Пандемия новой коронавирусной инфекции 2019 г. (COVID-19), вызванная коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2), продолжает представлять собой угрозу для общественного здравоохранения во всем мире и увеличивает экономическое бремя. Распространение вируса среди людей все еще продолжается, и постоянно появляются новые варианты SARS-CoV-2, что приводит к острой потребности в препаратах для лечения этого заболевания, а также в расширенных исследованиях эффективности одобренных средств для лечения COVID-19.

Для лечения COVID-19 в РФ рекомендуют использовать несколько препаратов, обладающих специфическим противовирусным действием, среди которых фавипиравир и молнупиравир. Остается неизвестным, как изменилась эффективность данных препаратов по мере появления новых вариантов SARS-CoV-2.

Противовирусный препарат широкого спектра действия фавипиравир [1] нацелен на вирусную РНК- зависимую РНК-полимеразу (RdRP). Он эффективен как против сезонного вируса, так и против птичьего гриппа, а также SARS-CoV-2 в культуре клеток и in vivo в экспериментальных животных моделях. В организме человека фавипиравир фосфорилируется клеточными ферментами в его активную форму фавипиравир- рибофуранозил-5'-трифосфат (F-RTP). F-RTP не сильно влияет на клеточную транскрипцию. Существует несколько гипотез относительно того, как F-RTP взаимодействует с RdRp. Некоторые исследования показали, что при встраивании F-RTP в образующуюся цепь РНК он предотвращает удлинение цепи РНК и размножение вируса. Показано также, что присутствие аналогов пурина может снижать противовирусную активность фавипиравира, т. е. возможна конкуренция между F-RTP и пуриновыми нуклеозидами за связывание с RdRp. По результатам клинических исследований, фавипиравир не улучшает время излечения или клинические исходы и не демонстрирует противовирусного эффекта при лечении инфекции COVID-19 [2–4].

β-D-N4-гидроксицитидин (NHC, EIDD-1931) представляет собой аналог рибонуклеозида, обладающий широким спектром активности против различных РНК-содержащих вирусов [5]. Молнупиравир (MK-4482/EIDD-2801), или β-D-N4-гидроксицитидин-5'-изопропиловый эфир, является биологически активным пролекарством NHC. Он является пероральным препаратом и более удобен для массового применения среди людей, чем ремдесивир или другие противовирусные агенты, такие как реконвалесцентная плазма и нейтрализующие антитела, которые требуют внутривенных или внутримышечных инъекций и использования в стационаре. Было показано, что NHC эффективен против различных РНК-вирусов, таких как грипп, вирус Эбола (EBOV), вирус венесуэльского энцефалита (VEEV), SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV и родственных зоонозных групп 2b или 2c Bat-CoV в экспериментах in vivo и in vitro [6–8]. Серия доклинических и клинических испытаний доказала, что молнупиравир безопасен и эффективен для лечения инфекции SARS-CoV-2 [9, 10]. После перорального приема молнупиравир быстро превращается в активный NHC в плазме, распределяется в различных органах и превращается в соответствующий 5'-трифосфат с помощью киназ организма человека [11]. Известно, что 5'-трифосфат NHC является конкурентным субстратом для вирусной РНК- зависимой РНК-полимеразы, интегрируется в вирусную РНК и приводит к накоплению летальных мутаций в вирусном геноме [12].

С 2022 г. во всем мире доминирует новый вариант SARS-CoV-2 B.1.1.529 («Омикрон») и его дочерние подварианты, содержащие множественные мутации в вирусном геноме [13]. Мутации в RBD-домене S-гликопротеина снижают эффективность предсуществующих антител, полученных при естественно перенесенном COVID-19 и вакцинации [14]. С учетом появления новых вариантов SARS-CoV-2 целью данной работы было оценить эффективность фавипиравира и молнупиравира против различных вариантов SARS-CoV-2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на клеточной линии Vero E6 (ATCC CRL-1586). Клетки культивировали в ростовой среде DMEM (Gibco; США), дополненной 5%-й эмбриональной бычьей сывороткой (FBS; HyClone, США), 1× раствор антибиотика- антимикотика (Capricorn Scientific GmbH; Germany) и 1× GlutaMAX (Gibco; США). Для исследования антивирусного эффекта к монослою клеток добавляли различные разведения исследуемого соединения и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С и 5% CO2. После этого производили заражение вирусом SARS-CoV-2 при 100 TCID50 (TCID50 — тканевая цитопатогенная доза, вызывающая гибель 50% клеток монослоя). В данном эксперименте использовали следующие варианты вируса SARS-CoV-2: «Ухань» B.1.1 (PMVL-4), «Омикрон» ВА.4.6 (PMVL-55), «Омикрон» BA.5 (PMVL-52) и «Омикрон» BA.5.2 (PMVL-54). Ингибирование вирус-индуцированного цитопатического эффекта (СРЕ) под действием соединения определяли с помощью МТТ-теста [15].

Для животной модели инфекции использовали самок сирийских хомячков (питомник «Столбовая»; Россия). Животных содержали в индивидуально-вентилируемых клетках (температура 21–25 °С, влажность 20%, давление –0,1 кПа), со свободным доступом к еде и воде. Световой режим составлял 12 ч света и 12 ч темноты. Животные были разделены на экспериментальные группы (по 5–8 особей), которым перорально вводили молнупиравир (200 мг/кг), фавипиравир (200–300 мг/кг), и контрольную группу инфицированных животных. Производили интраназальное заражение животных при 10⁵ TCID50 SARS-CoV-2 штаммом PMVL-4 или PMVL-52. В течение четырех дней животным вводили исследуемые препараты два раза в день. На пятый день эксперимента животных подвергали эвтаназии ингаляцией CO2 и цервикальной дислокации, производили их вскрытие и забор легких. Легкие хомяков подвергали гомогенизации с последующим отделением супернатанта низкоскоростным центрифугированием при 12 000 об./мин в течение 10 мин. Титр вируса определяли в монослое клеток Vero Е6. Для каждого образца гомогената легких титр вируса определяли спустя 72 ч, и выражали в виде БОЕ/мг легкого (бляшкообразующие единицы). Тотальную РНК из гомогенатов легких выделяли с помощью реагента ExtractRNA («Евроген»; Россия) согласно инструкции производителя. Реакцию обратной транскрипции выполняли с помощью набора реагентов для количественного определения РНК коронавируса SARS-CoV-2 «SARS-CoV-2 FRT» с использованием панели охарактеризованных по количеству копий амплифицируемого фрагмента SARS-CoV-2 (НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи; Россия). Результаты выражали в виде чисел, преобразованных в log10 вирусной нагрузки SARS-CoV-2 на 1 мг ткани легкого.

ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе исследований проведена оценка цитотоксичности фавипиравира и молнупиравира в отношении клеток Vero E6. Было выяснено, что фавипиравир обладает выраженным цитотоксическим эффектом, в значительной степени ингибируя пролиферацию клеток в концентрации 1000 μМ (снижение жизнеспособности клеток до 60%). При всех остальных протестированных концентрациях фавипиравир дозозависимо проявлял цитотоксический эффект (рис. 1). Молнупиравир не оказывал заметного влияния на жизнеспособность клеток, ингибируя их пролиферацию при 200 μМ в среднем на 10%.

Исследование антивирусной активности препаратов фавипиравир и молнупиравир в отношении SARS-CoV-2 проводили с использованием четырех вариантов вируса: референс-штамм варианта «Ухань» (генетическая линия В.1.1) и трех вариантов вируса «Омикрон», циркулирующих в данный момент как в РФ, так и во всем мире (BA.4.6, BA.5 и BA.5.2)(рис. 2). Установлено, что в концентрации 1000 μМ фавипиравир не проявлял активности против референс- штамма из линии В.1.1. Ингибирование ~50% при той же концентрации (~160 мг/мл) выявлено для вариантов вируса «Омикрон» ВА.5 и ВА.5.2. Ингибирование варианта вируса «Омикрон» ВА.4.6 не превышало 20%. Молнупиравир показал широкий спектр антивирусной активности, ингибируя все используемые варианты вируса со значениями IC50 от 16.51 до 7.88 μМ.

Далее эффективность препаратов была исследована с использованием инфекционной животной модели. Сирийским хомякам перорально через зонд вводили 300 мг/кг фавипиравира или 200 мг/кг молнупиравира. Затем животных подвергали интраназальному заражению вирусом SARS-CoV-2 вариант «Ухань». Препараты давали животным два раза в день, в течение четырех дней. В ходе инфекции животные из контрольной инфицированной группы потеряли вес более чем на 20% (p < 0,01). Животные, получавшие фавипиравир, потеряли вес на 10% (p > 0,05), проявляли апатию и отказ от корма, что указывает на токсический эффект препарата. Животные, получавшие молнупиравир, набрали вес в ходе эксперимента (рис. 3).

Исследование вирусной нагрузки SARS-CoV-2 в легких животных показало, что как молнупиравир, так и фавипиравир снижают количество РНК (1 Log10). При определении инфекционного титра SARS-CoV-2 в легких животных было установлено, что все препараты подавляют репликацию вируса. Лечение животных с помощью молнупиравира и фавипиравира в значительной степени снижало титр вируса (~1,5 Log10). При исследовании эффективности препаратов на животных с использованием варианта вируса «Омикрон» ВА.5 было обнаружено, что данный вариант менее патогенен, по сравнению с вариантом вируса «Ухань». Испытуемым особям вводили одинаковые дозы препаратов (200 мг/кг). В ходе эксперимента животные набрали вес во всех исследуемых группах. Выявлено снижение вирусной нагрузки в легких на 1,5 Log10 для группы животных, получавших молнупиравир (EIDD-2801), однако данные статистически недостоверны (p > 0,05). При этом молнупиравир достоверно подавлял репликацию вируса в легких, что отображалось снижением БОЕ (~1,5 Log10; p < 0,05). Для фавипиравира снижение вирусной нагрузки (0,5 Log10) и титра жизнеспособного вируса (1 Log10) было менее выраженным и оказалось статистически недостоверным (p > 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Предыдущие исследования антивирусной активности фавипиравира против SARS-CoV-2 показывают, что он обладает невысоким противовирусным эффектом со значениями EC50 > 200 μM. Высокие дозы фавипиравира были связаны с признаками токсичности у животных при исследовании эффективности препарата [16], поскольку in vivo фавипиравир проявляет антивирусный эффект при двукратной дозировке в 300 мг/кг, со снижением инфекционного титра вируса в легких на ~ 1,5 Log10 [17]. В других работах показано, что фавипиравир проявляет активность со значением EC50 ~ 62 μM [18]. Полученные в ходе нашего исследования результаты тоже указывают на ограниченный противовирусный потенциал фавипиравира. При инфицировании клеток Vero E6 вирусом SARS-CoV-2 установлено, что данный препарат не обладает антивирусной активностью in vitro, а также проявляет цитотоксичность. Нами показана эффективность данного препарата в дозе 300 мг/кг два раза в день на животной модели инфекции с применением варианта вируса «Ухань». На животной модели с применением варианта вируса «Омикрон» при использовании сниженной до 200 мг/кг дозировки эффект оказался недостоверным. Однако изменения в поведении животных и снижение их веса при лечении фавипиравиром в дозе 300 мг/кг указывают на его токсический эффект и необходимость дальнейшего подбора дозы, чтобы сочетать отсутствие токсичности и сохранение активности препарата.

Исследования с использованием первичных клеток человека и других клеточных линий подтвердили, что NHC (активный метаболит молнупиравира) обладает мощной противовирусной активностью против различных коронавирусов, таких как SARS-CoV, SARS-CoV-2 и MERS-CoV. Значения IC50 для молнупиравира против SARS-CoV-2 составляли 0,3–0,08 μМ [19]. Нами установлено, что молнупиравир проявляет противовирусную активность для всех исследованных вариантов вируса SARS-CoV-2, с проявлением низкой цитотоксичности. Молнупиравир проявлял противовирусную активность на животных, инфицированных вирусом как варианта «Ухань», так и «Омикрон» ВА.5. В недавно проведенном исследовании молнупиравир тоже ингибировал репликацию вируса в легких хомяков, инфицированных вариантом вируса «Омикрон» [20]. Молнупиравир значительно ингибировал репликацию вируса в верхних и нижних дыхательных путях хомяков. При этом исследователи установили, что «Омикрон» менее патогенен для животных, по сравнению с более ранними генетическими линиями SARS-CoV-2 [21].

ВЫВОДЫ

Препарат фавипиравир проявлял достаточно низкий антивирусный эффект против SARS-CoV-2 в максимальной протестированной концентрации, которая обладала наиболее выраженным цитотоксическим эффектом. В связи с выраженным цитотоксическим потенциалом и слабой антивирусной активностью in vitro и in vivo требуется проведение дополнительных исследований безопасности и эффективности фавипиравира, проведение подбора дозировок, кратности применения, а также уточнение показаний к применению чтобы сочетать эффективность с минимальной токсичностью для организма человека. В случае молнупиравира мы наблюдали более выраженную эффективность и безопасность с использованием моделей in vitro и in vivo. Результаты в отношении активности против варианта «Омикрон» расширяют ранее полученные данные для обоих препаратов. Требуются дальнейшие усилия в происке новых ингибиторов и их композиций, обладающих более высокой специфичной противовирусной активностью. Необходимы дальнейшие исследования допущенных к применению средств фавипиравир и молнупиравир с целью подбора оптимальных схем лечения для достижения максимального противовирусного эффекта.