Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области изучения физиологии и патологии мозга, прогресс в лечении нейродегенеративных заболеваний (НЗ), одной из главных групп патологий нервной системы, остается относительно скромным. В то же время ввиду увеличения средней продолжительности жизни населения, бремя НЗ приобретает все большую медико-социальную значимость [1]. При этом на сегодняшний день отсутствуют средства этиотропной терапии нейродегенерации, а существующие подходы патогенетической и симптоматической направленности очень ограниченно влияют на исходы заболеваний. Все это обусловливает актуальность поиска новых эффективных стратегий нейропротекции. Отдельный интерес фармакотерапия НЗ представляет для офтальмологии, поскольку многие заболевания сетчатки тоже имеют нейродегенеративную природу [2].

Аномалии митохондриальной функции рассматривают как ключевое звено нейронной дегенерации [3]. Показано, что нарушение митохондриальной функции является не следствием, а драйвером развития НЗ [4]. В связи с исключительной важностью энергетического обмена одной из основных задач клетки является поддержание пула здоровых митохондрий. При этом ключевым механизмом, предотвращающим накопление дефектных митохондрий, служит митофагия [5]. Термин «митофагия», впервые предложенный Лемастерсом [6], относится к процессу избирательной деградации митохондрий посредством макроаутофагии [7]. Два основных пути митофагии включают PINK1/паркин-опосредованную и рецептор-опосредованную митофагию [8].

В итоге элиминация поврежденных митохондрий приводит к снижению окислительного стресса и увеличению эффективности энергетического обмена клетки [9]. Таким образом, стимуляцию митофагии можно рассматривать как эффективный подход к нейропротекции. Более того, активация аутофагии в целом приводит к снижению перегрузки нейронов неправильно свернутыми белками и белковыми агрегатами, которые являются основным патоморфологическим субстратом при нейродегенеративном процессе [10].

В качестве потенциальной стратегии нейропротекции, которая может быть связана с активацией аутофагии и улучшением функции митохондрий, может быть рассмотрена фармакологическая активация гетеродимерного рецептора эритропоэтина (EPO) EPOR/CD131 [11]. Ранее для агонистов EPOR/CD131 была показана нейропротективная активность [12–14] и способность активировать аутофагию [15]. Цель работы — оценить нейропротективную активность эритропоэтина (EPO) и его пептидного агониста pHBSP, избирательно стимулирующего гетеродимерный рецептор EPOR/CD131.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для оценки митотропных эффектов в качестве модели была выбрана ротеноновая токсичность в условиях in vivo и in vitro. Пестицид ротенон прерывает митохондриальную дыхательную цепь, блокируя комплекс I. Воздействие ротенона способно индуцировать клеточные изменения, характерные для митохондриальных заболеваний и нейродегенерации [16].

Животные

Исследование проводили на 24 самцах крыс (питомник «Столбовая»; Московская область, Россия), трех самках мышей линии CD-1 (питомник Пущино; Московская область, Россия) и 24 новорожденных мышатах. До и во время выполнения исследования животных содержали в помещениях с искусственным освещением (режим 12/12 ч) при температуре 21–23 °С, влажности 38–50%, со свободным доступом к корму и воде.

Ротенон-индуцированная ретинальная дегенерация

Для индукции ретинальной дегенерации 18 самцам крыс (возраст 20 недель, масса 250–275 г) под местной новокаинамидной анестезией интравитреально инъецировали 5 мкл 0,4 мМ раствора ротенона, разбавленного 5%-м раствором ДМСО в PBS Дюльбекко (D-PBS) (2 нмоль/глаз) [17].

Затем животных делили на три равные группы:

1. контроль (стерильная вода подкожно + ротенон интраорбитально);
2. pHBSP (pHBSP 5 мкг/кг подкожно + ротенон интраорбитально);
3. EPO (EPO 10 мкг/кг подкожно + ротенон интраорбитально).

Дополнительно была введена группа интактных животных (n = 6; соответствующие по возрасту и массе) с введением носителя вместо ротенона.

Исследуемые препараты EPO и pHBSP вводили подкожно за 30 мин до инъекции ротенона. Животным контрольной и интактной групп вводили стерильную воду. На 3-й день глаза энуклеировали для гистологического исследования и анализа экспрессии таргетных генов (рис. 1).

Морфологическое исследование

Глазные яблоки заливали в парафин с предварительной фиксацией в забуференном формалине (pH около 7,0) с 0,002%-м раствором пикриновой кислоты и с последующей осторожной аспирацией стекловидного тела и заменой расплавленным воском, как описано ранее [18]. Все срезы были стандартизированы по одной и той же области (1 мм выше слепого пятна) и толщине (7 мкм) для корректного сравнения полученных данных. Слайды окрашивали по стандартным протоколам [19] для дальнейшего структурного анализа. Проводили оценку толщины слоя внутреннего плексиформного слоя (ВПС) и числа ядер на 100 мкм слоя ганглионарных клеток.

Количественная полимеразно-цепная реакция

Выделение суммарной РНК и обратную транскрипцию проводили по методике, описанной ранее [20]. Для оценки экспрессии таргетных генов в амплификаторе CFX96 (BioRad; США) проводили ПЦР образцов с использованием коммерческого набора SYBR® Green Master Mix (Bio-Rad Laboratories, Inc.; США) и олигонуклеотидных праймеров (Евроген; Россия).

Праймеры подбирали с использованием ресурса Primer-BLAST (NCBI) и с соблюдением ряда условий: 1) температура плавления 59–61 °C; 2) каждый праймер должен отжигаться на область межэкзонного соединения или оба праймера должны отжигаться на разные экзоны; 3) прямой и обратный праймеры не должны образовывать ауто- и кроссдимеры в одной смеси; 4) размер ПЦРпродукта должен составлять 95–107 п.н. (таблица).

Преобразование полученных при количественной ПЦР данных проводили с использованием метода двух дельта. После проведения амплификации с помощью программы Bio-Rad CFX Manager (Bio-Rad; США) для каждого образца рассчитывали ΔCt (разницу между пороговым значением цикла для гена домашнего хозяйства и пороговым значением цикла для гена интереса).

Полученные данные преобразовывали по формуле (1) [21]:

формула

где ΔCt — цикл, в котором логарифмическая кривая интенсивности флуоресценции красителя SYBR Green достигает порогового уровня (cycle threshold) при проведении реакции с геном домашнего хозяйства, взятым как контроль; ΔCt_контр — разница циклов между пороговым уровнем флуоресценции для гена интереса и контрольным геном.

Исследование цитопротективной активности pHBSP при ротеноновой токсичности in vitro

Для приготовления культуры клеток использовали мышей линии CD1 в возрасте одни сутки после рождения. Проводили декапитацию животного, помещали голову на чашку Петри, помещенную на лед. Препарирование черепной коробки от кожи и фасций проводили в условиях охлаждения. Извлекали головной мозг и помещали в чашку Петри с охлажденным PBS. Гиппокамп, кору или средний отдел мозга выделяли под бинокуляром Leica (ув. ×10) на охлажденном предметном стекле, помещенном в чашку Петри.

Ткани собирали в пробирку, промывали D-PBS, трипсинизировали, и засевали по 20 000 клеток в планшеты, обработанные поли-D-лизином, для дальнейшего культивирования в среде Neurobasal (Панэко; Россия). Через 16–18 ч половину среды заменяла на среду Neurobasal Plus. Через каждые 2 дня проводили контроль культуры под микроскопом и меняли половину среды на новую. Культивирование клеток осуществляли в течение 10 дней. За 24 ч до подсчета числа живых клеток в лунки добавляли ротенон для получения конечной концентрации 2,5 мМ. После 20 ч инкубации с ротеноном в суспензию добавляли изучаемые препараты (pHBSP и EPO) в концентрациях 50 или 500 нМ. Подсчет выживших клеток проводили с помощью окраски красителем MTT [3-(4,5-диметилтиазол2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид] в автоматическом счетчике клеток с функцией анализатора жизнеспособности Cell Counter (Corning; США) с использованием программы CytoSmart (Axion; Нидерланды).

Статистическая обработка

Нормальность распределения проверяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Нормально распределенные данные представляли в виде M ± SD, ненормально распределенные данные — в виде Me [Q₁; Q₃]. Статистическую обработку и визуализацию данных проводили в программе GraphPad Prism 9.2.0 (Graphpad Software Inc; США). Значимость различий определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа Краскела–Уоллиса и анализа post hoc по методу Данна с процедурой Бенджамини–Хохберга. Данные, использованные для построения тепловых карт, не подвергали статистической обработке.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование продемонстрировало, что интравитреальные инъекции ротенона привели к специфическим изменениям морфологии сетчатки: ее истончению, уменьшению толщины ВПС и уменьшению количества ганглионарных клеток. Толщина ВПС уменьшилась с 41,92 мкм [38,74; 43,70] в группе носителя до 23,59 мкм [21,37; 25,62] в группе с введением ротенона, тогда как количество ядер в 100 мкм слоя ганглионарных клеток (СГК) уменьшилось с 8,22 [7,75; 8,83] до 4,78 [4,42; 4,67]. Изменения указывают на дегенерацию ганглионарных клеток, что свидетельствует о нейродегенеративном процессе, индуцированном ротеноном. Кроме того, анализ экспрессии генов выявил повышенную экспрессию цитокинов Il6 и Il1b и снижение экспрессии Nefl, маркера количества ганглионарных клеток сетчатки (ГКС), что также подтверждает повреждение сетчатки.

pHBSP и EPO значительно уменьшили изменения, вызванные ротеноном, как по гистологической картине (рис. 2А–В), так и по данным анализа экспрессии генов (рис. 2Г). Примечательно, что pHBSP продемонстрировал более значительное снижение дегенерации сетчатки. Толщина ВПС и число ядер в 100 мкм СГК у крыс, получавших pHBSP, составляли 34,34 [31,52; 36,02] и 6,89 [7,00; 7,33] соответственно.

Обнаружено также, что крысы, получавшие pHBSP или EPO, имели повышенную экспрессию маркеров митофагии и аутофагии Map1lc3a, Atg7, Becn1, Prkn, Bnip3 в сетчатке (рис. 2Г). Оба препарата продемонстрировали сравнимую активность в отношении повышения экспресии Nefl и генов, которые кодируют белки, связанные с аутофагией, а также сравнимую супрессорную активность в отношении экспрессии провоспалительных цитокинов.

Таким образом, однократное системное введение pHBSP и EPO в дозах 5 и 10 мкг соответственно привело к снижению ретинальной дегенерации, вызванной интравитреальной инъекцией ротенона. В основе ретинопротективных эффектов, опосредованных стимуляцией EPOR/CD131, может лежать снижение воспалительной активации и усиление митофагии, что подтверждено снижением экспрессии маркеров воспаления и увеличением экспрессии маркеров ауто/ митофагии.

Цитопротективная активность in vitro

Инкубация в течение 24 ч первичной нейроглиальной культуры гиппокампа в 2,5 мкМ растворе ротенона привела к гибели более 50% культуры, что снизило количество живых клеток с 69,80 ± 6,62% в группе необработанных клеток до 27,06 ± 8,98% в группе с применением ротенона без лечения (рис. 3). Применение исследуемых препаратов в концентрации 500 нМ статистически значимо увеличило жизнеспособность культуры до 61,73 ± 11,56% (p < 0,005) и 71,20 ± 6,97% (p < 0,005) при применении pHBSP и EPO соответственно. В концентрации 50 нМ оба препарата так же выраженно снизили количество мертвых клеток, но эффект не был статистически значим.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Функциональное состояние митохондрий рассматривают как один из основных факторов, определяющих клеточный гомеостаз. Ткани с особенно большими энергетическими потребностями, такие как мозг и сетчатка, характеризуются наиболее высокой чувствительностью к митохондриальным аномалиям [2].

В данном исследовании мы продемонстрировали, что стимуляция EPOR/CD131 способна улучшать морфофункциональное состояние нейрональных клеток сетчатки и выживаемость первичной нейроглиальной культуры in vitro при химически индуцированной митохондриальной дисфункции. Поскольку нейротоксичный эффект ротенона связан с разобщением дыхательной цепи митохондрий, митопротективное действие можно рассматривать как наиболее вероятный механизм наблюдаемых положительных эффектов стимуляции EPOR/CD131. В целом это согласуется с полученными ранее данными, касающимися влияния EPO на митохондриальную функцию [22]. Анализ генной экспрессии продемонстрировал, что одним из потенциальных механизмов митопротективной активности агонистов EPOR/CD131 является стимуляция ауто- и митофагии. Так, применение препаратов привело к увеличению экспрессии мРНК LC3A, ATG7, Beclin-1, Паркина и BNIP3. Эти результаты согласуются также с полученными нами ранее данными по эффекту pHBSP на экспрессию генов аутофагии при этанол-индуцированной нейродегенерации у крыс [23]. Несмотря на то что в этой работе мы не проводили количественную или полуколичественную оценку уровня степени фосфорилирования белков аутофагии, некоторые из данных факторов уже были идентифицированы как медиаторы нейропротекции при митохондриальной дисфункции [16, 24, 25]. Кроме того, прежде было показано, что некоторые положительные эффекты pHBSP связаны со стимуляцией аутофагии. Например, продемонстрировано, что гепатопротективная активность pHBSP связана с увеличением экспрессии белков LC3II, LC3I, and Beclin 1 и может быть отменена ингибиторами аутофагии [15]. Аналогично, аутофагия была идентифицирована как одно из основных звеньев, опосредующих нейропротективные эффекты EPO [26].

ВЫВОДЫ

Таким образом, EPO и pHBSP, селективный агонист EPOR/ CD131, проявляют выраженную нейропротективную активность при ротенон-индуцированном поражении. Исследование показало, что стимуляция аутофагии и митофагии является одним из вероятных механизмов наблюдаемых фармакологических эффектов. Применение агонистов EPOR/CD131 является перспективным направлением в лечении нейродегенеративных процессов центральной нервной системы и сетчатки. Дальнейшие исследования на конкретных моделях НЗ, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или боковой амиотрофический склероз, могут помочь в определении перспективности клинического применения pHBSP.