Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) — патогенный микроорганизм, вызывающий серьезные инфекционные заболевания кожи и мягких тканей, а также инвазивные инфекции, такие как пневмония, эндокардит, остеомиелит и другие [1]. Терапия подобных заболеваний затруднена в связи с широким распространением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), среди которых наиболее клинически значим метициллинустойчивый золотистый стафилококк (MRSA, от англ. methicillin resistant Staphylococcus aureus). В 2019 г. из-за проблемы антибиотикоустойчивости умерло около 4,95 млн человек; одной из ведущих причин летальных исходов были стафилококковые инфекции, причем на метициллин-устойчивые штаммы пришлось более 100 000 смертей [2]. В России на 2020 г. доля бактерий рода Staphylococcus, устойчивых к таким антибиотикам, как тетрациклин, гентамицин, эритромицин и оксациллин, составила 15–25%, а к левофлоксацину и ципрофлоксацину подавляющее большинство штаммов проявляли промежуточный уровень устойчивости [3]. В последнее время зафиксированы отдельные случаи возникновения устойчивости к ванкомицину и линезолиду, являющихся препаратами выбора в терапии MRSA-инфекций [4, 5]. Подобная статистика подчеркивает необходимость поиска альтернативных антимикробных агентов, в качестве которых могут быть рассмотрены препараты бактериофагов [6, 7].

Бактериофаги (фаги) — вирусы, естественным путем заражающие клетки прокариот. В качестве терапевтических агентов используют только вирулентные (литические) фаги, что необходимо для исключения возможной передачи детерминант антибиотикоустойчивости, а также генов бактериальных токсинов посредством горизонтального переноса [8]. Фаговые препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с антибиотиками. Так, вирулентные бактериофаги способны вызывать лизис бактерий вне зависимости от их чувствительности к антибиотикам, что делает фаги мощным средством борьбы с устойчивыми штаммами. Другое преимущество — в отсутствии побочных эффектов на организм пациента, что позволяет безопасно применять препараты на основе вирулентных бактериофагов даже в сложных клинических случаях [9].

В настоящее время использование бактериофагов является одним из многообещающих подходов в лечении стафилококковых инфекций, вызванных штаммами с МЛУ [10]. Успешность их применения подтверждена клиническими экспериментами как на животных моделях [11], так и на человеке [12]. Отдельно стоит отметить эффективность использования препаратов бактериофагов против биопленок, образуемых золотистыми стафилококками [10].

Наиболее перспективной стратегией терапии заболеваний, вызванных штаммами с лекарственной устойчивостью, представляется комбинированное использование бактериофагов и антибиотиков [13, 14]. В ряде публикаций для различных патогенов показано, что совместное применение полулетальных доз антибиотиков и бактериофагов эффективнее, чем их отдельное использование [13, 15]. Впервые положительный эффект такой комбинации был описан в 2007 г. [13]. В настоящее время показано, что совместное использование бактериофага и антибиотика может также приводить к нейтральным и отрицательным эффектам [16, 17].

Повышение эффективности при совместном использовании (взаимодополняющее влияние) антибактериальных агентов можно объяснить наличием одного из эффектов — аддитивного или синергетического. При аддитивном эффекте более активное подавление роста клеток достигается за счет суммирования антибактериального действия агентов. При синергизме эффективность комбинации значимо выше, чем при использовании каждого компонента индивидуально и их суммы. В случае нейтрального эффекта результат совместного использования препаратов значимо не отличается от результата действия хотя бы одного из антимикробных агентов. При антагонизме действие одного агента может подавлять действие другого. Надо отметить, что антагонистическое взаимное воздействие бактериофагов и антибиотиков показано лишь в единичных случаях [17].

На сегодняшний день описываемые эффекты обнаружены при комбинированном применении бактериофагов и некоторых антибиотиков (ванкомицина, даптомицина, оксациллина) против S. aureus [12, 17]. Однако, учитывая генетическую и фенотипическую гетерогенность патогена и даже лабораторных штаммов, для выявления закономерностей возникновения того или иного результирующего эффекта важно проверять пригодность потенциальных пар фаг-антибиотик на большем наборе бактериальных изолятов.

Целью настоящей работы было оценить эффект комбинированного воздействия литического бактериофага семейства Herelleviridae и антибиотиков различных классов на клинические штаммы Staphylococcus aureus с МЛУ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы

В исследовании использовали штаммы S. aureus (SA64, SA413, SA1050 и SA515/1) из коллекции лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального научно-клинического центра физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России. Культивирование бактерий проводили в течение 18–24 ч на питательной среде LB (от англ. lysogeny broth) (Oxoid; Великобритания) при температуре 37 °С. Типирование штаммов проводили методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) с использованием стандартной схемы [14]. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) антибиотиков проводили методом серийных разведений в соответствии с стандартами CLSI [18]. МИК определяли для шести антибиотиков: оксациллина, ванкомицина, гентамицина, тетрациклина, левофлоксацина, линезолида (Sigma-Aldrich; США).

Бактериофаг

Бактериофаг vB_SauM-515A1 (семейство Herelleviridae) был ранее выделен из коммерческого комплексного фагового препарата «Бактериофаг стафилококковый» серии P332 («Микроген»; Россия) на штамме-хозяине S. aureus SA515. Детальная характеристика бактериофага представлена ранее [19, 20].

Определение титра исследуемого бактериофага на тестируемых штаммах

Титр определяли методом титрования по Грациа, как описано ранее [21]. Для этого аликвоты (5 мкл) десятикратных последовательных разведений препарата бактериофага (сток 2 × 10⁹ бляшкообразующих единиц/мл, или БОЕ/мл) наносили на поверхность чашек с полужидким LB-агаром (0,6% агара), содержащих 0,1 мл ночной культуры тестируемого штамма (10⁶ колониеобразующих единиц/мл, или КОЕ/мл), и инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Для тестируемых штаммов оценивали концентрацию фаговых частиц в БОЕ/мл. Эффективность лизиса бактериофагом исследуемых штаммов оценивали на основании расчета эффективности посева (EOP, от англ. efficiency of plating) [19].  EOP представляет собой отношение титра бактериофага на исследуемом штамме к титру бактериофага на штамме-хозяине (SA515/1), выраженное в процентах. Оценку эффективности посева проводили в трех повторностях.

Изучение комбинированного воздействия антибиотиков и бактериофага

Совместное воздействие антибиотиков и бактериофагов изучали как описано ранее [17]. Эксперименты проводили в плоскодонных 96-луночных планшетах (Thermo Scientific; США) в объеме 200 мкл в среде LB. Инокулировали бактериальными клетками в экспоненциальной фазе роста (OD₆₂₀ = 0,2; 5 × 10⁸ КОЕ/мл) до конечной концентрации 10⁴ клеток в лунке. Бактерии инфицировали отдельно фагом в четырех различных значениях множественности инфекции (MOI, от англ. multiplicity of infection) (0,01; 0,001; 0,0001; 0,00001), воздействовали отдельно антибиотиками, а также комбинацией двух антибактериальных агентов в различных концентрациях. Препараты антибиотиков использовали в концентрациях 1/8 МИК, 1/4 МИК, 1/2 МИК. В качестве положительного контроля использовали инокулированную питательную среду без добавления антибактериальных агентов; в качестве отрицательного — чистую среду. Динамику воздействия фагов и антибиотиков на бактерии определяли с помощью измерений оптической плотности непрерывно в течение 10 ч и после 24 ч инкубации при 37 °С с помощью микропланшетного фотометра Multiscan Ascent (Thermo electron corporation; Финляндия) при 620 нм. На основании значений оптических плотностей построены кривые роста штаммов S. aureus, инфицированных бактериофагом при различных значениях MOI. Наличие взаимодополняющего эффекта в отдельных случаях подтверждали на основании сравнения конечных значений OD в последней точке (24 ч), как было описано ранее [15].

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы Graph Pad Prism версии 8.0.1 (GraphPad Software Inc.; США) на основании данных t-теста. В ходе анализа сравнивали значения оптической плотности, полученные через 24 ч инкубации для проб, обработанных только одним из антимикробных агентов (антибиотик/бактериофаг) с аналогичными значениями для проб, обработанных одновременно обоими агентами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы были охарактеризованы по сиквенс-типам (ST, от англ. sequence type), проверены на чувствительность к бактериофагу и антибиотикам (табл. 1). По результатам МЛСТ было показано, что штаммы S. aureus принадлежали к сиквенс-типам ST1, ST8 и ST121. Все образцы характеризовались МЛУ, среди них были выявлены штаммы, устойчивые к оксациллину (SA515/1), гентамицину (SA64, SA413, SA515/1), левофлоксацину (SA64, SA413) и линезолиду (SA413). К тетрациклину были устойчивы все исследуемые бактерии. Для трех штаммов выявлен промежуточный уровень устойчивости к ванкомицину и линезолиду (SA64, SA1050, SA515/1). Бактериофаг vB_SauM-515A1 вызывал лизис всех исследуемых бактерий. Наибольшая эффективность лизиса, превышающая значения для штамма-хозяина (SA515/1) более чем в 2,5 раза, показана для штаммов SA64 (267%) и SA413 (283%). Менее активно бактериофаг лизировал штамм SA1050 (72%).

Для изучения комбинированного воздействия антимикробных агентов были определены оптимальные значения MOI при помощи кривых роста бактериальных культур, инфицированных бактериофагом (рис. 1). Для штамма хозяина SA515/1 наблюдали снижение оптической плотности по сравнению с неинфицированным контролем при значении MOI, равном 0,01 и 0,001, при этом соотношение бактериофага и клеток, соответствующее MOI 0,01, к 24 ч вызывало полное подавление роста. Таким образом, наиболее интересными для исследования взаимного влияния бактериофага и антибиотика на культуру клеток штамма SA515/1 являются эксперименты с использованием MOI 0,001. Эффективность лизиса штамма SA1050 бактериофагом vB_SauM-515A1 была ниже, чем у штамма-хозяина, в связи с чем при MOI = 0,01 и MOI = 0,001 происходит лишь частичное подавление роста клеток: к 24 ч по сравнению с неинфицированным контролем оптическая плотность падает с 0,6 до 0,44 и 0,4 соответственно. Для штаммов SA413 и SA64 показана большая эффективность лизиса, чем для штамма хозяина, оптимальным соотношением vB_SauM-515A1 и клеток SA413 является MOI 0,001, а для штамма SA64 — 0,0001 и 0,00001.

Эффективность влияния комбинированного воздействия антибиотика (оксациллина, ванкомицина, тетрациклина, гентамицина, левофлоксацина и линезолида) с бактериофагом vB_SauM-515A1 оценивали для штаммов, устойчивых к выбранному антибиотику или проявляющих промежуточный уровень устойчивости. Взаимодополняющие эффекты оксациллина и бактериофага vB_SauM-515A1 рассматривали на примере единственного устойчивого к оксациллину штамма SA515/1. Бактериофаг усиливал действие антибиотика при оптимальном для этого штамма MOI, равном 0,001, и концентрации антибиотика 1/4 и 1/8 МИК (рис. 2, табл. 2). Похожий эффект наблюдали и для концентрации оксациллина 1/2 МИК, но данный результат статистически не достоверен.

Для других штаммов большинство случаев взаимодополняющих эффектов было зарегистрировано при совместном использовании бактериофага с тетрациклином либо линезолидом (рис. 2, табл. 2). В случае с SA64, SA413 и SA1050 данные антибиотики совместно с бактериофагом вызывали более эффективный лизис, чем каждый из антимикробных агентов по отдельности, причем в различных сочетаниях концентраций (табл. 2). Надо отметить, что взаимодополняющие эффекты чаще всего были выявлены при оптимальном значении MOI для каждого из штаммов и концентрации антибиотика в 1/2 МИК.

Взаимодополняющие эффекты при использовании бактериофага с ванкомицином, гентамицином и левофлоксацином на исследуемых штаммах S. aureus выявлены не были. Кроме того, ни для одного из исследуемых штаммов не были показаны эффекты антагонизма при совместном использовании антибиотика (оксациллина, ванкомицина, тетрациклина, гентамицина, линезолида и левофлоксацина) и бактериофага vB_SauM515A1 (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Широкое распространение инфекций, вызванных штаммами S. aureus с МЛУ, является серьезной проблемой современного здравоохранения. Один из вариантов ее решения — совместное использование антибиотиков с бактериофагами. В настоящей работе для изучения комбинированного воздействия двух агентов на штаммы S. aureus с МЛУ был использован ранее охарактеризованный представитель семейства Herelleviridae — литический бактериофаг vB_SauM-515A1 [20, 22]. Стафилофаги семейства Herelleviridae — одни из наиболее эффективно применяемых в терапии [19]. Они облигатно вирулентны и обладают широким спектром литической активности [19]. Последнее согласуется с результатами настоящего исследования: бактериофаг vB_SauM-515A1 эффективно подавлял рост всех исследуемых штаммов S. aureus, принадлежащих к клинически значимым сиквенс-типам с высокой частотой встречаемости (табл. 1) [23, 24]. 

Для оценки комбинированного действия литического бактериофага и антибиотиков были выбраны препараты, используемые в терапии различных инфекционных заболеваний, вызванных стафилококками (оксациллин, ванкомицин, гентамицин, тетрациклин, левофлоксацин, линезолид) [25, 26]. Вышеперечисленные антибиотики относятся к разным классам, для каждого из которых характерен свой механизм действия на бактериальную клетку. Важно отметить, что в работе были исследованы препараты как с бактериостатическим (тетрациклин, гентамицин, линезолид), так и с бактерицидным действием (оксациллин, ванкомицин, левофлоксацин). Исследуемые штаммы в большинстве случаев были устойчивы к данным антибиотикам.

В настоящем исследовании были выявлены случаи взаимодополняющего эффекта препаратов (оксациллина, тетрациклина, линезолида) и бактериофага vB_SauM-515A1, что согласуется с работами других авторов. Так, для оксациллина и линезолида ранее было показано, что совместное применение препаратов с литическим бактериофагом Sb-1 в большинстве случаев более эффективно ингибировало рост штаммов S. aureus [17, 25]. В свою очередь комбинация тетрациклина в определенной концентрации и бактериофага семейства Herelleviridae приводила к более эффективному подавлению роста устойчивых биопленкообразующих штаммов S. aureus, превосходя эффективность фага [27].

В недавно проведенном исследовании зарубежных коллег были получены противоположные результаты [28]. Авторы работы показали, что вне зависимости от типа антибиотика одновременное его использование с литическим бактериофагом не приводит к значимому повышению эффективности ингибирования роста бактерий. Подобное расхождение можно объяснить зависимостью результата от использованного штамма бактерии-мишени [9]. Так, в настоящей работе комбинированное воздействие тетрациклина и линезолида с фагом на штамм SA515/1 не приводило к подавлению роста, в то время как при действии этих же комбинаций на другие штаммы взаимодополняющий эффект присутствовал.

При обнаружении положительных эффектов комбинированного использования антибиотиков и бактериофагов важным фактором является подбор оптимальных полулетальных концентраций обоих агентов. При соответствующих концентрациях вероятнее всего происходит суммирование их антибактериальных действий, что наблюдалось в ходе проводимых работ (рис. 2, табл. 2). Эффективность совместного использования бактериофагов с антибиотиками может быть также обусловлена преодолением механизмов антибиотикоустойчивости в процессе взаимодействия клетки с вирусной частицей. Ранее было показано, что литический фаг устойчивого штамма Pseudomonas aeruginosa использует в качестве рецептора мембранный белок порин, необходимый для оттока антибиотических препаратов. Чтобы приобрести устойчивость к фагу, бактерия вынуждена избавиться от системы эффлюкса, вновь становясь чувствительной к антибиотику [29]. Таким образом, воздействие бактериофага на клетку может обеспечивать селективный отбор клонов, повышая чувствительность бактериальной культуры к антибиотикам.

Важно отметить, что антагонизма, а именно снижения эффективности действия одного антибактериального агента (антибиотик/бактериофаг) в присутствие другого, во всех исследуемых комбинациях не наблюдалось. Низкая частота встречаемости подобных негативных случаев была показана и в других работах [17, 27].

На данный момент остается неясным, что лежит в основе взаимного воздействия фагов и антибиотиков на бактериальную клетку. Более эффективное применение может быть обусловлено как простым суммированием действий каждого из антибактериальных агентов, так и их более сложным взаимным влиянием друг на друга, приводящим к более активному подавлению роста клеток. Для дальнейшего практического применения фагов в качестве терапевтических агентов в комбинации с антибиотиками необходимо детальное изучение причин проявления взаимодополняющих эффектов, что требует проведения дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

Результаты исследования показывают, что комбинация литического бактериофага vB_SauM-515A1 с антибиотиками различных классов может быть более эффективна по сравнению с отдельным использованием антибактериальных агентов. Таким образом, исследуемый фаг может быть рассмотрен в качестве перспективного терапевтического агента против штаммов S. aureus с МЛУ. Полученные данные могут быть использованы при дальнейшем изучении эффектов комбинированного применения двух антибактериальных агентов различной природы.