Рак эндометрия занимает второе место по распространенности среди всех онкологических заболеваний [1]. В возрастной группе 65–69 лет показатель заболеваемости наивысший — 98,1 случай на 100 тыс. женщин соответствующего возраста. Аденокарцинома эндометрия является наиболее распространенным вариантом рака тела матки. Это гормонозависимое заболевание, которое нередко развивается на фоне пролиферативных процессов эндометрия (ППЭ) [2]. Гормональная терапия не является высокоэффективным методом лечения рака эндометрия, и ее проводят в исключительных случаях — у молодых пациенток с начальной стадией высокодифференцированного рака тела матки. При атипической гиперплазии эндометрия рекомендуется также оперативное лечение в связи с большой вероятностью развития (40–60%) сопутствующей аденокарциномы эндометрия у этих пациенток [3]. Несмотря на то что эффективность терапии гиперплазии эндометрия без атипии может достигать 100%, для достижения этого гестагенные препараты должны напрямую и длительно воздействовать на эндометрий (левоноргестерелсодержащая внутриматочная система) [4, 5]. Эффективность пероральных форм препаратов составляет 50–69% [6]. Больший ответ на гестагенную терапию в виде внутриматочной системы, вероятно, может быть связан с ее низким системным влиянием.

В поисках причины отсутствия успеха гормональной терапии ученые исследовали экспрессию про- и антиапоптотических белков, рецептивность эндометрия в целом и различия экспрессии рецепторов в железах / строме эндометрия [7–11]. Однако убедительных результатов на уровне ткани получено не было. Чувствительность ткани к гормональному влиянию была высокой, но ее системному действию не уделялось должного внимания. Нет данных о влиянии гормональной терапии ППЭ на активность иммунной системы, которая имеет принципиальное значение. Имеются сведения об отсутствии связи вида патологии эндометрия с составом иммунокомпетентных клеток, однако не оценена их функциональная активность [12].

В молекулярно-биологических исследованиях было показано, что гормональные средства (эндогенные гормоны и лекарственные препараты) влияют на функцию иммунокомпетентных клеток за счет связывания со специфичными типами рецепторов [13]. Для разных иммунокомпетентных клеток характерно преобладание определенных типов рецепторов в них [13]. Однако данные исследования проводили у здоровых доноров крови, часто без учета возраста.

Целью нашей работы было определение целесообразности и возможности назначения гормональной терапии ППЭ у пациенток в постменопаузе на основании результатов исследования экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани эндометрия, клетках МНФК, а также исследование in vitro влияния гормональных препаратов на рецепторный профиль МНФК как критерия их функциональной активности.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили с 2012 по 2021 г. на базе кафедры акушерства и гинекологии п/ф РНИМУ им. Н. И. Пирогова (ГКБ № 31). Часть материала была взята в онкогинекологическом отделении онкодиспансера № 1 г. Москвы. В исследовании участвовали 92 пациентки. Основную группу составили 55 пациенток в постменопаузе с различными вариантами ППЭ: гиперплазией эндометрия без атипии — 7, атипической гиперплазией — 8, аденокарциномой — 40 (умереннодифференцированной — 31, высокодифференцированной — 9). В группу сравнения вошли 37 больных с полипами эндометрия, в связи с их низкой пролиферативной активностью (при гистологическом исследовании верифицирован железистофиброзный полип эндометрия). При изучении экспрессии генов рецепторов в мононуклеарах периферической крови дополнительно была сформирована контрольная группа, в которую были включены 10 здоровых женщин периода постменопаузы без гинекологической патологии. Ее составили сотрудники РНИМУ Н. И. Пирогова и ГКБ № 31 без клинических проявлений ППЭ. Отсутствие патологии эндометрия и других гинекологических заболеваний было подтверждено данными УЗИ малого таза. У здоровых женщин были взяты образцы крови.   

Критерии включения пациенток: наличие патологии эндометрия по данным патоморфологического метода исследования образцов ткани эндометрия; период постменопаузы. Согласно критериям классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2014 г., гистологические препараты были верифицированы как гиперплазия эндометрия без атипии, атипическая гиперплазия эндометрия, аденокарцинома эндометрия (умереннодифференцированная, высокодифференцированная), полип эндометрия (железисто-фиброзный вариант).

Критерии исключения из исследования основной группы, группы сравнения, а также контрольной группы: прием гормональных препаратов (эстроген–гестагены, гестагены, агонисты гонадотропин-релизинг-гормона, заместительная гормональная терапия и тамоксифен) в течение 6 месяцев до проведения исследования, гинекологические заболевания (миома матки размерами более 6–7 недель беременности, опухоли яичников), воспалительные процессы различной локализации на момент взятия образцов.

Возраст пациенток, основной, контрольной и группы сравнения колебался от 53 до 80 лет, в среднем составил 64,2 ± 6,27 лет. Длительность периода постменопаузы была различной и зависела от возраста.

Причиной поступления в стационар было наличие патологии эндометрия по данным УЗИ малого таза у 60 (65,22%) пациенток. Кровяные выделения из половых путей были у 32 (34,78%) пациенток.

Из сопутствующей гинекологической патологии наиболее часто (63,04%) встречалась миома матки малых размеров в стадии регресса. Патология эндометрия в анамнезе (полипы, гиперплазия эндометрия без атипии) в различные периоды жизни диагностирована у 28,26% пациенток.

Среди экстрагенитальной патологии гипертоническая болезнь была выявлена у 80,43%, ишемическая болезнь сердца — у 72,82%, избыточный вес различной степени выраженности — у 90,2% пациенток.

Всем пациенткам проводили стандартное обследование, включая УЗИ по стандартной методике на аппарате LOGIC E9 (GE; США) с использованием внутриполостного микроконвексного датчика 4–10 МГрц. У всех наблюдаемых выявлено увеличение толщины эндометрия (М-ЭХО) более 4 мм, отмечена неоднородность эхоструктуры и наличие гиперэхогенных включений.

Гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание слизистой матки было проведено у 55 (59,78%) пациенток, из них у 16 — резекция или аблация эндометрия. Экстирпацию матки с придатками выполнили у 37 (40,22%) пациенток: лапаротомическим доступом — у 30, лапароскопическим — у 6 и влагалищным — у 1.

До проведения оперативного лечения были взяты образцы крови. Получение мононуклеаров из периферической крови осуществляли методом Boyum [14]. Биоптаты ткани эндометрия зеркально разделяли на две равные части: для проведения исследования экспрессии генов рецепторов половых стероидов и для гистологического исследования. Ткань эндометрия помещали в криопробирки Thermo scientific nunc Cryo Tube Vials 1,5 мл, маркировали и замораживали в жидком азоте. Выделение мРНК из ткани эндометрия проводили с помощью набора «Рибо-преп» (Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; Россия) согласно инструкции производителя. В ткани эндометрия и клетках МНФК исследовали экспрессию генов рецепторов эстрадиола (ERα, ERß, mER) и прогестерона (PRA, PRB, mPR, PGRmC1). Выделение мРНК, проведение реакции обратной транскрипции и анализ количества ДНК проводили стандартными методами полимеразной цепной реакции в реальном времени iCycler iQ real-time PCR (BioRad; Германия). В качестве гена сравнения использовали ген GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы).

Для оценки числа копий мРНК применяли ∆Ct метод относительного определения количества по формуле (1/2)×∆Ct, где ∆Ct = Ct(mER) – Ct(GAPDH) и 2×(–∆∆Ct), где ∆∆Ct = ∆Ct (при патологии) – ∆Ct (контрольная ткань).

Дополнительно было проведено исследование in vitro, где определяли влияние гестагенных препаратов на экспрессию генов рецепторов половых стероидных гормонов в мононуклеарах периферической крови. Для этого мононуклеары периферической крови здоровых женщин и женщин с полипами эндометрия инкубировали с прогестероном, мифепристоном (конечная концентрация в инкубационной среде составила 10^–8 М) и без использования препаратов в качестве группы контроля. После инкубирования определяли экспрессию генов рецепторов эстрадиола и прогестерона по описанной выше методике.

Определение жизнеспособности МНФК проводили методом МТТ-теста после инкубации с гестагенными препаратами [15].

В результате анализа историй болезни пациенток с ППЭ была сформирована база исследования с использованием стандартного пакета программ MicrosoftExel 7,0 (Microsoft; США) для Windows 2007 (Microsoft; США) и Numbers версия 4.3 (5046) (Apple; США) для MacBook Pro 2013 (Apple; США). При анализе результатов осуществляли сравнение качественных и количественных признаков, характерных для изучаемых групп. Статистическую обработку и построение диаграмм проводили с помощью программного пакета GraphPad Prism версия 5.0 (GraphPad Software; США) и программного пакета STATISTICA 8 (StatSoftInc; США). Обработку данных выполняли с использованием критериев Фишера и Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия с вероятностью не менее 95% или p ˂ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

По результатам проведенного исследования, экспрессия генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани эндометрия зависит от характера патологии эндометрия.

Как было опубликовано ранее [16], высокие показатели экспрессии генов рецепторов эстрадиола ERα, ERß характерны для ткани гиперплазии эндометрия и низкие — для ткани аденокарциномы эндометрия (рис. 1).

При анализе экспрессии генов ядерных рецепторов прогестерона [16] мы выявили их высокий уровень в ткани гиперплазии эндометрия с атипией и без нее (рис. 2). Уровни экспрессии PRA и PRB между группами пациенток схожи, однако различаются при сравнении показателей у пациенток с аденокарциномой и АГЭ. Мы выявили ожидаемое резкое снижение экспрессии PRA в ткани аденокарциномы ниже показателей АГЭ, однако уровень экспрессии PRB не достиг таких низких значений.

Отмечен высокий уровень экспрессии mPR в ткани ГЭ без и с атипией (рис. 3). Показатели экспрессии PGRmC1 были низкими в ткани аденокарциномы эндометрия (рис. 3).

Как опубликовано ранее [17], в МНФК мы определили высокий уровень экспрессии mER, ERα, PRA при АГЭ по сравнению со здоровыми женщинами (рис. 4). Экспрессия ERß в МНФК при аденокарциноме эндометрия была достоверно ниже показателей контрольной группы.

При сопоставлении экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона в ткани эндометрия и МНФК мы выявили совпадение профилей рецепторов ERα и PRA (рис. 1, рис. 2, рис. 4).

В исследовании in vitro инкубация МНФК здоровых женщин как с мифепристоном, так и прогестероном, увеличивала экспрессию генов рецепторов эстрадиола и прогестерона (рис. 5, рис. 6).

У пациенток с полипами эндометрия инкубация МФНК с прогестероном приводила к повышению экспрессии mER, mPR, PGRmC1. При инкубации с мифепристоном обнаружено снижение экспрессии ERα, ERß, mPR, PGRmC1, PRA, PRB.

При изучении жизнеспособности клеток методом МТТтеста при инкубации с мифепристоном мы определили, что он снижает количество живых пролиферирующих, активно продуцирующих цитокины иммуннокомпетентных клеток (p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

С целью подбора гормональной терапии пациенткам периода постменопаузы с ППЭ необходимо понимание рецепторного статуса ткани эндометрия. При низких значениях экспрессии рецепторов ответ ткани на гормональное воздействие не будет достигать терапевтических значений [4, 6, 7]. Однако у ряда пациенток периода постменопаузы отсутствует эффект от проводимой терапии и возникают рецидивы заболевания при высоком уровне экспрессии рецепторов. Причина этого не ясна, и необходимы дальнейшие исследования.

Основные рецепторы, посредством которых эстрогены реализуют свое пролиферативное действие в ткани эндометрия, — ERα и ERß [18]. При этом главную роль играет ERα. Выявленные нами высокие показатели экспрессии ERα, ERß (рис. 1) в ткани гиперплазии эндометрия с атипией и без нее могут свидетельствовать о потенциальной эффективности ингибиторов ароматазы (блок синтеза эстрогенов) у пациенток в постменопаузе.

В сравнении с показателями контрольной группы более высокий уровень экспрессии ERß в ткани гиперплазии эндометрия с атипией и без нее (рис. 1) свидетельствует об участии данного рецептора в патогенезе ППЭ. Известно, что ERß может проводить как пролиферативный, так и антипролиферативный сигнал эстрогенов. Это служит потенциальной мишенью для лекарственной терапии и обосновывает необходимость  разработки новых препаратов — селективных лигандов ERß. По литературным данным, при исследовании экспрессии ERα и ERß в ткани аденокарциномы эндометрия показана связь повышения экспрессии ERß с более агрессивными вариантами аденокарциномы эндометрия [18], что подтверждает нашу гипотезу о более важной роли  ERß в патогенезе ППЭ. Другие авторы отмечали высокий уровень экспрессии ядерных рецепторов эстрадиола в ткани гиперплазии эндометрия при исследовании методом иммуногистохимии [19]. Однако они проводились в смешанных по возрасту группах.

Выявленный нами высокий уровень экспрессии ядерных рецепторов прогестерона в ткани гиперплазии эндометрия с атипией и без нее (рис. 2) может быть компенсаторным механизмом при развитии пролиферативного процесса. Это свидетельствует о недостаточности эндогенного гестагена и патогенетически обосновывает назначение синтетических гестагенов при данной патологии эндометрия. Однако тот факт, что уровень экспрессии PRB в ткани аденокарциномы эндометрия не достиг резкого снижения, как PRA, и его уровень сопоставим с показателями экспрессии в ткани АГЭ, может отражать неравноценное участие PRA и PRB в патогенезе АГЭ, что подтверждают данные других авторов [20]. Известно, что PRВ в отсутствии PRA может способствовать пролиферации ткани [21]. В связи с этим, при преобладании экспрессии PRB в ткани гиперплазии эндометрия логично ожидать отсутствие подавляющего действия прогестерона на ткань гиперплазии эндометрия. Назначение гестагенных препаратов в этом случае может приводить либо к неэффективности терапии либо к прогрессии заболевания. Указанное требует проведения индивидуального анализа рецепторного профиля удаленной ткани эндометрия перед назначением синтетических гестагенов. При высоких показателях PRA назначение гестагенных препаратов возможно, в то время как при высоких показателях экспрессии PRB назначение гестагенов сомнительно.

Мембранный рецептор прогестерона mPR может потенцировать проведение сигнала PRB, обусловливая его эффекты, и самостоятельно способствовать прогрессии аденокарциномы эндометрия [22]. mPR и PRB реализуют пролиферативную активность гестагенов в клеткахмишенях. Следовательно, выявленный нами высокий уровень экспрессии mPR в ткани ГЭ без и с атипией (рис. 3) может быть неблагоприятным фактором наряду с высокими показателями PRB.

В ткани аденокарциномы эндометрия пониженная рецепция прогестерона (PRA, mPR, PGRmC1) объясняет низкую эффективность гормональной терапии у этих больных и согласуется с известным фактом, что назначение гормональной терапии при аденокарциноме эндометрия целесообразно после определения экспрессии рецепторов в ткани [11].

Известно, что пролиферативные процессы контролирует иммунная система. При ее нарушении процесс может принять неуправляемый характер и привести к злокачественной трансформации ткани. Доказано, что половые стероидные гормоны влияют на функцию иммунокомпетентных клеток через собственные рецепторы [13]. Однако работ, посвященных исследованию экспрессии рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК при ППЭ, нам неизвестно.

В проведенной работе мы обнаружили нарушение чувствительности МНФК к стероидам, что свидетельствует об изменении их функциональной активности, так как известно, что клеточный состав белой крови при ППЭ не меняется [12]. Кроме того, для разных видов мононуклеаров крови характерно преобладание определенных типов рецепторов [13], что позволяет нам на основании полученных результатов косвенно судить об изменении функции иммунокомпетентных клеток.

ERα является основным типом рецептора эстрадиола в моноцитах / макрофагах и Т-хелперах. Эстрадиол подавляет моноцитарно-макрофагальное и стимулирует Т-хелперное звенья иммунитета [23, 24]. Выявленные нами высокие показатели экспрессии ERα в МНФК при АГЭ (рис. 4) свидетельствуют о повышенной чувствительности клеток к подавляющему действию эстрадиола на моноцитарно-макрофагальное и стимулирующему на Т-хелперное звенья иммунитета. Подобное стимулирование Т-клеточного иммунного ответа, согласно литературным данным, приводит к активации макрофагов и стимулирует выработку провоспалительных цитокинов [23, 24], что объясняет персистенцию хронического воспалительного процесса как одного из патогенетических механизмов развития злокачественной опухоли.

В Т-киллерах, представляющих первый этап борьбы с опухолевой прогрессией, практически полностью отсутствуют ядерные рецепторы эстрадиола, но известно, что эстрогены подавляют активность Т-киллеров [24]. Указанное свидетельствует о проведении сигнала эстрогенов именно посредством мембранного рецептора mER. Следовательно, выявленное нами повышение чувствительности мононуклеаров при АГЭ (рис. 4) может способствовать сохранению клона атипических клеток в ткани эндометрия.

В МНФК PRA выявлен исключительно в натуральных киллерах и через него прогестерон подавляет секрецию цитокинов [25]. Обнаруженный нами высокий уровень экспрессии PRA в натуральных киллерах (рис. 4) потенцирует прогрессию атипической гиперплазии эндометрия.

Таким образом, при атипической гиперплазии эндометрия подавлена функция моноцитов, макрофагов, Т-лимфоцитов и натуральных киллеров. Это можно объяснить следующим образом: гиперэкспрессия рецепторов приводит к высокой чувствительности мононуклеаров к гормонам (эндогенным и фармакологическим средствам), что в свою очередь приводит к подавлению функции иммунокомпетентных клеток. В связи с указанным процесс становится неконтролируемым, что может быть причиной озлокачествления ткани АГЭ. Этим можно объяснять недостаточную эффективность (а иногда и опасность назначения) гормональной терапии пациенткам периода постменопаузы с АГЭ.

В отличие от АГЭ при аденокарциноме уровень экспрессии генов рецепторов ERα, PRA, mPR в МНФК соответсвует показателям здоровых женщин (рис. 4), что неожиданно, так как логично было бы прогрессивное снижение функции иммунитета. Представленность ERα и PRA в МНФК описана выше. Согласно литературным данным, mPR является основным типом рецепторов в Т-лимфоцитах и в моноцитах / макрофагах [26]. Следовательно, по нашим данным, рецепторный транскриптом моноцитов, макрофагов, Т-лимфоцитов и натуральных киллеров не нарушен при аденокарциноме эндометрия у пациенток в постменопаузе. Указанное может свидетельствовать об ускользании злокачественной опухоли из-под контроля иммунной системы.

Неожиданные изменения в иммунном статусе выявлены в отношении рецептора ERß (рис. 4). Данный рецептор реализует сигнал эстрогенов в В-лимфоцитах [27]. Уровень его экспрессии, по нашим данным (рис. 4), резко снижен при аденокарциноме эндометрия ниже показателей контрольной группы. Это, на наш взгляд, свидетельствует не столько о потере чувствительности опухоли к внешним сигналам (так как в этой ситуации скорее можно было бы ожидать значений экспрессии рецепторов, близких к нормальным), сколько о вторичном подавлении опухолью В-клеточного звена иммунитета.

При сопоставлении показателей экспрессии генов рецепторов в ткани эндометрия и МНФК мы выявили совпадение профилей ERα и PRA. При аденокарциноме эндометрия это может свидетельствовать о маскировании опухоли как от прямого влияния гормонов на ткань, так и от действия иммунной системы на нее. Следовательно, назначение гормональной терапии пациенткам периода постменопаузы с аденокарциномой эндометрия нецелесообразно.

При АГЭ высокий уровень экспрессии PRA (рис. 2, рис. 4) в ткани эндометрия и мононуклеарах говорит о повышенной чувствительности к гестагенам, что в случае МФНК способствует сохранению клона атипических клеток.

Таким образом, фармакологическая стратегия в лечении ППЭ у пациенток в постменопаузе должна учитывать в качестве мишени не только ткань эндометрия, но и МНФК. Назначать гормональные препараты необходимо с осторожностью, учитывая их возможное отрицательное действие на иммунокомпетентные клетки.

Для определения синтетического препарата, наиболее щадяще влияющего на иммунную систему, мы изучили относительную связывающую активность рецепторов прогестерона в МНФК с гестагенами (Р4 = 100%) и определили, что так называемые сильные гестагены (медроксипрогестерона ацетат и норэтистерон), которые используют для лечения ППЭ, в 2 раза слабее связываются с МНФК по сравнению с прогестероном (p < 0,05). Тем не менее данные препараты будут оказывать гестагенное действие на иммунокомпетентные клетки, т. е. снижать антипролиферативную активность. Поэтому в качестве перспективного лекарственного препарата для контроля этих процессов в нашем экспериментальном исследовании был выбран препарат с антигестагенным действием (мифепристон).

Мифепристон активно и хорошо связывается с рецепторами прогестерона в мононуклеарах, и его широко изучают в клинических исследованиях для лечения гормонзависимых процессов [28]. Нами был использован мифепрестон, а не более современные препараты, потому что он обладает противоопухолевой активностью и не гепатотоксичен [29], что очень важно для пациенток периода постменопаузы.

В эксперименте при изучении действия прогестерона на МНФК мы выявили, что он повышает уровень экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона у здоровых женщин и пациенток с полипами эндометрия (рис. 5, рис. 6), а значит и чувствительность к отрицательному действию половых стероидных гормонов на функцию МНФК. В других работах изучали дифференциальное влияние различных концентраций прогестерона на синтез цитокинов [30]. Полученные нами данные (мы применяли прогестерон в наномолярных концентрациях) не противоречат этим данным.

При изучении влияния мифепристона мы выявили его положительное действие на МНФК пациенток с полипами эндометрия в виде снижения экспрессии генов рецепторов ERα, ERß, mPR, PGRmC1, PRA, PRB в МНФК (рис. 5, рис. 6), что, на наш взгляд, нивелирует негативное действие половых стероидных гормонов на иммунокомпетентные клетки. Это свидетельствует о целесообразности назначения данного препарата пациенткам с патологией эндометрия с целью снижения чувствительности МНФК к подавляющему действию половых гормонов и нормализации иммунного фона. Полученные данные требуют проведения дальнейших исследований.

Выявленное нами подавляющее действие мифепристона на жизнеспособность мононуклеаров требует проведения дальнейших исследований с целью поиска препаратов, наиболее щадяще влияющих на иммунокоптетентные клетки, но в то же время снижающих повышенную экспрессию рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК.

ВЫВОДЫ

Для выбора варианта патогенетически обоснованной гормональной терапии пациенток с ППЭ в постменопаузе необходимо выяснение рецепторного статуса не только ткани эндометрия, но и мононуклеаров периферической крови пациенток с целью прогнозирования ответа ткани эндометрия и влияния на иммунокомпетентные клетки гормональной терапии. Высокий уровень мРНК PRA в ткани гиперплазии эндометрия является предиктором эффективности противорецидивной гормональной терапии гестагенными препаратами. При высоких показателях PRB гестагенотерапия может быть опасной — способной привести к непредсказуемому ответу ткани и прогрессированию пролиферации. Текущая неэффективность стандартной гестагенной гормональной терапии ППЭ, по-видимому, объясняется недооценкой ее ингибирующего влияния на иммунную систему. Перспективно дальнейшее изучение влияния гормональных препаратов на функцию МНФК и поиск препаратов, нивелирующих негативное действие половых стероидных гормонов на функцию иммунокомпетентных клеток, но не снижающих их жизнеспособность.