Среди разнообразных оболочечных опухолей центральной нервной системы (ЦНС) менингиомы наиболее клинически значимы. Эти часто встречающиеся у взрослых образования головного мозга составляют более 36% от общего числа новодиагностированных опухолей ЦНС [1, 2].
В подавляющем большинстве случаев их обнаруживают случайно, т. е. на начальном этапе заболевание развивается бессимптомно, однако в 15% случаев можно наблюдать клиническую симптоматику. С увеличением возраста отмечается увеличение частоты встречаемости менингиом, при этом достоверно чаще они встречаются у женщин репродуктивного возраста; соотношение женщин и мужчин в этой группе составляет 2 : 1 [3]. Предполагается, что это может быть обусловлено особенностями гормонального профиля женщин. Клиническая симптоматика при менингиомах отличается значительной вариабельностью и зависит от локализации опухоли. Как и при других интракраниальных опухолях, при менингиомах могут иметь место проявления внутричерепной гипертензии в виде головной боли, тошноты, рвоты, снижения остроты зрения [4].

Первым этапом лечения симптоматических менингиом является их микрохирургическое или эндоскопическое удаление с максимально возможной радикальностью [5, 6]. В последнее время разработано множество методов, используемых для визуализации опухолей головного мозга, однако в большинстве случаев в клинической практике определение границ опухоли не производят в режиме реального времени. В настоящее время методы магнитно-резонансной томографии, преимущественно используемые на предоперационном этапе, имеют как диагностическое, так и оперативно-навигационное применение. Другие клинически значимые методы включают флуоресцентный молекулярный имаджинг [7] (его применение ограничено в основном специфичностью и чувствительностью проводимого исследования) и интраоперационное ультразвуковое исследование (неприменимо, если плотность опухоли близка к плотности интактной ткани). Гистопатологические методы являются золотым стандартом при исследовании опухолей и позволяют получить диагностическую информацию во время операции в течение получаса, но обычно они ограничены оценкой одного или небольшого количества сегрегированных образцов от каждой операции и не используются для оценки границы краев опухоли.

Для увеличения эффективности хирургического вмешательства идет разработка различных технологий интраоперационной диагностики [8, 9], позволяющих контролировать состав удаляемой ткани, и основанных в том числе на молекулярном профилировании иссекаемых тканей [10–13]. Например, ганглиозиды используют для дифференциации астроцитомы [14]. Липидные профили, онкометаболиты и специфичные нейрометаболиты, такие как н-ацетиласпартат (NAA), тоже используют для определения границ опухоли [15, 16].

Методы прямой масс-спектрометрии позволяют анализировать иссекаемые ткани практически в режиме реального времени. Регистрируемые молекулярные профили содержат информацию как о метаболическом профиле тканей, так и об изменении соотношения различных липидов, что позволяет построить автоматические классификаторы, определяющие присутствие и долю злокачественных клеток в исследуемом образце [17, 18]. Так, при помощи методов, основанных на экспресс- экстракции липидов и метаболитов из ткани [13, 17, 19] либо на ионизации после касания (touch spray ionization) [15, 20, 21], были разработаны методы дифференциации различных опухолей от интактной ткани. Однако специфика молекулярного строения оболочечных опухолей ЦНС ставит задачу выбора метода прямой ионизации, оптимального для дальнейшего развития методов интраоперационной диагностики менингиом. Целью данной работы было провести сравнение трех методов масс-спектрометрического профилирования и определить их применимость для решения задач дифференциации опухолевой и интактной ткани у пациентов с менингиомой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Гистологически аннотированные и анонимизированные образцы менинигиом были предоставлены НМИЦН им. Н. Н. Бурденко. Все образцы получены в рамках плановых операций по резекции патологической ткани головного мозга.
Три метода молекулярного профилирования были применены к образцам оболочечных опухолей головного мозга человека: метод прямого спрея с ткани (spray from tissue, SFT) [22, 23], метод картриджной экстракции (inline cartridge extraction, ICE) [17], ионизация с поверхности сферического волокнистого пробоотборника, или прямая экстракционная ионизация (touch spherical sampler probe spray, SSP) [21].

Для анализа образцов менингиом с помощью метода прямого спрея с ткани [22, 23] образец размером около 2 мм2 помещали на острие одноразовой инъекционной иглы, расположенной на расстоянии 10 мм от входного интерфейса в вакуумную систему масс-спектрометра. Для подачи растворителя к образцу использовали капилляр из кварцевого стекла (fused silica) (рис. 1).

Для экстракции липидов и метаболитов растворитель подают по капилляру непосредственно на поверхность образца, в результате чего молекулы экстрагируются из образца. Для ионизации молекул к инъекционной игле прикладывают высокое напряжение, до 4–6 кВ (подбирают эмпирически исходя из геометрических параметров образца), что обеспечивает формирование конуса Тейлора и электрораспыление на конце иглы, непосредственно после экстракции молекул. Скорость потока растворителя для экстракции составляет 3 мкл/мин.

Для реализации метода картриджной экстракции [17] в линию для подачи растворителя посредством стандартных соединений для подачи растворов вставляют одноразовый картридж с образцом (рис. 2).

Картридж представляет собой трубку из нержавеющей стали, внутренний диметр которой составляет 1,8 мм. В картридж помещают образец объемом приблизительно 1 мм2, молекулы из которого экстрагируются растворителем, протекающим через линию подачи растворителя. Для соединения с линией в трубку вставляют два коротких участка капилляра PEEK (polyether ether ketone) и обжимают для предотвращения утечек. Фильтр из стекловолокна в картридже предотвращает попадание макроскопических частей образца в линию и ее перекрывания. После картриджа на конце линии установлен стандартный коммерчески доступный ионный источник электрораспыления. Напряжение на ионном источнике составляет 3 кВ в режиме регистрации положительно-заряженных ионов и 4 кВ в режиме регистрации отрицательно-заряженных ионов. Скорость потока растворителя для экстракции составляет 2 мкл/мин.

В методе ионизации с поверхности сферического волокнистого пробоотборника [21] используют объемные пробоотборники с последующей ионизацией электрораспылением непосредственно с их поверхности. Пробоотборники представляют собой стержень из очищенных и прессованных полимерных волокон (полиэтилентерефталат) длиной 10 мм, диаметром 2 мм. Процедура отбора включает в себя забор образца с помощью пористого объемного пробоотборника посредством мазка. В дальнейшем пробоотборник закрепляют в специальном ионном источнике, в котором обеспечивается подведение растворителя (80 мкл) и высокого напряжения (5 кВ) для осуществления электрораспыления.

Для сравнения эффективности применения различных методов прямой ионизации проводили анализ трех образцов менингиомы, полученных от трех пациентов. Каждый образец менингиомы разделяли на три части и анализировали каждым из предложенных методов. Результаты исследования валидировали на образцах менингиом, полученных от трех различных пациентов. Эксперименты проводили с использованием гибридного масс-спектрометра LTQ XL Orbitrap ETD (ThermoFisher; США) в режиме полного сканирования с m/z 100–2000. Масс-спектры были получены с использованием масс- анализаторов как низкого разрешения (ионной ловушки LTQ XL в режиме сканирования «normal»), так и высокого разрешения (Orbitrap с разрешением 30 000 FWHM при m/z = 400). Температура нагревательного капилляра на входе в масс-спектрометр составляла 220 °С. Для приготовления рабочего раствора для экстракции использовали метанол (MeOH, > 99,9% ВЭЖХ; Merck KgaA; Германия), изопропанол (i-PrOH, > 99,9% ВЭЖХ; Merck KGaA, Германия), ацетонитрил (ACN, > 99.9% ВЭЖХ; Merck KgaA, Германия), уксусную кислоту (CH3COOH, > 99%; Merck KgaA, Германия) и деионизированную воду, чистоту которой контролировали по значению удельного сопротивления, составлявшего не менее 17 МОм•см. Для экстракции использовали растворитель, состоящий из MeOH, i-PrOH, ACN и H₂O в отношении 3 : 3 : 3 : 1 (об.), с добавлением 0,1% (об.) CH3COOH, оптимально экстрагирующий молекулы липидов и метаболитов из мягких тканей и подходящий для применения в источниках ионизации электрораспылением.
Наиболее интенсивные пики идентифицировали по их точной массе с помощью ПО LipiDex [24], и по их изотопному распределению с помощью ПО Xcalibur™ (Thermo Scientific-Хосе; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При регистрации масс-спектров в высоком разрешении в режиме регистрации положительных ионов все три метода: SFT (рис. 3), ICE (рис. 4А) и SSP (рис. 4Б) характеризуются схожими по составу и относительной интенсивности спектрами ионов, связанных с липидами (в диапазоне m/z 600–900). Положительные ионы зарегистрованы в виде протонированных ионов или ионов, катионизированных натрием или калием). В спектрах SFT не наблюдали интенсивную группу пиков в области m/z 1450–1650, представляющую собой суперпозицию групп пиков, характерных как для кардиолипинов, так и для димеров мембранных липидов. Значения отношения сигнала к шуму близки у спектров SFT и ICE, а для пробоотборника этот показатель существенно (в 2–4 раза) ниже, что затрудняло поиск и анализ пиков малой интенсивности.

В низком разрешении для спектров положительных ионов наблюдается схожая картина. Для SFT также выявлена большая (приблизительно в 2,5 раза) интенсивность пиков липидов (рис. 5А), и, соответственно, меньшая относительная (но не абсолютная) интенсивность пиков в области m/z 100–400 в сравнении с методом ICE (рис. 5Б), в то время как для SSP обнаружена сниженная интенсивность в характерной для липидов области спектра, но увеличенная интенсивность и разнообразие пиков в области малых масс, в которой регистрируются метаболиты (рис. 5В).

Во всех спектрах для высокого разрешения в отрицательных ионах выявлены характерные пики липидов (рис. 6 и рис. 7). Значения интенсивности сигналов молекул различных классов варьируют между методами в значительно меньшей степени, нежели в режиме регистрации положительно заряженных ионов. Однако только для двух методов прямой ионизации (ICE и SSP) в спектрах удалось зарегистрировать ионы, соответствующие нейрометаболиту NAA, характерному для интактной нервной ткани [25, 26]. Присутствие данного метаболита свидетельствует о том, что исследованные образцы были взяты с границы опухоли. Для низкого разрешения в отрицательных ионах спектры, как и в высоком разрешении, похожи по представленным ионам липидов (результаты полностью аналогичны случаю регистрации масс-спектров высокого разрешения и здесь не представлены). Однако NAA не удалось идентифицировать ни в одном из спектров, полученных в данном режиме.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Быстрый анализ ткани с помощью прямой масс- спектрометрии рассматривают как инструмент для молекулярной диагностики опухолей ЦНС. Несмотря на привлекательность методов молекулярного профилирования, встраиваемых в хирургический инструмент [11, 19], их применение сопряжено с недостатками, аналогичными применению интраоперационной томографии. Необходимость оборудования каждой операционной дорогостоящим масс-спектрометром, а также сложность сертификации подобных комплексов затрудняет их внедрение в клиническую практику. В то же время методы офлайн-анализа [13, 17], в которых образец ткани берут in vivo в процессе резекции, а затем анализируют ex vivo в патоморфологической лаборатории, легко встраиваются в рутинную практику, что обеспечивает быструю обратную связь хирургу для прецизионного иссечения опухоли. Будучи встроенным в стандартный процесс экспресс-гистологического исследования клинических образов, молекулярное профилирование предоставляет информацию об иссекаемых тканях в течение минут, причем скорость-лимитирующей стадией оказывается время транспортировки образца между операционной и лабораторией.

Каждый из рассмотренных методов прямой ионизации опухолевых тканей обладает набором характерных особенностей. Так, метод SFT позволяет исключить какие-либо «эффекты памяти» (т. е. наличия остаточных молекул предыдущего образца при анализе текущего, и их влияние на масс-спектр) за счет полностью одноразовых элементов источника ионов, контактирующих с анализируемым образцом. Однако стабильность ионизации, которая важна для получения надежных и повторяемых результатов исследования, оказывается зависимой от формы анализируемого образца ткани. Поскольку оболочечные опухоли головного мозга, как правило, имеют малую механическую жесткость и пластичны, контроль формы и размера образца представляется трудновыполнимой задачей, поэтому для каждого образца требуется дополнительная подстройка напряжения в ионном источнике, что снижает оперативность и требует значительной квалификации персонала.

Метод ICE, в свою очередь, обеспечивает высокую стабильность процесса ионизации за счет использования стандартного электрораспылительного источника масс-спектрометра. Ионные источники этого типа широко распространены и их применяют для анализа различных биологических молекул, в том числе используемых в медицинской диагностике. Однако необходимость промывки ионного источника между пробами также снижает производительность метода, поскольку недостаточная очистка ионного источника может приводить к кросс-контаминации между образцами и, следовательно, ошибочной идентификации онкометаболитов в исследуемой пробе.

Метод SSP, основанный на использовании одноразовых пробоотборников, позволяет нивелировать как проблему перекрестного загрязнения образцов, характерную для метода ICE, так и упростить процесс анализа в сравнении с SFT. Сферическая форма жестких пробоотборников обеспечивает постоянство геометрии ионного источника, а также облегчает процесс пробоотбора, который заключается только в касании образца кончиком пробоотборника. Инертность материалов, из которых изготовлен проботборник, тоже позволяет использовать его для отбора проб непосредственно в операционной в случае осуществления соответствующей сертификации. Несмотря на указанные преимущества, метод SSP менее эффективен для анализа липидной компоненты молекулярного профиля, ионизируемой в режиме образования положительно-заряженных ионов. В первую очередь, к ним относятся фосфатидилхолины и другие компоненты клеточных мембран, которые значительно изменяются в процессе малигнизации. Однако в режиме регистрации отрицательно-заряженных ионов в спектре липидной компоненты наблюдаются, в частности, фосфатидилсерины, которые составляют значительную долю липидов в составе клеточных мембран интактной ткани головного мозга, что позволяет применять метод SSP для дифференциации опухолевой и интактной ткани по данным молекулярного профилирования.

В отличие от липидной компоненты, эффективность ионизации метаболитов малой массы, ионизируемых в диапазоне m/z 100–400, оказалась сравнимой для всех методов ионизации. Однако метаболический профиль, полученный при помощи метода SFT, был менее разнообразным — в нем наблюдается меньшее число масс-спектрометрических пиков. В первую очередь, ни в одном из экспериментов с помощью этого метода не удалось обнаружить NAA, который был зарегистрирован при одновременном исследовании данных образцов с использованием других методов ионизации. Такой результат, по всей видимости, связан с менее эффективной экстракцией водорастворимых метаболитов из цельного образца ткани в процессе омывания его растворителем в процессе ионизации в сравнении с более полной экстракцией в картридже, либо с эффективным переносом аналитов умеренной гидрофобности на поверхность волокнистого пробоотборника.

Метод прямой экстракционной ионизации с использованием объемного пробоотборника в режиме регистрации отрицательных ионов, в свою очередь, перспективен для экспрессной хирургической оценки края резекции опухоли. Вследствие сравнительно высокой интенсивности ионов в данном диапазоне представляется возможным регистрировать онкометаболит, в частности NAA, и обеспечивать оценку инфильтрации опухоли, которая имеет первостепенное значение при попытке максимизировать резекцию глиомы, что является благоприятным прогностическим фактором для пациентов с глиомой.

ВЫВОДЫ

Применение различных методов прямой ионизации для исследования образцов оболочечных опухолей ЦНС позволяет получить достаточно интенсивный молекулярный профиль, пригодный для дифференциации опухолевых тканей от интактных, как было продемонстрировано ранее для глиальных опухолей. Метод спрея с ткани позволяет получать спектры липидной компоненты тканей с высокой производительностью. Метод картриджной экстракции наиболее прост для реализации, но обладает наименьшей производительностью анализа. Метод ионизации с поверхности сферического волокнистого пробоотборника ограниченно применим для анализа липидной фракции, но эффективен с точки зрения обнаружения онко- и нейрометаболитов, а также отличается простотой реализации. Таким образом, выбор метода ионизации для клинического применения напрямую зависит как от требований к простоте реализации и производительности анализа, предъявляемых к осуществляющей его лаборатории, так и от набора классов биологических молекул, липидов или водорастворимых метаболитов, в наибольшей степени характеризующих конкретную нозологию с учетом ее степени злокачественности.