Рак легких занимает первое место, как в мире, так и в России по смертности населения от онкологической патологии [1].

До сих пор идет поиск дополнительных параметров прогноза течения рака легкого и продолжается изучение вопросов канцерогенеза новообразований данной локализации. С этой точки зрения представляется перспективным изучение состояния бронхиального эпителия у пациентов, страдающих раком легкого, поскольку именно бронхиальный эпителий в этой группе больных является основной точкой канцерогенных воздействий.

Ранее сообщалось о значении исследования гиперпластических процессов в мелких бронхах, располагающихся на некотором отдалении от первичной опухоли, в связи с тем, что уже при гиперплазии бронхиального эпителия в клетках имеются генетические изменения, имеющие существенное значение в канцерогенезе и реализующиеся в последующем в неопластические процессы [2, 3].

Патогенез развития плоскоклеточной карциномы легких на фоне имеющихся гиперпластических изменений бронхиального эпителия связывают с влиянием воспалительного процесса, с нарушением механизмов регуляции клеточного цикла, апоптозом, нарушением дифференцировки клеток [4].

Первым шагом в изменении бронхиального эпителия является базальноклеточная гиперплазия (БКГ), обусловленная ускоренной регенерацией с одновременным замедлением дифференцировки клеток в условиях хронического воспаления [5]. Базальноклеточной гиперплазией считают изменения, когда количество рядов клеток достигает трех [6].

При базальноклеточной гиперплазии бронхиального эпителия базальные клетки имеют более трех слоев, при этом в клетках отсутствуют признаки атипии, межклеточные «мостики», ороговение и сохраняются реснички на поверхности клеток [7, 8].

Повышение уровня экспрессии маркеров пролиферативной активности и апоптоза (Ki67, bcl-2, р53) отмечается уже при базальноклеточной гиперплазии [5, 9].

Плоскоклеточная метаплазия (ПМ) — это процесс, при котором цилиндрический мерцательный респираторный эпителий замещается зрелым плоским эпителием. Клетки поверхностного слоя эпителиального пласта расположены параллельно базальной мембране, без атипии или с минимально выраженной атипией, между ними присутствуют межклеточные мостики. Для плоскоклеточной метаплазии характерно созревание клеток базального слоя и сохранение зоны промежуточных клеток [10].

Базальноклеточная гиперплазия и плоскоклеточная метаплазия часто предшествуют неоплазии и/или инвазивному плоскоклеточному раку [6, 11].

Имеются сведения о сочетании определенного состояния бронхиального эпителия с диспластическими и опухолевыми процессами в легком. Так, дисплазия бронхиального эпителия крайне редко сочетается с базальноклеточной гиперплазией независимо от наличия или отсутствия плоскоклеточной метаплазии. У пациентов с аденокарциномой легкого редко обнаруживают базальноклеточную гиперплазию и плоскоклеточную метаплазию [2].

Кроме патогенетического значения для возникновения первичной опухоли, базальноклеточная гиперплазия и плоскоклеточная метаплазия могут быть индикаторами, ассоциированными с большей частотой встречаемости некоторых форм опухолевой прогрессии при немелкоклеточном раке легкого. Так, сочетание базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии без дисплазии в мелких бронхах часто обнаруживают в случаях с наличием рецидивов [12]. С изолированной базальноклеточной гиперплазией ассоциирован высокий риск развития гематогенных метастазов [13].

Подобную связь можно объяснить многообразными иммунными стромальными реакциями, обусловленными генетической детерминацией и играющими ключевую роль в различных типах эпителиально-стромальных взаимодействий. Предполагается, что иммунностромальные реакции в бронхах могут быть связаны с особенностями микроокружения опухоли [14].

Цель исследования — изучить особенности морфологического строения и прогрессии немелкоклеточного рака легких, ассоциированные с характером изменений эпителия в мелких бронхах, смежных с опухолью.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В работе исследовали операционный материал от 90 больных немелкоклеточным раком легкого T1-3N0-2M0, проходивших лечение в торакоабдоминальном отделении НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2009 по 2017 г. Критерии включения в исследование: наличие информированного добровольного согласия; наличие злокачественной эпителиальной опухоли (плоскоклеточный рак, аденокарцинома). Критерии исключения: отказ от участия в исследовании; наличие хронических процессов (туберкулез, гепатит С); наличие мелкоклеточного рака. Распространенность заболевания определяли согласно международной классификации по системе TNM [15]. Оперативное лечение выполняли в объеме лобэктомии с ипсилатеральной медиастенальной лимфодиссекцией без неоадъювантной химиотерапии или интраоперационной лучевой терапии. По показаниям пациентам выполняли адъювантную терапию по схемам: винорелбин, цисплатин (25–30 мг/м² в первый и восьмой дни цикла, 75–80 мг/м² в/в — в первый день цикла; цикл — 21 день) или паклитаксел, карбоплатин (200 мг/м² в/в в первый день цикла, AUC 6 в/в в первый день цикла; цикл — 21 день).

Для морфологической оценки операционного материала использовали световой микроскоп Axio Lab. A1 (Zeiss; Германия) и сканирующий микроскоп Mirax Midi (Zeiss; Германия). Материал фиксировали в 10–12%-м растворе нейтрального формалина. Подготовку материала (обезвоживание и пропитку в парафине) и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистотип рака устанавливали согласно классификации WHO [16]. В исследование включали только случаи с плоскоклеточной карциномой и аденокарциномой. Для верификации диагноза плоскоклеточной карциномы и аденокарциномы выполняли иммуногистохимическое исследование с использованием антител к TTF (клон SPT24, Novocastra; Leica Biosystems, Великобритания), Napsin A (клон NCL-L, Novocastra; Leica Biosystems, Великобритания), р63 (клон 7JUL, Novocastra; Leica Biosystems, Великобритания), Cytokeratine 7 (клон OV-TL 12/30, Novocastra; Leica Biosystems,  Великобритания), Cytokeratine 5/6 (клон D5/16, Dako; Agilent, Дания). Иммуногистохимическое исследование осуществляли по стандартной методике. В случаях с аденокарциномой обнаружены позитивная экспрессия Cytokeratine 7, TTF, Napsin A и негативная экспрессия р63, Cytokeratine 5/6. В случаях с плоскоклеточной карциномой — позитивная экспрессия р63, Cytokeratine 5/6 и негативная экспрессия Cytokeratine 7, TTF, Napsin A.

В паренхиматозном компоненте аденокарциномы выделяли структуры типа lepidic, ацинарные, папиллярные, микропапиллярные, солидные и одиночные опухолевые клетки. Паттерном lepidic называли структуры, представленные атипичными клетками кубической формы, выстилающими изнутри альвеолы. Ацинарным паттерном — округлые или овальные железы, образованные атипичными клетками. Папиллярным паттерном — сосочковые структуры с фиброваскулярной ножкой, выстланные атипичными кубовидными или столбчатыми клетками. Микропапиллярным паттерном — мелкие сосочки с отсутствием фиброваскулярной ножки. Солидным паттерном — крупные поля и гнезда опухолевых клеток.

В паренхиматозном компоненте плоскоклеточной карциномы выделяли пять типов структур: 1) с ороговением; 2) состоящий из атипичных клеток шиповатого типа без ороговения; 3) состоящий из атипичных клеток базалоидного типа; 4) построенный из атипичных клеток с резко выраженным полиморфизмом; 5) одиночные опухолевые клетки [17]. Определяли наличие перечисленных структур и общее число структур в опухоли (рис. 1).

Оценивали степень дифференцировки опухоли (высокая, умеренная, низкая) и состояние стромы новообразования. Выраженность стромы в общем в опухоли и вокруг каждого из исследуемых вариантов структур паренхиматозного компонента новообразования определяли по трехбалльной системе (1 балл — слабо выражена, менее 30% от ткани опухоли; 2 балла — умеренно выражена, составляет 30–70% от ткани опухоли; 3 балла — выражена, составляет более 70% ткани опухоли). Выраженность воспалительной инфильтрации стромы в общем в опухоли и вблизи каждого из перечисленных типов структур паренхиматозного компонента оценивали в процентах по Salgado R. с соавт. [18]. Для исключения возможного субъективного фактора оценку описанных выше параметров проводили два независимых патоморфолога. 

В слизистой оболочке бронхов, располагающихся на 3–4 см от границы опухоли, оценивали наличие базальноклеточной гиперплазии (БКГ) и плоскоклеточной метаплазии (ПМ) и их сочетания (рис. 2).

С учетом изменений, обнаруженных в бронхиальном эпителии, было сформировано три группы больных. Группу без базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии (БКГ–ПМ–) составили 17 пациентов; группу с базальноклеточной гиперплазией, без плоскоклеточной метаплазии (БКГ+ПМ–) — 45 больных; группу с базальноклеточной гиперплазией и плоскоклеточной метаплазией (БКГ+ПМ+) — 28 больных. В лимфатических узлах оценивали наличие метастатического поражения, подсчитывали количество лимфоузлов с метастазами. Срок наблюдения за больными составил 5 лет. Анализировали истории болезни и амбулаторные карты больных. Учитывали информацию о наличии, сроках и локализации гематогенных метастазов и рецидивов.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием пакета программ Statistica 10.0 for Windows (Dell; США). Применяли методы описательной статистики, для оценки различий между двумя независимыми выборками использовали критерий Манна–Уитни. Поправку на множественность сравнений не использовали. Учитывали результаты с достоверностью различий при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Средний возраст больных не различался в исследуемых группах. Во всех группах немелкоклеточный рак легкого чаще имел центральную локализацию и его чаще обнаруживали у мужчин (табл. 1).

Достоверных различий в частоте встречаемости новообразований, соответствующих размерам Т1, Т2, Т3, не было обнаружено ни в группе без базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии, ни в группе с изолированной базальноклеточной гиперплазией, ни в группе с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии.

Частота лимфогенного метастазирования в группе пациентов с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии была выше (57%) в сравнении со случаями с изолированной базальноклеточной гиперплазией (38%; р = 0,05) и не отличалась от частоты в группе БКГ–ПМ– (47%).

Гематогенные метастазы чаще обнаруживались в группе больных с изолированной базальноклеточной гиперплазией (22%), в сравнении с группой БКГ–ПМ– (0%; р = 0,019) и в группе БКГ+ПМ+ (0%; р = 0,004).

Рецидивы обнаруживали в группе больных с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии (14%) чаще, чем в группах пациентов БКГ–ПМ– (0%; р = 0,05) и БКГ+ПМ– (2%; р = 0,02) (рис. 3).

В группе пациентов без базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии гистотип опухоли соответствовал аденокарциноме чаще (65%), чем в случаях с плоскоклеточной карциномой (35%; р = 0,04). В случаях с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии чаще (64%) обнаруживали плоскоклеточную карциному, в сравнении со случаями с аденокарциномой (36%; р = 0,01). В группе пациентов с изолированной базальноклеточной гиперплазией частота встречаемости изучаемых гистотипов достоверно не различалась.

Степень дифференцировки аденокарциномы не различалась в исследуемых группах. В то же время ацинарные структуры в паренхиматозном компоненте аденокарциномы в группе больных с изолированной базальноклеточной гиперплазией обнаруживались реже (21%), чем в случаях с БКГ–ПМ– (91%; р = 0,0005) и БКГ+ПМ+ (90%; р = 0,0007). Папиллярные структуры, напротив, встречались в группе больных БКГ+ПМ– чаще (100%), чем в группах БКГ–ПМ– (18%; р = 0,0000) и БКГ+ПМ+ (20%; р = 0,0000). Одиночные клетки в паренхиматозном компоненте аденокарциномы в группе БКГ+ПМ+ обнаруживали реже (20%), чем в группх БКГ–ПМ– (64%; р = 0,028) и БКГ+ПМ– (58%; р = 0,030).

Степень дифференцировки плоскоклеточной карциномы не различалась в исследуемых группах. В то же время изучение паренхиматозного компонента плоскоклеточной карциномы показало ряд различий в зависимости от морфологических изменений в бронхиальном эпителии. Так, II тип структур в паренхиматозном компоненте плоскоклеточной карциномы, представленный клетками шиповатого типа, чаще обнаруживали в группе с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии (94%), чем в группах БКГ–ПМ– (67%; р = 0,04) и БКГ+ПМ– (69%; р = 0,02).

Частота встречаемости III типа структур в паренхиматозном компоненте плоскоклеточной карциномы, представленного клетками базалоидного типа, ниже в группе с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии (22%), чем в группе БКГ+ПМ– (50%; р = 0,025), и не отличалась от данного показателя в группе БКГ–ПМ– (50%).

Достоверных различий в количестве сочетающихся типов структур в паренхиматозном компоненте новообразования, в выраженности стромы и воспалительной инфильтрации стромы в исследуемых группах больных не было обнаружено ни при аденокарциноме, ни при плоскоклеточной карциноме легкого (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное исследование позволило выявить ряд закономерностей, характеризующих немелкоклеточную карциному легких у пациентов с различными морфологическими изменениями бронхиального эпителия.

Обратила на себя внимание группа пациентов с изолированной базальноклеточной гиперплазией в бронхиальном эпителии, в которой чаще обнаруживались гематогенные метастазы при более редком лимфогенном метастазировании. В этой группе частота возникновения разных гистотипов была достоверно не различимой. В случаях возникновения аденокарциномы в паренхиматозном компоненте новообразования чаще обнаруживались менее дифференцированные папиллярные и, реже, более дифференцированные ацинарные структуры.

Для группы больных с сочетанием базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии в респираторном эпителии была характерна большая частота лимфогенного метастазирования и рецидивирования при отсутствии гематогенного метастазирования. В этой группе новообразование в основном было представлено плоскоклеточной карциномой, в паренхиматозном компоненте которой чаще обнаруживали структуры II типа (шиповатые) — более дифференцированные, и реже III типа (базалоидные) — менее дифференцированные.

У пациентов без базальноклеточной гиперплазии и плоскоклеточной метаплазии чаще диагностировали аденокарциному. Характерных особенностей в частоте лимфогенного, гематогенного метастазирования, рецидивирования, морфологического разнообразия паренхиматозного компонента опухоли для этой группы не обнаружено.

В группе с БКГ+ПМ+ лимфогенные метастазы встречались чаще, чем в группе с БКГ+ПМ–. Показано, что рецидивы немелкоклеточного рака легких в большинстве случаев представляют собой метахронные лимфогенные метастазы [14]. Результаты обсуждаемой работы позволяют предположить, что имеются общие звенья механизмов синхронного и метахронного лимфогенного метастазирования.

Полученные результаты подтверждают ранее обнаруженные данные о высоком риске гематогенного метастазирования в группе с БКГ+ПМ–, рецидивирования в группе с БКГ+ПМ+. Обнаружено, что эти группы различаются не только риском развития разных форм прогрессирования, но и морфологическим строением первичной опухоли. Интересно, что в группе с БКГ+ПМ+ чаще встречается плоскоклеточная карцинома. Не исключено, что склонность к плоскоклеточной метаплазии в условиях хронического воспаления является одной из предпосылок в развитии плоскоклеточной карциномы, поскольку именно в метапластическом плоском эпителии может развиваться предраковый процесс дисплазия, и в дальнейшем — карцинома. Представляются еще более важными впервые обнаруженные различия морфологического строения первичных опухолей. В группе с высоким риском гематогенного метастазирования (БКГ+ПМ–) и в аденокарциномах, и в плоскоклеточных карциномах чаще встречаются низкодифференцированные структуры опухоли.  Ранее было высказано предположение, что группы с разным характером изменений в мелких бронхах отражают сущностные конститутивные различия стромально-паренхиматозных отношений, которые сопряжены с парензиматозно-стромальными отношениями в карциномах [13, 14].

В основе различий состояния стромы в сравниваемых группах лежат особенности иммуно-воспалительных реакций. Результаты исследования позволяют дополнить гипотезу предположением, что вариант иммуно-воспалительной реакции в микроокружении немелкоклеточного рака легких с БКГ+ПМ– способствует не только гематогенному метастазированию, но и дедифференцировке опухолевых элементов. Последнее может быть самостоятельным кофактором, способствующим гематогенному метастазированию. Расшифровка механизмов описанного феномена является предметом дальнейшей исследовательской работы.  

ВЫВОДЫ

Результаты работы не только подтвердили ассоциацию варианта изменений эпителия мелких бронхов, смежных с опухолью, с разной степенью риска метастазирования и рецидивирования, но и показали связь со степенью дифференцировки опухолевых элементов. В основе этих закономерностей могут лежать конститутивные особенности стромально-парехиматозных отношений, проявляющиеся, как в условиях хронического воспаления в бронхах, так и при развитии опухоли. Более детальное изучение гистохимических и молекулярно-генетических механизмов, принимающих участие в формировании этих взаимосвязей, является целью дальнейших исследований.