За последние 50 лет свыше 300 раз возникали вспышки новых или давно забытых инфекций, в том числе три коронавирусные инфекции в 2002, 2012 и 2019 г. Их появление обусловлено непосредственным контактом старого и нового биологических хозяев вируса и отсутствием соблюдения санитарно-гигиенических требований, что характерно для азиатских рынков. Коронавирусы составляют обширное семейство из 40 вирусов, семь из которых вызывают заболевания у человека. Некоторые коронавирусы, обычно заражающие животных, постепенно эволюционировали и оказались способными заражать людей. COVID-19, вероятно, является одним из таких вирусов, инфицирование которым предположительно впервые произошло на крупном оптовом рынке животных и морепродуктов в Ухане. Вспышка тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом (SARS-CoV-2), началась в 2019 г. в Китае и быстро привела к всемирной пандемии, поставившей системы здравоохранения перед необходимостью оказания интенсивной терапии огромному количеству пациентов. 

По данным исследований, в случае заражения беременные подвержены более высокому риску развития тяжелых форм COVID-19 по сравнению с другими женщинами аналогичного возраста [1]. Кроме того, заболевание COVID-19 во время беременности ассоциируется с повышенным риском преждевременных родов [1, 2]. Особенно высокому риску развития серьезных осложнений в случае заражения COVID-19 подвержены беременные женщины старшего возраста, страдающие избыточным весом или сопутствующими патологическими состояниями и заболеваниями, такими как гипертензия или диабет [3].

Встречаются сообщения о единичных случаях вертикальной передачи вируса, а также о тяжелых заболеваниях в антенатальном периоде у беременных; все они требуют дальнейшего изучения [4–7]. На сегодняшний день, по данным ВОЗ, случаев обнаружения COVID-19 в пробах околоплодной жидкости или грудного молока не отмечено. Способность активного вируса передаваться от матери плоду или новорожденному во время беременности и родов пока не установлена. Очевиден факт того, что новорожденные дети от матерей, инфицированных COVID-19, могут иметь высокий риск осложнений в раннем неонатальном периоде и отдаленные последствия для здоровья.

На сегодняшний день наиболее перспективным направлением диагностики и отдаленного прогноза заболевания выступают омиксные исследования и, в частности, изучение метаболома. Они позволяют выделить маркеры, имеющие потенциально важное значение для подтверждения инфекции, определения тяжести заболевания и возможного исхода при SARS-CoV-2. В 2020 г. удалось установить корреляцию 204 метаболитов в плазме крови пациентов с COVID-19 с тяжестью заболевания [8]. Аминокислоты являются составной частью метаболома и участвуют во всех процессах жизнедеятельности человека. При нарушении содержания тех или иных аминокислот организм не может эффективно функционировать и развиваться. Именно поэтому существуют оптимальные уровни аминокислот в организме, которые обеспечивают сбалансированные обменные процессы. Так, было показано, что концентрации аминокислот изменяются при серечно-сосудистой патологии [9], пневмонии, вызванной вирусом гриппа H1N1 [10], хронической обструктивной болезни легких [11]. Ряд патологий в неонатологии, таких как болезни накопления и другие, выявляют путем анализа аминокислот в сухой капле крови [12]. Связанные с заболеваниями изменения метаболических профилей физиологических жидкостей человеческого организма исследуют для выяснения патофизиологии целого ряда заболеваний. Например, метаболомный анализ показал, что изменение метаболизма аминокислот коррелирует с изменением гомеостаза кислорода у пациентов с COVID-19 [13]. Еще в одном исследовании аминокислотных профилей у взрослых и детей с COVID-19 выявлены изменения, которые могут быть связаны с эндотелиальной дисфункцией и нарушением регуляции Т-лимфоцитов [14, 15].

В нашем опубликованном ранее исследовании был проведен поиск прогностических маркеров COVID-19 в амниотической жидкости и пуповинной крови [16]. Целью настоящего исследования было проанализировать аминокислотный состав венозной, пуповинной крови и амниотической жидкости, отображающих систему мать– плод, и описать метаболические пути, их возможное клиническое значение и последующие потенциальные отдаленные результаты.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В. И. Кулакова (ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова») на базе первого инфекционного отделения в период с марта по май 2020 г. была создана «красная зона», где проходили лечение и обследование пациенты с диагнозом COVID-19, в том числе беременные женщины. 

В данное исследование были включены 46 беременных, которые поступили и были родоразрешены в ФБГУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова». Основную группу составили 29 пациенток c подтвержденным диагнозом COVID-19; контрольную — 17 соматически здоровых женщин с беременностью без осложнений. Диагноз COVID-19 был подтвержден с помощью ПЦР-теста («ДНК-Технология»; Россия). Включение в группу происходило по мере обращения. Критерии включения в I группу: наличие COVID-19, установленной по данным молекулярногенетического обследования (ПЦР). Критерии включения во II группу: отсутствие COVID-19 по данным клинического обследования, результатам ПЦР-исследования. Критерии исключения: многоплодная беременность, резус- и AB0изоиммунизации, хромосомные аномалии, генетические мутации и врожденные пороки развития у плода.

Для анализа были собраны венозная плазма беременных, пуповинная плазма их новорожденных детей и амниотическая жидкость. Транспортировку и последующий анализ осуществляли на территории ФБГУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова» в помещениях, сертифицированных для работы с образцами II степени опасности. В работе использовали стандартный набор и модифицированный протокол компании-производителя (JASEM; Турция) для приготовления и последующего анализа 31 аминокислоты в физиологических жидкостях. Анализ образцов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе 1260 Infinity II (Agilent; США) с детектированием на масс-спектрометре (МС) 6460 Triple Quad (Agilent; США). Транзитные переходы между родительскими ионами и дочерними фрагментами для анализируемых аминокислот, соответствующее им хроматографическее время удерживания, концентрации внутренних стандартов, а также сведения о чувствительности и воспроизводимости анализа приведены в руководстве JASEM.

Статистический анализ данных

Статистическую обработку полученных экспериментальных данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R (R Core Team; Aвстрия) в RStudio (R. RStudio, Inc.; США). Нормальность распределения количественных данных оценивали с помощью критерия Шапиро– Уилка. Для описания данных, имеющих нормальное распределение, использовали среднее арифметическое и стандартное отклонение. При распределении, отличающемся от нормального, данные представляли медианой (Me) и квартилями Q1 и Q3 в формате Me (Q1; Q3). Статистический анализ проводился с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для нормально распределенных данных и непараметрического критерия Манна–Уитни, если распределение было отличным от нормального. Величину порогового уровня значимости p-value принимали равной 0,05. Если значение p было меньше 0,001, то p-value указывали в формате p-value < 0,001. Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании аминокислотного профиля были разработаны модели логистической регрессии. В качестве независимых переменных в моделях рассматривали все возможные комбинации аминокислот. В качестве зависимой переменной выступала принадлежность пациентки к одной из исследуемых групп. Из всех разработанных моделей выбирали четыре с наибольшей величиной площади под ROC-кривой (AUC). Для каждой модели были определены критерий Уальда, 95% доверительный интервал (ДИ), отношение шансов (ОШ) и его доверительный интервал. Качество разработанных моделей оценивали с помощью ROC-анализа, а также расчета чувствительности и специфичности. В работе использовали возможности ресурса  Metabolanalyst 5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) с подключенной библиотекой путей и соединений KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Статистическую значимость метаболического пути определяли исходя из гипергеометрического теста с коррекцией по Бенджамини– Хохбергу. Влияние метаболического пути определяли оценкой вклада маркера в путь, исходя из топологического анализа и меры относительного посредничества. К путям, связанным с развитием заболевания статистически значимо, относили пути с вероятностью ложного открытия (false discovery rate, FDR) меньше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 46 женщин, из которых 29 пациенток находились в стационаре с подтвержденным диагнозом COVID-19, и 17 условно здоровых женщин, не болевших данной вирусной инфекцией (группа контроля). Клинические характеристики беременных женщин, заболевших COVID-19, представлены в табл. 1, а беременных женщин, включенных в исследование, — в табл. 2. 

Случаев COVID-19 у новорожденных зарегистрировано не было. Все новорожденные были протестированы на SARS-CoV-2 сразу после рождения, а также на третий и 10-й дни после рождения. Полученные отрицательные результаты анализов всех новорожденных могут свидетельствовать об отсутствии вертикальной передачи инфекции. Случаев перинатальной смерти не зарегистрировано.

На лабораторном этапе работы был применен метод целевой метаболомики с использованием набора для количественного определения 31 аминокислоты методом ВЭЖХ-МС в образцах венозной плазмы беременных, амниотической жидкости и плазмы пуповинной крови новорожденных детей, собранных в ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова».

На первом этапе работы был проведен анализ аминокислотного профиля венозной плазмы беременных в двух группах. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить пять аминокислот, концентрации которых статистически значимо отличались при COVID-19 (табл. П1, рис. 1): 1-метилгистидин, лизин, цистин, глутаминовая кислота и глутамин.

В связи с полученными результатами ВЭЖХ-МСанализа было интересно разработать математическую модель, позволяющую различить образцы венозной плазмы пациентов группы COVID-19 и группы контроля. Для этого были построены модели логистической регрессии на базе концентраций аминокислот. Для построения моделей использовали все возможные комбинации аминокислот. Для каждой из моделей выполнили ROC-анализ и выбрали четыре модели, характеризующиеся наибольшей площадью под ROCкривой (AUC) (рис. П1, табл. П2). 

Наибольшее значение AUC (0,78) было у модели, построенной на базе метилгистидина и цистина (табл. П3). Эта модель характеризуется чувствительностью 0,93 и специфичностью 0,94. 

При анализе амниотической жидкости была определена концентрация 31 аминокислоты. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить восемь аминокислот, концентрации которых статистически значимо различались при COVID-19 (рис. 2, табл. П4): 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, аргинин, цистатионин, цистин, глутамин, гистидин, транс-4-гидроксипролин. 

Результаты построения моделей логистической регрессии, позволяющих отличить амниотическую жидкость пациентов группы COVID-19 от таковой у группы контроля, представлены на рис. П2 и в табл. П5, П6.

Построение моделей для амниотической жидкости было аналогичным построению моделей для венозной плазмы. Наибольшее значение AUC (0,89) получено для модели, построенной на базе аргинина, цистина, гистидина и транс-4-гидроксипролина (табл. П6). Эта модель характеризуется чувствительностью 0,84 и специфичностью 0,93. Несколько более высокие значения чувствительности и специфичности (0,84 и 1 соответственно) были у модели, построенной на базе 1-метилгистидина, цистина, транс-4-гидроксипролина (табл. П6). 

На следующем этапе работы был проведен анализ аминокислотного профиля пуповинной плазмы в двух группах. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить четыре аминокислоты, концентрации которых статистически значимо различались при COVID-19 (рис. 3, табл. П7): 1-метилгистидин, бета-аланин, цистин, гистидин.

Для пуповинной плазмы были также построены модели логистической регрессии аналогично описанным ранее (рис. П3 и в табл. П8, П9). Во все построенные модели вошел цистин — очевидно, как аминокислота, содержание которой наиболее различалось между группами. Для всех моделей AUC = 1, чувствительность и специфичность равны 1 (табл. П9).

Особый интерес представляло сравнение аминокислот в амниотической жидкости, венозной и пуповинной плазме, которые статистически значимо различаются в группах контроля и COVID-19. В трех точках (амниотическая жидкость, венозная и пуповинная плазма), комплексно отображающих метаболом системы мать– плод, статистически значимо различались при COVID-19 концентрации двух аминокислот: 1-метилгистидина и цистеина. В двух точках (пуповинная и венозная плазма) статитстически значимо отличалась одна аминокислота — глутамин (табл. П10).

Принимая во внимание выявление ряда повторяющихся аминокислот в трех биологических средах, отображающих комплекс мать–плод, подтвержденное статистически, для углубленного понимания данных результатов был осуществлен математический анализ включения данных аминокислот в метаболические пути и их возможное клиническое значение для беременной, плода и последующих потенциальных отдаленных результатов.

В  работе  использовали возможности ресурса Metabolanalyst  5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/) с подключенной библиотекой путей и соединений KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Аминокислоты, концентрации которых в амниотической жидкости статистически значимо различаются у пациенток с COVID-19 и без, не приводили к статистически значимой задействованности какого-либо метаболического пути (рис. 4А, табл. П11). Аминокислоты с различающимися концентрациями в плазме пуповиной крови у пациенток с COVID-19 и без оказывают значимое влияние на метаболизм гистидина и β-аланина (рис. 4Б, табл. П12). Аминокислоты, концентрации которых различаются в плазме венозной крови, могут оказывать влияние на метаболизм d-глутамина и d-глутамата, биосинтез аргинина и метаболизм аланина, аспарата и глутамата (рис. 4В, табл. П13). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные свидетельствуют о статистически значимом различии концентраций восьми аминокислот в амниотической жидкости, пяти в венозной плазме и четырех в пуповинной плазме между пациентами с COVID-19 и в группе контроля. Стоит отметить, что концентрации восьми аминокислот были снижены у пациентов с COVID-19. Схожие изменения концентраций аминокислот были обнаружены при исследовании плазмы крови взрослых и детей с COVID-19 [14]. Авторы этой работы искали подтверждение своей гипотезе о возможном снижении концентрации аргинина при COVID-19. Известно, что эндотелиальная дисфункция играет роль в развитии повреждения легких при COVID-19 как у взрослых, так и у детей [17, 18], а низкая биодоступность аргинина связана с развитием эндотелиальной дисфункции и дисрегуляции Т-клеток [19, 20] и вносит вклад в патофизиологию множества заболеваний [21]. Действительно, у больных COVID-19 было обнаружено изменение концентрации аргинина. Кроме того, были значимо изменены и концентрации цитруллина, глутамина, аланина, глицина, гистидина, пролина и нескольких других аминокислот, однако авторы статьи затрудняются объяснить механизмы такого эффекта [14]. Снижение концентрации аминокислот было выявлено и при некоторых других патологиях [9, 11, 12, 14, 22, 23]. В нашей работе по данным анализа задействованности метаболических путей маркеров аминокислот в венозной плазме крови матерей с COVID-19 обнаружены статистически значимое изменение биосинтеза аргинина, значимое изменение путей метаболизма d-глутамина и d-глутамата и метаболизма аланина, аспарата и глутамата. Полузаменимая или условно незаменимая для человека аминокислота аргинин является одной из наиболее метаболически универсальных аминокислот и служит предшественником для синтеза мочевины, оксида азота, полиаминов, пролина, глутамата, креатина и агматина. Аргинин метаболизируется через сложный и строго регулируемый набор путей, которые остаются не до конца изученными как на уровне всего организма, так и на клеточном. Снижение концентрации аргинина в результате изменений активности аргиназы может избирательно изменять экспрессию определенных генов [24]. Нарушение экспрессии, ассоциированное с нарушением уровня аргинина в культивируемых клетках, известно уже более 40 лет [25]. 

На сегодняшний день установлено влияние аргинина на процессы регуляции и инициации экспрессии и транскрипции [26–29].

Особый интерес в нашем исследовании представляло сравнение аминокислот в амниотической жидкости, венозной и пуповинной плазме (трех средах), которые статистически значимо различаются в группах контроля и COVID-19. Значимо различались концентрации двух аминокислот: 1-метилгистидина и цистина. Одной из двух аминокислот, для которых были выявлены различия сразу в трех средах, и обладающей высокой дифференцирующей значимостью, был L-цистин. Это некодируемая аминокислота, представляющая собой продукт окислительной димеризации цистеина. В ходе посттрансляционной модификации белков она играет крайне важную роль в формировании и поддержании третичной структуры белков и пептидов и, соответственно, их биологической активности. Например, такие гормоны, как вазопрессин, окситоцин, инсулин и соматостатин приобретают биологическую активность после образования внутримолекулярных дисульфидных мостиков.

Статистически значимая разница концентрации в амниотической жидкости и плазме венозной крови матери и пуповинной крови новорожденных от матерей с COVID-19 была выявлена для L-гистидин и его производного 1-метилгистидин. 

Особый интерес представляет тот факт, что в результате нашего исследования анализ задействованности метаболических путей маркеров-аминокислот в плазме пуповинной крови новорожденных от матерей с COVID-19 также продемонстрировал статистически значимое изменение путей метаболизма гистидина и дополнительно β-аланина. 

Встречающаяся в природе β-аминокислота β-аланин образуется путем деградации дигидроурацила и карнозина. Карнозин β-аланин и родственные дипептиды предотвращают перекисное окисление в мембранных системах, что позволяет считать их водорастворимым компонентом защитной системы клетки от окислительного повреждения наравне с жирорастворимыми мембраносвязанными антиоксидантами. Установлена их роль в деактивации активных форм кислорода и ненасыщенных альдегидов в реакциях пероксидации жирных кислот, входящих в состав мембран [30]. Пролиферативное действие данных аминокислот реализуется, скорее всего, только в мышечной и нервной тканях, состоящих из неделящихся клеток, и для них характерен самый сильный окислительный метаболизм. Можно предположить, что в добавление к известным активностям по отношению к мышечной ткани данные аминокислоты могут способствовать регенеративному ответу и стимулируют пролиферацию нормальных (неопухолевых) клеток человека.

Статистически значимая возможность влияния аминокислот с различающимися между исследуемыми группами концентрациями на метаболизм гистидина может демонстрировать связь между путем превращения гистидина с его декарбоксилированием и образованием гистамина и COVID-19 во время беременности.

Одна из 20 протеиногенных аминокислот, гетероциклическая α-аминокислота L-гистидин является одной из двух условно незаменимых аминокислот (наряду с аргинином). Первоначально считалось, что она незаменима только для детей. Остаток гистидина входит в состав активных центров множества ферментов. Гистидин является предшественником в биосинтезе гистамина. Гистамин играет важную роль в процессе воспаления и развития некоторых аллергических реакций. Гистидин способствует росту и восстановлению тканей, участвует в синтезе эритроцитов и лейкоцитов и в формировании миелиновых оболочек нервных клеток. Нехватка гистидина может ослабить слух, вызвать дегенеративные заболевания, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера.

Наши результаты показали, что вирус может вызывать выраженные изменения в метаболоме амниотической жидкости и плазме пуповинной и венозной крови, что чревато риском нарушения программирования производства белковых молекул на всех уровнях системы мать–плод. При этом COVID-19 может никак не проявлять себя при рождении. Изменения метаболических процессов путем нарушения необходимого соотношения аминокислот на территории плода могут быть связаны с репликацией вируса, воспалительной реакцией хозяина и изменениями энергетического метаболизма, нарушением регуляции экспрессии и транскрипции белковых молекул. Оценка отдаленных последствий внутриутробного опосредованного воздействия COVID-19 на ребенка является важной задачей и приоритетным направлением последующих научных исследований.

ВЫВОДЫ

В данном исследовании мы использовали методы целевой метаболомики для обнаружения изменений концентрации аминокислот беременных, инфицированных COVID-19 в момент госпитализации. Обнаружено, что концентрации восьми аминокислот в амниотической жидкости (1-метилгистидин, 3-метилгистидин, аргинин, цистатионин, цистин, глутамин, гистидин, транс-4-гидроксипролин), пяти аминокислот в венозной плазме матерей (1-метилгистидин, лизин, цистин, глутаминацид и глутамин) и четырех аминокислот в пуповинной плазме (1-метилгистидин, β-аланин, цистин, гистидин) статистически значимо различаются между группой пациентов, инфицированных COVID-19, и контрольной группой. Нарушение метаболизма выявленных аминокислот проявляется при ряде серьезных патологий, таких как острый респираторный дистресс-синдром у пациентов с тяжелым сепсисом, пневмония при гриппе H1N1, бактериальная пневмония, серповидноклеточная анемия, талассемия, малярия, острая астма, муковисцидоз, легочная гипертензия, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые виды рака и др. По данным анализа задействованности метаболических путей маркеров-аминокислот в венозной и пуповинной плазме крови матерей и новорожденных в группе с COVID-19 обнаружено статистически значимое изменение биосинтеза и путей метаболизма ряда аминокислот, задействованных в реализации воспалительной реакции, изменений энергетического метаболизма, нарушений регуляции экспрессии и транскрипции белковых молекул и пр. Эти результаты могут быть использованы для дальнейших исследований возможных последствий для здоровья новорожденных COVID-19 у их матерей и определения требований к лечению и медицинской помощи беременным женщинам и новорожденным после постановки диагноза COVID-19, так как отдаленные последствия для здоровья данной когорты новорожденных могут включать в себя эндокринные, нервные и аллергические расстройства, обусловленные метаболомными нарушениями программирования производства белковых молекул в антенатальном периоде.