Ювенильный идиопатический артрит (ЮИА) — артрит неизвестной этиологии, длительностью более шести недель, возникающий у детей в возрасте до 16 лет [1]. Заболеваемость ЮИА в мире варьирует от 0,8 до 22,6 случаев на 100 000 детей в год, уровень распространенности составляет 7–401случай на 100 000 детей в год [2]. В связи с значительной распространенностью, существенным снижением качества жизни детей и высоким уровнем ранней инвалидизации [3] ЮИА остается одной из актуальных медико-социальных проблем.

Доказано, что ЮИА — мультифакториальное заболевание, патофизиология которого сложна и недостаточно изучена. В свете современных представлений одним из центральных звеньев патологического процесса при ЮИА является абберантное продуцирование цитокинов, сопровождаемое дисрегуляцией иммунного ответа [4]. В данном аспекте особый интерес представляет фактор некроза опухоли альфа (TNFα), рассматриваемый рядом авторов как «ранний» цитокин, появляющийся в дебюте воспалительной реакции [5] и играющий значимую роль в хронизации патологического процесса [6].  Есть данные, что у больных ЮИА уровень TNFα ассоциирован с активностью воспаления, в том числе связан с деструкцией хряща и кости, потерей костной ткани [5], а значительно повышенный плазменный уровень TNFα служит предиктором развития тяжелого осложнения — синдрома активации макрофагов [5]. Вместе с тем иммунная система тесно сопряжена с нейроэндокринной. В литературе активно обсуждают глубокую вовлеченность дисрегуляции эпифизарно-гипофизарно-надпочечниковой оси в механизмы формирования и прогрессирования клинических симптомов ЮИА, и особое значение при этом имеют изменения секреции мелатонина и кортизола [7, 8]. Оценка гормонального профиля крови у больных ЮИА позволила обнаружить повышенный уровень кортизола и сниженный уровень мелатонина [7, 8]. Кроме того, повышенный уровень кортизола был связан с клиническими маркерами воспаления [8], в то время как для мелатонина выявлена ассоциация с активностью процесса, показателем скорости оседания эритроцитов (СОЭ) и уровнем иммуноглобулина M [8].

Современные исследования свидетельствуют о роли кишечной микробиоты в развитии и прогрессировании ЮИА, что обусловлено ее ключевой ролью в нейроиммунно-эндокринной регуляции. Так, для больных ЮИА характерны изменение микробного ландшафта и дисбаланс представителей кишечной микробиоты [9–11], некоторые из которых значительно коррелируют с такими воспалительными биомаркерами, как антитела к циклическому цитруллиновому пептиду, ревматоидный фактор и С-реактивный белок [12]. Кроме того, некоторые микробные представители присутствуют в синовиальной жидкости больных ревматоидным артритом [13] и ткани печени людей и мышей  [14], что может вызывать аутоиммунные реакции [13, 14]. Наконец, показано, что лечение дисбиоза кишечной микробиоты специальной четырехнедельной углеводной диетой способствовало снижению плазменного уровня TNFα, количества воспаленных суставов, выраженности болевого синдрома, утренней скованности и повышению физической активности у больных ЮИА [15]. Однако многие аспекты взаимосвязи между микробиотой кишечника с воспалительными и гормональными биомаркерами у больных ЮИА остаются не до конца изученными. Отсутствуют сведения о взаимосвязи между представителями микробиоты кишечника и уровнями кортизола, мелатонина и TNFα при ЮИА.

Таким образом, проблема взаимосвязи микробиоты кишечника и ЮИА остается актуальной. Цель исследования — изучить изменения таксономического состава микробиоты кишечника и оценить на уровне родов характер их взаимосвязи с кортизолом, мелатонином и TNFα у больных ЮИА.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В сравнительном одномоментном исследовании приняли участие 65 пациентов с ЮИА (основная группа) (39 девочек (60,0%), 26 мальчиков (40,0%); средний возраст — 10,3 [3,1; 11,6] лет), обратившихся за помощью в Детскую поликлинику № 1 и Детскую поликлинику № 3 (г. Симферополь, Республика Крым), и 60 здоровых детей (контрольная группа, КГ) (35 девочек (58,3%), 25 мальчиков (41,7%); средний возраст — 9,9 [3,2; 11,8] лет), проходивших ежегодный профилактический медицинский осмотр на базе медицинского центра «Гемокод» (г. Симферополь, Республика Крым), соответствующих критериям включения и исключения.

Критерии включения: наличие впервые верифицированного диагноза ЮИА; возраст детей — от 1 до 16 лет; длительность ЮИА — от 6 недель до 6 месяцев; отсутствие лечения нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП), генноинженерными биологическими препаратами (ГИБП) и стероидами; наличие информированного согласия родителей на участие ребенка в исследовании.

Критерии исключения: наличие системного ЮИА, дефицита [16] — представлены критерии верификиции дефицита массы тела у детей или избыточной массы тела [17]; сопутствующие соматические заболевания; синдром раздраженного кишечника; хронические заболевания желудочно-кишечного тракта, печени; бактериальные, вирусные и грибковые инфекционные заболевания; психические расстройства; наличие нарушений стула (запоры / диарея) в предшествующий месяц до начала исследования; прием антибиотиков, пробиотиков, пребиотиков, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих препаратов в предшествующие три месяца до начала исследования; прием препаратов, влияющих на стул в предшествующий месяц до начала исследования; отказ от участия в исследовании. 

Критерии включения здоровых добровольцев: возраст от 1 до 16 лет; отсутствие хронических заболеваний и аллергических реакций; частота респираторных заболеваний не больше трех раз в год; отсутствие инфекционных и острых заболеваний в течение двух предыдущих месяцев перед исследованием; отсутствие нарушений стула (запоры / диарея) в предшествующий месяц до начала исследования; отказ от приема пробиотиков, пребиотиков, симбиотических препаратов в предшествующие три месяца до начала исследования; отказ от приема препаратов, влияющих на стул в предшествующий месяц до начала исследования; отсутствие психических расстройств в анамнезе; наличие информированного согласия родителей на участие ребенка в исследовании. 

Критерии исключения здоровых детей: температура тела выше 36,9 °С; отказ от участия в исследовании. 

Верификацию диагноза ЮИА проводили согласно классификационным критериям Всемирной лиги ревматологических ассоциаций (ILAR) второго пересмотра (2001 г.) [18]. С целью объективизации степени активности заболевания мы использовали индекс активности заболевания (Disease activity score, DAS) для 28 суставов (DAS28): ремиссия — < 2, 6 баллов; низкая активность — 2,6–3,0 баллов; 3,1–5,0 баллов  — умеренная активность; 5,1 и более баллов  — высокая активность заболевания  [19].

Для анализа таксономического состава микробиоты кишечника были взяты образцы кала утром в день госпитализации (с 8.00 до 11.00), которые замораживали и хранили в одноразовых пластиковых контейнерах при температуре –80 °C до проведения метагеномного анализа. Выделение тотальной ДНК проводили методом фенольной экстракции. Амплификацию фрагментов вариабельных регионов V3–V4 гена 16S рРНК осуществляли с использованием универсальных праймеров. Анализ V3–V4 региона 16S рРНК кишечной микробиоты проводили на секвенаторе SOLiD5500 Wildfire (AppliedBiosystems; США) методом парно-концевого чтения с суммарным покрытием не менее 10 000 пар ридов на образец [20].

Фильтрацию прочтений по качеству и их таксономическую классификацию проводили с помощью программного обеспечения QIIME версии 1.9.1 [21]. Для определения таксономической принадлежности прочтений применяли подход, включающий в себя использование двух таксономических баз данных. На первом этапе осуществляли подбор референсного набора операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 [22]. На втором этапе с использованием алгоритма RDP определение таксономической принадлежности данных ОТЕ проводили на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb [23].

Изучение качественного и количественного состава микробиоты кишечника осуществляли на основании определения видов, родов и фил микроорганизмов. Оценку α-разнообразия сообщества путем расчета индекса Chao1, показателя числа обнаруженных таксонов (Sobs), показателя, оценивающего реальное количество таксонов (ACE), проводили с помощью программы Mothur v.1.22.0 (http:// www.mothur.org).

Уровни кортизола, мелатонина и TNFα в сыворотке крови изучали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, применяя тест-системы («Вектор-Бест», Россия; и Immuno Biological Laboratories, Германия). Забор крови выполняли из кубитальной вены утром (7.00-9.00) натощак в состоянии покоя (не менее 15 мин).

Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft. Inc.; USA). При нормальном распределении показателей определяли среднее значение и стандартное отклонение; при распределении, отличном от нормального, — медиану, 25-й и 75-й процентили. Нормальность распределения проверяли при помощи распределения Гаусса. Для качественных признаков определяли долю и абсолютное количество значений. Сравнительный анализ для нормально распределенных количественных признаков проводили c помощью параметрического t-критерия Стьюдента, при распределении, отличном от нормального, — с помощью U-критерия Манна–Уитни, для качественных признаков — с помощью критерия χ² (хи-квадрат). Для оценки взаимосвязи признаков рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена. Применяли также корреляционный анализ и множественную ранговую корреляцию, достоверность корреляционных связей проверяли при помощи таблиц достоверности корреляции. Для корректировки множественных сравнений использовали поправки Bonferroni. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных ЮИА и здоровых детей представлена в табл. 1. Группы были сопоставимы по полу (р = 0,97; χ²), возрасту (р = 0,92; χ²) и индексу массы тела (р = 0,054; χ²).    

Клиническая характеристика больных ЮИА представлена в табл. 2. Среди больных преобладали дети с олигоартритом и низкой активностью воспалительного процесса.   

При изучении таксономического состава микробиоты кишечника у больных ЮИА по сравнению с детьми КГ выявлено статистически значимое снижение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1; p = 0,017). Индексы ACE и Sobs в группе больных ЮИА по сравнению с КГ также были несколько снижены, при этом статистически значимых различий не найдено (р = 0,055; р = 0,049 соответственно) (рис. 1). 

При сравнении родового состава кишечной микробиоты в группах обследованных установлено, что у больных ЮИА по сравнению с КГ статистически значимо cнижена численность Anaerostipes (р = 0,042), Lachnospira (р = 0,034), Roseburia (р = 0,002), Coprococcus (р = 0,014), Dialister (р = 0,003) и повышена численность Ruminococcus (р < 0,001) (рис. 2). 

У больных ЮИА по сравнению с детьми КГ плазменные значения кортизола и TNFα были статистически значимо выше, а уровень мелатонина статистически значимо ниже (табл. 3). 

Получены статистически значимые корреляционные связи значений кортизола и итогового показателя по DAS 28 с численностью бактерий Lachnospira (r = –0,44 при p = 0,001; r = –0,57 при p = 0,002 соответственно). Удалось также установить связь между уровнем мелатонина и численностью бактерий Coprococcus (r = –0,48; p = 0,023). Выявлены взаимосвязи уровня TNFα и итогового показателя по DAS 28 с численностью бактерий Ruminococcus (r = 0,52 при p = 0,001; r = 0,54 при p = 0,032 соответственно). Итоговый показатель по DAS 28 имел обратную корреляционную связь с численностью бактерий Roseburia (r = –0,44; p = 0,002).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящем исследовании уточнены изменения таксономического состава микробиоты кишечника и изучена на уровне родов их связь с плазменными уровнями кортизола, мелатонина и TNFα в группе больных ЮИА. 

В ряде ранее выполненных работ сообщается об изменении состава микробиоты кишечника у больных ЮИА [9–11]. Результаты настоящего исследования тоже показали, что состав микробиоты кишечника у больных ЮИА значительно отличается от такового у здоровых детей. По нашим данным, у больных ЮИА по сравнению со здоровыми детьми наблюдается более низкое бактериальное α-разнообразие, что согласуется с результатами ранее выполненных исследований [9, 10]. Кроме того, у больных ЮИА дисбиотические изменения кишечника характеризовались снижением численности бактерий с иммуномодулирующим потенциалом (представителей рода Anaerostipes, Lachnospira,

Roseburia, Coprococcus и Dialister), которые, как известно, продуцируют короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) (бутират и пропионат). Снижение уровня последних приводит к активации гистондеацетилазы и ингибированию G-белковых рецепторов GPR41, GPR43 и GPR109А, что способствует развитию хронического воспаления [24]. В то же время мы обнаружили повышенную численность потенциальных патобионтов — бактерий рода Ruminococcus. Полученные нами результаты частично соотносятся с данными ряда других ранее выполненных работ. Например, снижение относительной численности бактерий Anaerostipes и Lachnospirа было характерно для больных ЮИА [11, 25], но эти данные противоположны результатам, наблюдаемым у пациентов с ревматоидным артритом [26]. В другой работе снижение численности Anaerostipes, Lachnospira и Roseburia было характерно для пациентов с COVID-19 [9]. В отличие от наших данных, в работе [27] указывалось на повышение относительной численности Dialister у больных ЮИА. Контрастирование полученных результатов может быть обусловлено тем фактом, что, во-первых, исследования выполнены в различных географических регионах, а во-вторых, в отличие от вышеуказанных авторов, мы включали детей в КГ, сопоставимых с больными ЮИА по возрасту, полу и индексу массы тела, так как доказано влияние этих факторов на состав микробиоты кишечника. Кроме того, мы не включали больных ЮИА, которые принимали НПВП, ГИБП, стероидные и антибактериальные препараты с целью нивелирования их влияния на результаты исследования.

Несмотря на то что некоторые идентифицированные нами бактерии могут быть общими для ряда других кишечных и системных заболеваний, обнаруженная в настоящей работе сопряженность сниженного содержания бактерий Lachnospira и Roseburia и повышенного  содержания бактерий Ruminococcus с более высокими показателями по DAS28 позволяет предположить, что изменения численности этих бактерий могут быть характерными для данной кагорты больных ЮИА, а также быть основанием для рассмотрения их в качестве предикторов прогрессирования заболевания. Установленные нами ассоциации мы сопоставили с результатами ранее выполненных исследований. Так, у детей с ЮИА, поступивших на стационарное лечение в больницы провинции Чжэцзян, представленность Lachnospira и Roseburia обратно коррелировала с активностью заболевания, показателями АЦЦП и СОЭ [9]. Основываясь на данных о причинно-следственных связях между дисбиозом кишечника и метаболическими заболеваниями [28], можно предположить, что при ЮИА могут наблюдаться следующие последовательные трансформации: изменения микробиоты кишечника, а именно сокращение обилия бактерий, продуцирующих КЦЖК — снижение концентрации КЦЖК — иммунные дисфункции и, в итоге, развитие заболевания. Кроме того, возможно, что терапевтическое повышение численности Lachnospira и Roseburia и снижение численности Ruminococcus могут быть эффективными в отношении смягчения тяжести заболевания, однако для подтверждения данной гипотезы необходимо проведение дополнительных исследований с соответствующим дизайном.

Как указывалось ранее, у больных ЮИА обнаруживают значительно повышенные уровни кортизола, мелатонина и TNFα, роль которых в развитии и прогрессировании заболевания доказана [7, 8]. Результаты нашего исследования не расходятся с литературными данными: у больных ЮИА по сравнению со здоровыми детьми установлены статистически значимые различия в уровне кортизола, мелатонина и TNFα. Примечательно, что некоторые представители микробиоты кишечника у больных ЮИА ассоциированы с уровнями в плазме изученных биомаркеров; это может свидетельствовать о наличии связи состава и численности микробиоты кишечника с этим заболеванием. Обратный характер ассоциации с плазменным уровнем кортизола был продемонстрирован для рода Lachnospira, что подтверждает вероятность активного участия этих бактерий в дисрегуляции активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси (ГГНО) при ЮИА. Мы не встретили работ, посвященных изучению связи между микробиотой кишечника и кортизолом у больных ЮИА. Вместе с тем есть сообщение, что у здоровых детей в возрасте 8–16 лет Lachnospira обратно коррелировала с продукцией кортизола [29]. Аналогичные данные представлены в работе [30]: снижение численности бактерий Lachnospira было сопряжено с более высоким уровнем кортизола у младенцев. В литературе нами было найдено возможное объяснение данной зависимости. Известно, что Lachnospira является одной из основных бутират-продуцирующих бактерий. В свою очередь КЦЖК способны влиять на синтез кортизола: семидневное введение физиологических доз КЦЖК непосредственно в толстую кишку приводило к повышению их содержания в системном кровотоке и ослаблению реакции кортизола на острый психосоциальный стресс у здоровых мужчин [31]. Обнаружено, что пероральное введение КЦЖК (67,5 мМ ацетата, 25 мМ пропионата и 25 мМ бутирата) в течение 7 дней у мышей способствовало ингибированию потенцированной острым стрессом секреции кортикостерона [32]. Поскольку КЦЖК способны пересекать гематоэнцефалический барьер (через циркумвентрикулярные органы), можно предположить, что они участвуют в модуляции активности ГГНО путем непосредственного влияния на секреторный тонус в гипофизарных нейронах медиального паравентрулярного ядра [33].

Выявлена сопряженность показателя мелатонина и численности бактерий Coprococcus, что может быть опосредовано блокировкой сигналов в системе р-CREB-связывающего белка — арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы за счет снижения секреции триптофана [34], являющегося предшественником серотонина, из которого в последующем синтезируется мелатонин. В литературе нами была найдена подобная ассоциация у пациентов с сахарным диабетом 2-го типа, что подтверждалось прямыми тесными корреляциями представленности Coprococcus с уровнями метаболитов триптофана и плазменного мелатонина [35].

Полученная в нашем исследовании прямая сильная корреляция уровня TNFα с численностью бактерий Ruminococcus позволяет предположить негативную роль последних в иммуногенезе ЮИА. Это можно объяснить следующим образом: воспалительный липополисахарид глюкорамнан, синтезируемый бактериями Ruminococcus, посредством активации TLR4-опосредованных реакций индуцирует выработку провоспалительных цитокинов, таких как TNFα и IL6 дендритными клетками костного мозга [36].

ВЫВОДЫ

У больных ЮИА выявлены выраженные нарушения численности и таксономического состава микробиоты кишечника. Обнаруженные статистически значимые корреляции некоторых представителей микробиоты с DAS28 и гормональными, воспалительными биомаркерами свидетельствуют в пользу концепции о связи между численностью и составом микробиоты кишечника и ЮРА. Необходимы дальнейшие исследования для подтверждения значимой роли микробиоты кишечника в патогенезе ЮИА. Актуальным остается вопрос о связи изменений микробиоты кишечника с гормональными биомаркерами. Целенаправленная коррекция микробиоты кишечника может способствовать повышению эффективности терапии ЮИА.