Клеточный состав представлен нейтрофилами, гистиоцитами и лимфоцитами. При использовании пептида GHK в дозе 0,5 мкг/кг и пептида GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг лейкоцитарно-некротический слой все еще присутствует, но он значительно меньших размеров по сравнению с контролем. На участках, где этот слой отсутствует, хорошо различимы наслоения фибрина, который четко отграничен зоной инфильтрации. Нижележащая молодая соединительная ткань богата полнокровными расширенными капиллярами округлой формы. Признаки отека выражены: эндотелий капилляров умеренно истончен, межструктурные промежутки увеличены. Клеточный состав преимущественно представлен макрофагами, фибробластами и лимфоцитами. При введении животным пептида GHK в дозе 1,5 мкг/кг и пептида GHK-D-Ala в дозе 1,5 мкг/кг отмечено уменьшение признаков отека, лейкоцитарно-некротический струп отсутствует на большем протяжении. На месте поврежения видна гралуляционная ткань и тонкими коллагеновыми волокнами, однако на фоне этого присуствует круглоклеточная инфильтрация. Кроме того, в этих группах можно наблюдать начало краевой эпителизации раны в виде утолщения краевого слоя эпидермиса с сохранненой стратификацией.

На 10-е сутки эксперимента в контрольной группе продолжают преобладать воспалительные изменения. В более глубоких слоях соединительная ткань приобретает более сформированный вид, как по клеточному составу, так и по виду и качеству волокон. Сохраняется незначительная лимфоцитарная инфильтрация. На границе с гиподермой появляется сформированная зрелая соединительная ткань. В участках, прилежащих к неповрежденной коже, непосредственно на границе с дефектом заметно утолщение базального слоя эпидермиса. При этом на большем протяжении на поверхности раны располагается клеточный детрит (рисунокА).

В группе с введением пептида GHK в дозе 0,5 мкг/кг лейкоцитарно-некротический слой присутствует только в центре раны. Ниже лежащая молодая грануляционная ткань имеет расширенные капилляры округлой формы и вертикальные капилляры слабого кровенаполнения. Волокна более зрелые, чем в контроле. Признаки отека выражены незначительно. Сохраняется незначительная полиморфноклеточная инфильтрация, но преобладают клетки фибробластического ряда. Глубже появляется сформированная зрелая соединительная ткань. В участках прилежащей неповрежденной кожи непосредственно на границе с дефектом заметны утолщение слоев эпидермиса и краевое нарастание новообразованного эпителия. Эпителий имеет нарушенную стратификацию (рисунокБ).

При введении пептида GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг на 10-е сутки лейкоцитарно-некротический слой отсутствует. Нижележащая молодая соединительная ткань богата обескровленными расширенными капиллярами округлой формы. В поле зрения преобладают клетки фибробластического ряда. Заметно прорастание эпителиального лоскута на поверхности грануляционной ткани. Эпителий оформленный, за исключением рогового слоя. По сравнению с размерами дефекта прорастание эпителиального лоскута значимо, на отдельных срезах обнаружено полное покрытие дефекта эпителием. В дерме неповрежденной кожи признаки отека сохранены, но выражены меньше, чем в контроле (рисунокВ).

В группе животных, получавших пептид GHK в дозе 1,5 мкг/кг, лейкоцитарно-некротический слой все еще присутствует, хотя и заметно меньших размеров, зачастую отслаивается в процессе приготовления препарата. В таких участках четко видны наслоения фибрина. Нижележащая молодая соединительная ткань богата обескровленными расширенными капиллярами округлой формы. Прорастание эпителиального лоскута происходит по границе между лейкоцитарнонекротическим слоем и слоем молодой грануляционной ткани. Эпителий оформленный, за исключением рогового слоя. По сравнению с размерами дефекта прорастание эпителиального лоскута значимо, на отдельных срезах отмечено полное покрытие дефекта эпителием. Под эпителиальным наростом грануляционная ткань близка по строению к типичной соединительной ткани дермы (рисунокГ).

При введении пептида GHK-D-Ala в дозе 1,5 мкг/кг лейкоцитарно-некротический слой присутствует локально. В участках прилежащей неповрежденной кожи непосредственно на границе с дефектом можно наблюдать утолщение базального и зернистого слоев эпидермиса. Прорастание эпителиального лоскута происходит по границе между лейкоцитарно-некротическим слоем и более глубоко расположенной грануляционной тканью, по размеру несколько более обширное, чем в контроле. Эпителий оформленный, кроме самого дистального участка. В дерме признаки отека сохраняются, но выражены значительно меньше, чем в контроле (рисунокД).

Проведенный морфометрический анализ подтверждает смену воспалительных изменений на регенеративную фазу (см. таблица). На всех сроках эксперимента после введения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг число гранулоцитов было достоверно ниже по сравнению как с контрольной группой (в 3–5 раз; p < 0,05–0,001), так и с животными, получавшими GHK (в 3,5–7 раз; p < 0,05–0,001), что впоследствии могло отразиться в меньшей выраженности вторичной альтерации в ране и повышении эффективности репаративных процессов. После введения пептидов в дозе 1,5 мкг/кг направленность эффектов сохранялась при меньшей степени различий между пептидами. При этом показатели у животных всех подопытных групп на всех сроках эксперимента были достоверно ниже контрольных значений.

Число макрофагов в группе, получавшей GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг, на всех сроках наблюдения было достоверно выше по сравнению с контролем (p < 0,05– 0,001), а на 3-и и 10-е сутки — и в сравнении с животными, получавшими GHK. После введения пептидов в дозе 1,5 мкг/кг во всех группах по сравнению с контрольными животными происходило достоверное увеличение числа макрофагов (p < 0,05–0,001) при несколько большей выраженности эффекта при использовании GHK (p < 0,05–0,001).

Миграция клеток фибробластического ряда в место повреждения, которая отражает начало регенеративных процессов, имела наиболее выраженный характер после введения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг на всех сроках эксперимента в сравнении как с контрольной группой, так и с животными, получавшими GHK. При использовании GHKD-Ala и GHK в дозе 1,5 мкг/кг направленность эффектов сохранялась (p < 0,05–0,01) при отсутствии значительных различий между подопытными группами (p > 0,05).

Изменение числа лимфоцитов на разных сроках эксперимента в целом согласуется с динамикой перехода воспалительной реакции в регенеративную фазу. Данный переход был отмечен и по числу других исследованных видов клеток. При введении GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/ кг на 3-и сутки наблюдается их значительное увеличение относительно обеих групп сравнения (p < 0,05–0,001), тогда как на 7-е 10-е сутки направленность эффекта имела обратный характер. Введение GHK в дозе 1,5 мкг/ кг вызывало достоверно значимые сдвиги относительно контрольных значений на всех сроках эксперимента (p < 0,05–0,001). При этом эффекты GHK-D-Ala имели менее выраженный характер.

Расчет клеточного индекса показал, что наиболее выраженные регенеративные процессы на всех сроках наблюдения развивались после введения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг (p < 0,05–0,001). При использовании GHK в данной дозе существенной активации регенерации не отмечено (p > 0,05). Однако при введении GHK в дозе 1,5 мкг/кг на 7-е и 10-е сутки значения клеточного индекса свидетельствуют о преобладании регенеративных процессов и большей выраженности эффекта, чем после введения GHK-D-Ala.

Таким образом, GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг оказывает более выраженное, чем GHK, влияние на регенеративные процессы в ране. При увеличении дозы до 1,5 мкг/кг эффекты GHK-D-Ala несколько ослабевают, а эффекты GHK — возрастают. При этом наибольшие изменения показателей, свидетельствующих об активации регенеративных процессов в ране, отмечены после применения GHK-D-Ala в дозе 0,5 мкг/кг.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные свидетельствуют об усилении процессов регенерации и ослаблении воспалительной реакции в условиях инфицированной кожной раны после присоединения к С-концу GHK D-аланина. В настоящее время в литературе существуют различные точки зрения на механизмы реализации данных эффектов пептида. Так, в более ранних работах GHK рассматривали как транспортную молекулу для Cu²⁺. Данные катионы имеют важное значение для завершенности фагоцитоза, полного очищения раны и эффективного заживления. В частности, установлено, что Cu²⁺ связывается N-концом GHK, взаимодействуя с глицином и гистидином [13]. В использованной в нашей работе структурной модификации трипептида N-конец оставался интактным и, следовательно, катионы Cu²⁺ могли взаимодействовать с указанными аминокислотами, а GHK играть роль переносчика катионов. Более поздние исследования показали возможность «самостоятельного» действия GHK за счет способности повышать прикрепление клеток к структурам внеклеточного матрикса дермы, облегчая их передвижение и стимулирование выработки важных сигнальных и структурных молекул, например, факторов роста и декорина [4, 14].

Повышение устойчивости молекулы трипептида к деградирующему действию карбоксипептидаз могло стать основным фактором, обусловившим более высокую стимуляцию регенераторных процессов в ране структурно модифицированной молекулой. Полученные данные согласуются с результатами выполненных ранее исследований, в которых было показано выраженное влияние GHK-D-Ala на фагоцитарную активность гранулоцитов и процессы перекисного окисления липидов при кожной инфицированной ране у крыс [15]. Отмеченный при этом уровень репаративной активности GHK был близок к известному из литературых данных [11].

При анализе полученных данных необходимо также учитывать использованный способ введения пептидов. Цель введения пептидов в область раны — облегчение их доступа к клеткам, участвующим в процессе регенерации. Однако пептиды могли попадать в системный кровоток и оказывать действие на другие органы и системы. В частности, при внутрибрюшинном введении в сопоставимых дозах GHK оказывал анальгетическое и анксиолитическое действие, что может способствовать ослаблению стрессорной реакции и увеличению регенераторного потенциала с учетом нейроиммунокутанных взаимодействий [2]. Однако присоединение к С-концу трипептида D-аланина нивелировало данные эффекты [16, 17]. В связи с этим обстоятельством можно предположить, что большая эффективность GHK-D-Ala в отношении репаративных процессов в ране была достигнута без участия нейротропных эффектов, описанных для GHK.

Сохранение направленности регенеративных и противовоспалительных эффектов, характерных для GHK, после применения GHK-D-Ala свидетельствует об общности их механизмов. Так, наряду с указанными выше данными литературы, известно, что GHK увеличивает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и фактора роста фибробластов 2 (FGF-2) [18]. Кроме того, трипептид улучшает заживление кожных ран и стимулирует обновление кожи за счет высвобождения факторов роста из гранул тромбоцитов (трансформирующий фактор роста β, TGFβ), которые мобилизуют иммунные клетки в области повреждения [19]. Кроме того, GHK снижает продукцию фибробластами провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) и интерлейкин 6 (IL6), что приводит к снижению активности воспаления в коже и препятствует образованию гипертрофических рубцов [20].

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование показало, что присоединение D-аланина к С-концу пептида GHK способствует усилению регенеративных процессов и ослаблению воспалительной реакции при местном введении в условиях инфицированной кожной раны на 3-и, 7-е и 10-е сутки в дозах 0,5 и 1,5 мкг/кг. GHK-D-Ala способствовал увеличению в ране числа клеток фибробластического ряда, макрофагов на фоне уменьшения числа гранулоцитов и лимфоцитов. Результаты настоящей работы свидетельствуют о возможности разработки на основе структурных модификаций пептида GHK эффективных средств для повышения эффективности заживления при кожных раневых процессах. Необходимо продолжать изучение механизмов пептидной регуляции регенераторных процессов.