В связи с пандемией новой коронавирусной инфекции (COVID-19), вызванной вирусом SARS-CoV-2 и охватившей более 500 млн человек в мире, появилась острая необходимость изучения влияния COVID-19 на репродуктивную систему женщины. Согласно разноречивым данным имеющихся единичных исследований, COVID-19 увеличивает риск возникновения таких осложнений беременности, как самопроизвольные выкидыши и преждевременные роды [1, 2]. Частота преждевременных родов у беременных женщин с COVID-19 достигает 11,5–17% [3, 4], а частота ранних самопроизвольных выкидышей у них выше в 1,7 раза по сравнению с не инфицированными SARS-CoV-2 пациентками [5].

Исследований по оценке влияния COVID-19 и постковидного синдрома на фертильность и исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) недостаточно. Описаны отдельные случаи развития преждевременной недостаточности яичников у женщин после перенесенного COVID-19 [6]. При этом не ясен генез этих нарушений. В метаанализе 2022 г. не отмечено влияние COVID-19 на исходы программ ВРТ [7]. Однако результаты другого исследования позволяют предположить негативное воздействие COVID-19 и зависимость числа полученных ооцитов в программах ВРТ от времени, прошедшего после заболевания [8].

Известно, что инфекция, вызываемая SARS-CoV-2, сопровождается повышением продукции цитокинов, таких как IL6, TNFα, может привести к цитокиновому шторму и отрицательно повлиять на репродуктивную функцию через подавление цитокинами гипоталамо-гипофизарногонадной оси, а также вследствие развития системного васкулита и аутоиммунного поражения гонад [9, 10].

Одним из возможных механизмов поражения репродуктивной системы у женщин под влиянием инфекции является аутоиммунный механизм. Показано, что развитию аутоиммунных процессов после COVID-19 наиболее подвержены люди с определенным HLA-гаплотипом [11]. Активация и созревание аутореактивных В-лимфоцитов из наивных B-клеток может происходить по экстрафолликулярному пути, лишенному некоторых контрольных точек толерантности [12], что подтверждено наличием у пациентов с тяжелой формой COVID-19 более высокого уровня экстрафолликулярных В-клеток и плазматических клеток.

В подтверждение гипотезы о роли аутоиммунитета при COVID-19 недавно были выявлены 28 белков человека, содержащих домены, гомологичные пептидам SARS-CoV-2, которые могут действовать как аутоантигены у пациентов с COVID-19, приводя к запуску продукции аутоантител по механизму молекулярной мимикрии [13]. У пациентов с COVID-19 обнаружена значительная распространенность аутоантител разной специфичности, включая антинуклеарные антитела, антитела к цитоплазме нейтрофилов, кардиолипину (КЛ) и β₂-гликопротеину-I (β₂-ГП-I) [14]. При постковидном синдроме также найдены антитела к тиреоидной пероксидазе [15].

Наблюдаемые при COVID-19 сосудистые осложнения, такие как тромбоз глубоких вен, инсульт, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, первоначально связывали с наличием антифосфолипидных антител (аФЛ) [16], прежде всего антител к КЛ и β₂-ГП-I, отнесенных к лабораторным критериям антифосфолипидного синдрома (АФС) [17]. Однако показано, что аФЛ при COVID-19 выявляются нечасто (8,9%), могут быть транзиторными и не всегда ассоциируются с тромбозом [18]. В то же время у пациентов с генетической предрасположенностью можно наблюдать длительную персистенцию патогенных аФЛ и развитие аутоиммунного заболевания [19].

Аутоиммунные процессы у бесплодных женщин могут оказывать влияние на оплодотворение, имплантацию и развитие плаценты [20]. Патогенетические механизмы, которые связывают аутоиммунитет и бесплодие, остаются до конца не выясненными. Связь аФЛ с бесплодием в настоящее время активно обсуждают. Анализ научной литературы (2016) показал, что в большинстве исследований выявлена связь бесплодия с антителами к β₂-ГП-I и некритериальными аФЛ, в том числе к фосфатидилэтаноламину (ФЭ) [21]. В пяти из 18 исследований сообщалось о потенциальном вредном воздействии, главным образом, критериальных аФЛ на исход программ ВРТ. Таким образом, исследование различных аутоантител у пациенток с бесплодием, перенесших COVID-19, и их влияния на репродуктивные исходы имеет важное научное и практическое значение.

Цель настоящего исследования — оценить профиль антифосфолипидных антител и их связь с исходами программ ВРТ у пациенток с COVID-19 в анамнезе.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование было проведено на базе ФГБУ «НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова» Минздрава России. Всего в проспективное обсервационное исследование были включены 240 пациенток с бесплодием. Пациентки были стратифицированы на две группы в зависимости от COVID-19 в анамнезе: в группу 1 вошли пациентки, не болевшие COVID-19 (n = 105), в группу 2 — пациентки, перенесшие COVID-19 (n = 135) за 12 и менее месяцев до вступления в программу ВРТ. Группа 2 была дополнительно разделена на две подгруппы: в подгруппу 2а вошли пациентки, перенесшие COVID-19 в легкой форме (n = 85), в подгруппу 2б — пациентки, перенесшие COVID-19 в среднетяжелой форме (n = 50).

Критерии включения: возраст 18–40 лет; нормальный овариальный резерв (антимюллеров гормон (АМГ) ≥ 1,2 нг/мл, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) < 12 мМЕ/мл, число антральных фолликулов (КАФ) ≥ 5 в обоих яичниках). Критерии исключения: наличие вакцинации от COVID-19 в анамнезе; наличие противопоказаний к ВРТ, морбидное ожирение (ИМТ ≥ 40,0 кг/м²); участие в донорских программах, программах суррогатного материнства; ВИЧ-инфекция. Все пациентки были обследованы в соответствии с клиническими рекомендациями «Женское бесплодие» (2021 г.).

Данные о перенесенном COVID-19, полученные со слов пациенток, подтверждали информацией, внесенной в систему ЕГИСЗ, а также с помощью определения антител к SARS-CoV-2 в сыворотке крови с использованием «Набора реагентов для выявления антител класса G к spike белку SARS-CoV-2 методом иммуноферментного анализа» («ДС-ИФА-АНТИ-SARS-CoV-2-G(S)») («Диагностические системы»; Россия) для качественного определения антител к SARS-CoV-2 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Для оценки результатов анализа рассчитывали индекс позитивности (ИП) по формуле: ИП = ОП образца / Cut-off, где ОП образца — величина оптической плотности образца. При ИП > 1,2 результат считали положительным, при ИП < 0,8 — отрицательным, при ИП в диапазоне от 0,8 до 1,2 — сомнительным (неопределенным).

Исследование аФЛ проводили с помощью ИФА с использованием наборов для количественного определения антител классов M и G к КЛ, β₂-ГП-I, аннексину V (Ан V), фосфатидилсерину (ФС) (ORGENTEC Diagnostika GmbH; Германия). Референсные значения (РЗ) содержания антител в крови составляли: анти-КЛ IgM — < 7 MPL-Ед/мл, анти-КЛ IgG — < 10 GPL-Ед/мл; анти-β₂-ГП-1 IgM и IgG — < 5 Ед/мл; анти-АнV IgM и IgG — < 5 Ед/мл; анти-ФС IgM и IgG — < 10 Ед/мл. Для количественного определения антител (M, G) к ФЭ и комплексу фосфатидилсерин/ протромбин (ФС/ПТ) в сыворотке крови использовали иммуноферментные наборы (AESKU Diagnostics; Германия). Референсный диапазон концентраций антител к ФЭ и антител к ФС/ПТ составлял < 12 Ед/мл.

Овариальную стимуляцию проводили по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (ант-ГнРГ) препаратами рекомбинантного ФСГ (рФСГ) и/или препаратами, содержащими лютеинизирующий гормон (ЛГ)-компонент: человеческим менопаузальным гонадотропином (чМГ) или комбинированным препаратом, содержащим рФСГ/рЛГ. Всем пациенткам, переболевшим COVID-19, овариальную стимуляцию осуществляли в среднем через шесть месяцев (от двух до девяти месяцев) после заболевания. Дозу гонадотропинов подбирали индивидуально с учетом возраста, анамнеза и параметров овариального резерва. В качестве триггера овуляции использовали хорионический гонадотропин (ХГ) однократно в дозе 8000–10 000 МЕ или комбинацию ХГ с агонистом гонадотропин-рилизинг гормона (а-ГнРГ). Трансвагинальную пункцию фолликулов (ТВП) проводили под контролем УЗИ через 36 ч после введения триггера овуляции.

В аспирированной фолликулярной жидкости определяли число полученных ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК), затем после денудирования ооцитов оценивали степень зрелости клеток. Все зрелые ооциты подвергали оплодотворению методом эктракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ); через 16–18 ч при наличии в цитоплазме двух симметричных по размеру пронуклеусов регистрировалось нормальное оплодотворение. Затем зиготы переносились в культуральную среду COOK (COOK Medical; США) для дальнейшего культивирования. Морфологическую оценку эмбрионов проводили через 120–122 ч (на пятые сутки) культивирования с использованием классификации Гарднера (степень зрелости бластоцист, качество трофэктодермы и внутриклеточной массы).

Перенос одного или двух эмбрионов (ПЭ) в полость матки осуществляли на пятые сутки культивирования. Поддержку посттрансферного периода проводили с применением микронизированного прогестерона (600 мг в день) или дидрогестерона (30 мг в день). Наступление беременности определяли по уровню β-ХГ в сыворотке крови через 14 дней после ПЭ в полость матки. Тест на беременность считали положительным при уровне β-ХГ более 20 МЕ/л. Через 21 день после ПЭ при визуализации плодного яйца в полости матки с помощью УЗИ регистрировали клиническую беременность.

Для статистического анализа использовали пакет статистических программ Statistica 10 (StatSoft Inc.; США). Для оценки качественных данных вычисляли доли (%). Для сравнения категориальных данных, а также для оценки различий между ними использовали тест χ². Для анализа количественных данных в группах сравнения определяли вид распределения данных с помощью теста Колмогорова–Смирнова и графического анализа данных. При распределении данных, не соответствующем нормальному, применяли методы непараметрической статистики: определение медианы с интерквартильным размахом (Mе(Q₂₅-Q₇₅)), тест Манна–Уитни или тест Краскела–Уоллиса для сравнения данных в несвязанных совокупностях. Наличие корреляционной зависимости между переменными оценивали с применением корреляционного критерия Спирмена. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне р ˂ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Средний возраст пациенток составил 34 года (34 (30–36) года в группе 1 и 34 (31–37) года в группе 2 (р = 0,39). Поздний репродуктивный возраст (35 лет и старше) отмечался у 24 (22,8%) женщин в группе 1 и у 36 (26,7%) — в группе 2 (p = 0,49). Пациентки группы 2 имели значимо более высокий сывороточный уровень специфичных противовирусных антител по сравнению с пациентками группы 1, средние значения ИП составили в группах 1 и 2, соответственно, 0,16 ± 0,13 и 6,8 ± 4,1 (p < 0,001). Пациентки, перенесшие COVID-19, отличались от не болевших более высоким индексом массы тела (22,9 (20,4–25,5) кг/м² и 21,9 (20,0–24,5) кг/м²; p = 0,009), большей частотой заболеваний ЛОР-органов (24 (17,8%) и 9 (8,6%); p = 0,04) и аллергических заболеваний (23 (17%) и 9 (8,6%); p = 0,055).

Среди гинекологических заболеваний у женщин в группах 1 и 2 часто диагностировали эндометриоз (у 25 (23,8%) и 38 (28,1%); p = 0,45) и миому матки (у 21 (20%) и 33 (24,4%); p = 0,41), реже выявляли хронический сальпингоофорит (у 13 (12,4%) и 15 (11,1%); p = 0,76), хронический эндометрит (у 11 (10,5%) и 8 (5,6%); p = 0,19) и СПКЯ (у 9 (8,6%) и 6 (4,4%); p = 0,19). Доля пациенток с первичным бесплодием в обеих группах была одинаковой и составляла 61 (58,1%) и 79 (58,5%); p = 0,95. Исследуемые группы не различались по среднему числу беременностей, родов и выкидышей.

Исследование сывороточного содержания аФЛ у пациенток в двух группах показало частое повышение уровня антител выше РЗ. Повышение содержания хотя бы одного аФЛ класса M или G наблюдали суммарно у 66 (62,9%) пациенток в группе 1 и у 81 (60%) пациентки в группе 2 (p = 0,65). Одновременное повышение уровня нескольких аФЛ наблюдали, соответственно, у 18 (17,1%) и у 33 (24,4%) пациенток (p = 0,17). Наиболее часто отмечали повышение уровня антител к ФЭ суммарно у 55 (52,4%) пациенток в группе 1 и у 66 (48,9%) пациенток в группе 2; реже наблюдали повышение уровня антител к Ан V, соответственно, у 20 (19%) и 37 (27,4%) пациенток (p < 0,001). Повышение уровня антител другой специфичности отмечено реже, чем антител к Ан V: антител к β₂-ГП-I у 6 (5,7%) и 8 (5,9%) соответственно, к комплексу ФС/ПТ — у 6 (5,7%) и у 6 (4,4%), к КЛ — у 2 (1,9%) и у 4 (3,0%), к ФС — только в группе 1 у одной (0,95%) пациентки (p < 0,001). При этом сравнительный анализ частоты повышения уровня аФЛ отдельно классов M и G в исследуемых группах выявил значимые различия только у IgG-антител к ФЭ и АнV (табл. 1), частота которых была значимо выше в группе 2 по сравнению с группой 1.

При оценке сывороточного уровня аФЛ у пациенток в группах 1 и 2 было показано, что средние уровни с интерквартильными размахами всех исследованных антител находились в пределах РЗ. При этом средний уровень анти-β₂-ГП-I IgG, анти-АнV IgM и анти-ФС/ПТ IgG был выше в группе 1, тогда как средний уровень анти-ФЭ IgG и анти-ФС/ПТ IgM напротив был выше в группе 2 (табл. 2). Отмечен несколько более высокий уровень IgG-антител к АнV в группе 2 по сравнению с группой 1.

Показатели сперматогенеза, оогенеза и раннего эмбриогенеза в группах 1 и 2 значимо не различались. При этом следует отметить высокую частоту патоспермии у партнеров пациенток в обеих группах: у 72 (68,6%) и 86 (63,7%) партнеров соответственно (p = 0,43). Среднее число зрелых ооцитов, полученных у пациенток в группах 1 и 2, составило, соответственно, 8 (5–11) и 7 (4–11) (p = 0,26), уровень фертилизации — 0,90 (0,75–1,0) и 0,92 (0,80–1,0) (p = 0,39), число зигот — 6 (4–9) и 6 (4–10) (p = 0,37), число бластоцист было одинаково в двух группах 3 (1–5), число бластоцист отличного качества — 1 (0–3) и 1 (0–2) (p = 0,19), число бластоцист плохого качества — 1 (0–2) в двух группах.

При исследовании связи уровня аФЛ и параметров оогенеза и эмбриогенеза была выявлена значимая слабая отрицательная корреляционная связь между уровнем анти-ФЭ IgG-антител и числом полученных зрелых ооцитов (r = –0,129, p = 0,045) и зигот (r = –0,132, p = 0,041).

В остальных случаях корреляционные связи между другими аФЛ и параметрами оогенеза и эмбриогенеза не были статистически значимыми. Следует отметить, что средний уровень анти-ФЭ IgG-антител был значимо выше у пациенток в группе 2 и особенно в подгруппе 2б у пациенток, перенесших COVID-19 в среднетяжелой форме. Коме того, доля пациенток с повышенным уровнем анти-ФЭ IgG-антител в группе 2 была значимо выше по сравнению с группой 1.

При оценке исходов программ ВРТ показано, что частота наступления беременности (ЧНБ) и родов у пациенток в двух группах значимо не различалась: биохимическую беременность наблюдали у 32 (30,5%) и 39 (28,9%) женщин (p = 0,79), клиническую беременность — у 30 (28,6%) и 39 (28,9%) (p = 0,96), роды — у 27 (25,7%) и 30 (22,2%) (p = 0,53). Важно отметить, что в подгруппе 2б со среднетяжелой формой COVID-19 в анамнезе выявлена более высокая частота самопроизвольных прерываний беременности до 12 недель (у 6 (12%)) по сравнению с группой 1 (у 3 (2,9%)) (p = 0,024). Показатель ОШ для самопроизвольного выкидыша в подгруппе 2б при сравнении с группой 1 составил 2,1 (95% ДИ = 1,1; 19,4) (p = 0,036). Следует подчеркнуть, что у 3 из 6 пациенток с выкидышами был отмечен повышенный сывороточный уровень IgM-антител к ФЭ и АнV.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ряд научных исследований демонстрирует отсутствие негативного влияния COVID-19 на исходы программ ВРТ [2, 7, 22]. О том же свидетельствуют работы, сравнивающие результаты программ ВРТ в доковидный и ковидный периоды [23, 24]. Однако имеются публикации, в которых обсуждается возможное негативное влияние перенесенной инфекции на репродуктивную функцию женщин [6, 25, 26]. Одним из проявлений постковидного синдрома могут быть нарушения репродуктивной функции, проявляющиеся, в том числе, в нарушении фертильности и невынашивании беременности [6]. Описаны отдельные случаи развития бесплодия у фертильных пациенток молодого возраста или преждевременной недостаточности яичников после перенесенного COVID-19 [25, 26]. Тяжесть течения COVID-19 может оказывать влияние на частоту осложнений беременности [27].

Предполагается, что COVID-19 может вызывать аутоиммунные процессы у генетически предрасположенных людей [28]. У пациентов, перенесших COVID-19, описано развитие таких аутоиммунных патологий, как иммунная тромбоцитопеническая пурпура, синдром Гийена– Барре, синдром Миллера–Фишера [16]. У пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, выявлена значительная распространенность аутоантител разной специфичности: антинуклеарных — у 57,5%, антител к цитоплазме нейтрофилов — у 25%, КЛ — у 12,5%, β₂-ГП-I — у 5% [14].

В настоящем исследовании показана высокая суммарная частота выявления аФЛ классов M и G в исследуемых группах у пациенток с бесплодием как у переболевших, так и у не болевших COVID-19. Следует отметить, что наиболее часто выявлялось повышение уровня некритериальных антител к ФЭ и АнV, значимо реже наблюдалось повышение классических аФЛ, а именно к КЛ и β₂-ГП-I, которые относятся к лабораторным критериям АФС, принятым в настоящее время. Эти результаты согласуются с полученными нами ранее данными о низкой частоте выявления антител к КЛ и β₂-ГП-I и более высокой частоте выявления антител к АнV у больных COVID-19 [29].

При отдельном рассмотрении частоты выявления аФЛ классов M и G показано, что частота повышения уровня IgG-антител к ФЭ и АнV была значимо выше у пациенток, перенесших COVID-19 за менее чем 12 месяцев до программы ВРТ, по сравнению с пациентками, не болевшими ранее COVID-19. Как известно, у больных COVID-19 отмечается предрасположенность к провоспалительным и гиперкоагуляционным состояниям, повышению риска тромботических событий и нарушению коагуляции. Повышенная активация клеток эндотелия сосудов, экстернализация фосфолипидов, повышение содержания естественных антикоагулянтов, связывающих фосфолипиды на поверхности поврежденного эндотелия, в частности АнV, может приводить к повышенному образованию аутоантител к АнV [29].

Кроме того, у пациенток, перенесших COVID-19, отмечены более высокие средний уровень IgGантител к ФЭ и частота повышения их уровня, чем у пациенток, не болевших COVID-19. Известно, что антитела к ФЭ могут образовываться при инфекционновоспалительных процессах вирусной или бактериальной природы и длительно персистировать в организме человека. Это связано с тем, что ФЭ является главным липидным компонентом микробных мембран, а также широко представлен в мембранах клеток человека с асимметричным распределением. Продукция провоспалительных медиаторов и повреждение клеток и тканей при инфекционно-воспалительных процессах способствуют экспонированию ФЭ в клеточных мембранах и образованию аутоантител к ФЭ.

Выявленная отрицательная корреляционная связь между уровнем IgG-антител к ФЭ и числом полученных зрелых ооцитов и зигот может косвенно свидетельствовать о возможном негативном влиянии некоторых аФЛ, персистирующих после перенесенного COVID-19, на исходы программ ВРТ.

В настоящем исследовании показано, что параметры оогенеза, эмбриогенеза, ЧНБ и частота родов не различались значимо в группах пациенток, переболевших и не болевших COVID-19, что согласуется с приведенными выше данными других исследователей. Однако у пациенток, перенесших COVID-19 в среднетяжелой форме, отмечена высокая частота самопроизвольных выкидышей до 12 недель гестации, а риск развития выкидыша был в 2,1 раза выше по сравнению с пациентками, не болевшими ранее COVID-19. Так как у половины пациенток с ранним выкидышем были обнаружены антитела к ФЭ и АнV, можно предположить участие аутоиммунных механизмов в развитии данных осложнений беременности. Как известно, антитела к ФЭ и АнV ассоциируются с привычным выкидышем и являются значимыми факторами риска этого осложнения беременности.

ВЫВОДЫ

У пациенток с бесплодием с высокой частотой выявляются антифосфолипидные антитела. У пациенток, перенесших COVID-19 в среднетяжелой форме до вступления в программу ВРТ, чаще отмечается повышение сывороточного уровня IgG-антител к ФЭ и АнV, чем у пациенток, не болевших COVID-19. Предполагается, что COVID-19 может оказывать негативное влияние на репродуктивные исходы, приводить к получению меньшего числа зрелых ооцитов, зигот и, как следствие, эмбрионов в программах ВРТ, повышать риск самопроизвольного прерывания беременности на ранних сроках, что может быть связано с вовлечением аутоиммунных механизмов, опосредованных образованием аФЛ, в частности к ФЭ и АнV.