Эндометриоз является одной из значимых проблем современной гинекологии и остается предметом активного изучения на протяжении многих десятилетий. По совокупности данных, более 176 млн женщин в мире страдают эндометриозом [1], при этом в последние годы наблюдается его неуклонный рост. Важно отметить, что эндометриоз сопряжен с бесплодием в 50–80% и хронической тазовой болью — в 50% [1, 2], существенно ухудшающих психосоматическое состояние и качество жизни пациенток [3]. Сложности дифференциальной диагностики эндометриоза часто приводят к задержке постановки диагноза на 4–11 лет, при этом 65% женщин ставят ошибочный диагноз [3, 4], что приводит к прогрессированию заболевания и тяжелым последствиям [5]. Современные фармакологические и хирургические подходы к лечению эндометриоза сопряжены с риском значительных побочных эффектов и недостаточно эффективны, частота рецидивов остается высокой и достигает 15–21% [3]. Поэтому поиск новых патофизиологических механизмов наружного генитального эндометриоза (НГЭ) и безопасных эффективных способов профилактики и лечения этого заболевания остается актуальным.

НГЭ, характеризующийся разрастанием эктопической ткани эндометрия вне полости матки, классически рассматривают как хроническое эстрогензависимое иммунно-воспалительное заболевание, локально ограниченное областью таза [6]. Однако в настоящее время НГЭ все чаще признают воспалительным системным заболеванием, нередко ассоциированным с гетерогенной полиорганной дисфункцией [3, 7]. Считается, что в патофизиологии синдрома системной воспалительной реакции при НГЭ существенную роль играет абберантное продуцирование цитокинов, сопровождающееся дисрегуляцией иммунного ответа. При этом одними из наиболее значимых считают провоспалительные интерлейкины (IL6, IL8), фактор некроза опухоли альфа (TNFα). Оценка цитокинового профиля крови у пациенток с НГЭ позволила обнаружить повышенные уровни IL6, IL8 и TNFα [8–10]. Кроме этого, повышенный уровень IL6 в плазме был связан с выраженностью болевого синдрома [11], тяжестью заболевания [12] и частотой рецидивов [11] у пациенток с НГЭ. В то время как для уровня IL8 в плазме выявлена ассоциация с размером и количеством активных поражений [13] и бесплодием [14], для TNFα — с выраженностью клинических проявлений, активностью и степенью распространенности НГЭ [15].

Современные исследования свидетельствуют о вовлеченности микробиоты кишечника в патофизиологию НГЭ, что можно объяснить ее фундаментальной ролью в поддержании иммунного гомеостаза и непосредственной сопряженностью с развитием многочисленных воспалительных заболеваний [16]. В экспериментах на мышиной модели гетерологичного инъекционного и хирургического эндометриоза было показано, что микробиота кишечника влияет на развитие и прогрессирование НГЭ [17, 18] посредством модуляции различных звеньев иммунной системы [18]. В частности, введение фекальной нормальной микробиоты мышей мышам с индуцированным эндометриозом и истощением микробиоты кишечника было связано с уменьшением роста эндометриоидных поражений, в то время как введение фекальной микробиоты мышей с эндометриозом приводило к прогрессированию заболевания. Кроме того, истощение кишечных бактерий снижает интенсивность воспалительной реакции, ассоциированной с эндометриозом [17] и модулирует численность иммунных клеток в перитонеуме [18]. Наконец, в работах представлены убедительные доказательства об изменении профиля микробиоты кишечника у мышей [18–20] и людей [18, 19]. В то же время клинические данные о видовом составе микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ носят фрагментарный и противоречивый характер, недостаточны для однозначных выводов. Так, из 16 исследований, посвященных изучению взаимосвязи между НГЭ и микробиомом, только в шести анализировали микробиоту кишечника и лишь четыре работы были проведены на микробиоме кишечника человека [23]. Важно также отметить, что в числе представленных работ отсутствуют исследования, посвященные изучению изменений микробиоты кишечника среди пациенток с НГЭ славянского этноса. В том числе имеются лишь единичные сведения о взаимосвязи между микробиотой кишечника и воспалительными биомаркерами у пациенток с НГЭ.

Цель исследования — оценить изменения таксономического состава микробиоты кишечника и изучить на уровне видов их взаимосвязь с показателями IL6, IL8 и TNFα в плазме крови у пациенток с НГЭ.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Сравнительное одномоментное исследование выполнено на базе Клинического многопрофильного центра Святителя Луки (г. Симферополь, Республика Крым). В исследование было включено 50 госпитализированных в гинекологическое отделение пациенток в возрастном диапазоне 18–45 лет с  подтвержденным НГЭ I–IV (основная группа) и 50 здоровых женщин, сопоставимых по возрасту, проходивших профилактический медицинский осмотр (контрольная группа). Все пациентки с НГЭ и здоровые женщины подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии включения пациенток в основную группу: возраст 18–45 лет; наличие лапароскопически и гистологически верифицированного диагноза НГЭ.

Критерии невключения пациенток в основную группу: возраст < 18 или > 45 лет; индекс массы тела >24,9 кг/м²; беременность и период лактации; наличие сахарного диабета I и II типа, коморбидной хронической системной и соматической патологии; наличие в анамнезе психических и поведенческих расстройств; наличие верифицированных функциональных и воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта, гепатобилиарной системы; наличие в анамнезе в предшествующий исследованию месяц инфекционных заболеваний; наличие в анамнезе в предшествующий исследованию месяц нарушения стула (запоры/диарея); прием в предшествующие три месяца до включения в исследование гормональных, оральных, контрацептивных и противовоспалительных средств, антибактериальных пробиотических, пребиотических, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих средств; прием в предшествующие восемь недель до включения в исследование средств, оказывающих влияние на стул; отказ от участия в исследовании.

Критерии включения пациенток в контрольную группу: возраст от 18 до 45 лет;  индекс массы тела < 24,9 кг/м²; отсутствие соматических заболеваний и аллергических реакций; отсутствие в предшествующие два месяца до включения в исследование инфекционных и острых заболеваний; отсутствие в анамнезе психических и поведенческих расстройств; отсутствие в предшествующий месяц до включения в исследование нарушений стула (запоры/диарея); отсутствие в предшествующие три месяца до включения в исследование приема гормональных, оральных, контрацептивных и противовоспалительных средств, антибактериальных пробиотических, пребиотических, противовирусных, симбиотических или кислотоподавляющих средств; отсутствие приема в предшествующие восемь недель до включения в исследование средств, оказывающих влияние на стул.

Критерии невключения пациенток в контрольную группу: наличие температуры тела выше 36,9 °С. 

Характеристика пациенток с НГЭ и КГ представлена в табл. 1. Группы были сопоставимы по возрасту (р = 0,94; χ²) и индексу массы тела (р = 0,052; χ²). У 36 (70,0%) пациенток НГЭ соответствовал III–IV степени распространенности.

Диагноз эндометриоза был верифицирован интраоперационно согласно критериям классификации Американского общества по репродуктивной медицине (ASRM).

С целью анализа таксономического состава микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ и здоровых женщин образцы кала брали утром (с 8.00 до 11.00), при этом у пациенток с НГЭ — в день госпитализации. Образцы кала замораживали и хранили в одноразовых пластиковых контейнерах при температуре –80 °C до проведения метагеномного анализа. Ассигнование тотальной ДНК проводили методом фенольной экстракции; нуклеотидную последовательность ДНК устанавливали с использованием высокопроизводительного секвенатора SOLiD5500 Wildfire (AppliedBiosystems; США) методом шотгансеквенирования [24].

Фильтрацию прочтений по качеству и их таксономическую классификацию проводили с использованием программного обеспечения QIIME версии 1.9.1 [25]. Таксономическую принадлежность прочтений осуществляли на основе информации двух таксономических баз данных: на 1-ом этапе выполняли подбор референсного блока операционных таксономических единиц (ОТЕ) бактерий на основании сравнения полученных прочтений генов 16S рРНК с базой данных GreenGenes версии 13.5 [26]. На 2-ом этапе идентификацию таксономической принадлежности данных ОТЕ проводили на основе специализированной базы данных кишечной микробиоты человека HITdb с использованием алгоритма RDP [27].

Оценку качественного и количественного состава микробиоты кишечника проводили на основе идентификации видов, родов и фил микроорганизмов; α-разнообразие сообщества оценивали посредством расчета индекса Chao1, показателя числа обнаруженных таксонов (Sobs), индекса, оценивающего реальное количество таксонов (ACE) с помощью программы Mothur v.1.22.0 (http:// www.mothur.org).

У пациентов с НГЭ и здоровых добровольцев забор крови для иммуноферментного анализа осуществляли путем венепункции утром, натощак, в состоянии покоя (15 мин минимум). Оценивали показатели IL6, IL8 и TNFα в плазме крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью тест-системы («Вектор-Бест»; Новосибирск, Россия). Пробирки с сывороткой крови хранили в замороженном состоянии при температуре –20 °С.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 8.0 (StatSoft. Inc.; США). Для количественных показателей определяли характер распределения с использованием метода Колмогорова–Смирнова. Ввиду того что большинство количественных признаков не соответствовало нормальному распределению, вычисляли медиану (Ме) и интерквартильный диапазон (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для качественных признаков определяли долю и абсолютное количество значений. Для сравнения качественных признаков использовали критерий χ², для сравнения количественных признаков — критерий Манна–Уитни. Для оценки взаимосвязи между факторами проводили ранговый корреляционный анализ по Спирмену. Уровень значимости при сравнении качественных и количественных признаков, а также при проведении корреляционного анализа соответствует значениям р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При оценке таксономического состава микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ в сравнении со здоровыми женщинами было обнаружено статистически значимое снижение α-разнообразия бактериального сообщества (индекс Chao1 р = 0,014). Кроме того, у пациенток с НГЭ в сравнении со здоровыми женщинами отмечалось снижение индексов ACE и Sobs, без статистически значимых различий между группами (р = 0,053; р = 0,051 соответственно) (рис. 1).

В ходе сравнительного анализа видового состава кишечной микробиоты  у пациенток с НГЭ в сравнении со здоровыми женщинами зафиксировано статистически значимое снижение численности Coprococcus catu (р = 0,009), Ruminococcus gnavus (р < 0,001) и Turicibacter sanguinis (р = 0,008) и повышение численности бактерий вида Eubacterium ramulus (р = 0,040), Bacterioides dorei (р = 0,001), Prevotella divia (р = 0,008)  и Shigella flexneri (р < 0,001) (рис. 2).

Уровни IL6, IL8 и TNFα в плазме крови пациенток с НГЭ были статистически значимо выше в сравнении с показателями здоровых женщин (табл. 2).

При этом нами выявлена обратная тесная корреляция численности Turicibacter sanguinis с показателем IL6 (r = –0,92; р = 0,001); прямая высокая статистически значимая корреляция между повышением численности бактерий рода Shigella flexneri и показателем IL8 (r = 0,72; p < 0,001). Кроме того, была зафиксирована прямая высокая корреляция показателя TNFα с численностью Prevotella divia (r = 0,77; р = 0,001). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Микробиота кишечника сопряжена со многими воспалительными заболеваниями, включая НГЭ [16–19]. Тем не менее, на сегодняшний день выполнены единичные исследования по этой теме на людях, результаты которых не позволяют сделать консенсусных выводов. Исходя из недостаточной изученности этого вопроса первой задачей нашего исследования стало уточнение изменений таксономического состава микробиоты кишечника в группе пациенток с НГЭ. Проведенное исследование подтвердило, что состав микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ значительно отличается от такового у здоровых женщин. По нашим данным, для пациенток с НГЭ по сравнению со здоровыми женщинами характерно более низкое бактериальное α-разнообразие, что является общей отличительной чертой хронических воспалительных заболеваний [28]. Полученные нами результаты соотносятся с данными ранее выполненного исследования [22], но не подтверждают другие данные [21], согласно которым для пациенток с НГЭ было характерно снижение как α-разнообразия, так и β-разнообразия. Результаты настоящего исследования также показали, что у пациенток с НГЭ дисбиотические изменения кишечника характеризуются снижением численности бактерий с иммуномодулирующим потенциалом — представителей вида Coprococcus catu и Turicibacter sanguinis, которые, как известно, являются продуцентами короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), т. е. ключевых эндогенных сигнальных молекул поддержания иммунологического гомеостаза хозяина и Ruminococcus gnavus. Кроме того, снижение КЦЖК влечет за собой увеличение числа грамотрицательных бактерий и соответственно липополисахарида (ЛПС) [29]. Есть данные, что у мышей с эндометриозом фекалии содержат сниженное количество КЦЖК, в частности бутирата, в то время как введение бутирата ингибирует рост эндометриоидных клеток в исследованиях in vitro и in vivo посредством ингибирования активности гистондеацетилазы и активизации экспрессии белка Rap1GAP, который инактивирует внутриклеточный сигнальный белок Rap1 [19]. Вместе с тем нами идентифицирована повышенная численность бактерий вида Eubacterium ramulus, Bacterioides dorei, Prevotella divia и Shigella flexneri. Среди них стоит отметить наличие Shigella flexneri, которые ранее были обнаружены в образцах фекалий пациенток с НГЭ III–IV степени распространенности в исследовании [30]. Предполагается роль данного вида как триггера инициации иммунологических изменений, приводящих к развитию и прогрессированию эндометриоза [31]. Полученные нами результаты частично соотносятся с данными ряда других работ. Например, в одном из исследований для пациенток с НГЭ было характерно снижение численности бактерий Coprococcus и повышение численности Bacterioides [21]. В другой работе для пациенток с НГЭ было характерно повышение численности Eubacterium и Bacterioides [22]. Несогласованность полученных данных может быть обусловлена тем, что, во-первых, исследования выполняли с участием пациенток различной этнической принадлежности, а во-вторых, в отличие от вышеуказанных авторов, мы не включали пациенток с НГЭ с избыточной массой тела (так как доказано влияние этого фактора на изменения микробиоты кишечника), а также пациенток, принимающих гормональные, контрацептивные и противовоспалительные препараты для исключения их влияния на результаты работы.

Как указывалось ранее, у пациенток с НГЭ обнаруживаются значительно повышенные уровни IL6, IL8 и TNFα в плазме крови, роль которых в развитии и прогрессировании тяжести заболевания доказана [8–10]. В своем исследовании мы тоже установили статистически значимо более высокие плазменные показатели IL6, IL8 и TNFα у пациенток с НГЭ в сравнении со здоровыми женщинами. Между тем дисбиоз кишечника, который все чаще признается одним из факторов развития воспаления, а также аутоиммунных и иммунноопосредованных заболеваний, способен запускать формирование иммунно-воспалительного ответа с увеличением уровня провоспалительных цитокинов на системном уровне [32]. Поэтому второй задачей исследования была оценка взаимосвязи изменений таксономического состава микробиоты кишечника на уровне видов с уровнями IL6, IL8 и TNFα в плазме в группе пациенток с НГЭ. Нами установлено, что некоторые виды микроорганизмов кишечника у пациенток с НГЭ сопряжены с уровнями изучаемых цитокинов в плазме, что может указывать на наличие сопряженности состава микробиоты кишечника с НГЭ. В частности, была выявлена обратная ассоциация между повышением уровня IL6 и численности бактерий Turicibacter sanguinis. В литературе нами было найдено возможное объяснение данной зависимости. Как известно, бактерии Turicibacter участвуют в образовании метаболитов с протективным эффектом по отношению к эпителию кишечника и репродуктивной системе, а именно таких КЦЖК, как уксусная, валериановая и масляная кислоты. Снижение уровня последней приводит к активации гистондеацетилазы, связанного с ней транскрипционного ядерного фактора NF-kB и ингибированию G-белковых рецепторов GPR41, GPR43 и GPR109А, что вызывает экспрессию генов, определяющих синтез провоспалительных цитокинов, включая IL6 [33], и способствует развитию хронического воспаления [16]. Отмеченная ранее [34] сопряженность показателя IL8 c численностью бактерий рода Subdoligranulum у пациенток с НГЭ в настоящем исследовании не была подтверждена. По полученным нами данным, для пациенток с НГЭ характерна прямая ассоциация показателя IL8 с численностью бактерий Shigella flexneri, что может быть опосредовано способностью последней посредством инициирования паттерн-распознающих рецепторов TLR4 вызывать стойкую активацию ингибиторного киназного комплекса транскрипционного фактора NF-kB (IKK) и последующую деградацию I-kB, что, в свою очередь, способствует высвобождению NF-κB с дальнейшей  транслакацией в ядро и запуском транскрипции IL8 [35]. В литературе нами были найдены подобные ассоциации у пациентов с подтвержденной инфекцией шигеллеза, что подтверждали прямые тесные корреляции представленности Shigella flexneri с уровнем IL8 в плазме [36]. Контрастирование полученных нами данных с результатами сравниваемой работы, как мы уже указали, возможно, обусловлено различиями в дизайне, а именно избирательным включением в наше исследование пациенток с НГЭ, имеющих нормальный индекс массы тела и без коморбидных экстрагенитальных заболеваний, в то время как в другом исследовании [34] эти характеристики не являлись критериями исключения. Кроме того, различие может быть связано с тем, что мы включали в исследование пациенток с I–IV степенью распространенности НГЭ, в то время как в исследовании [34] приняли участие пациентки с III–IV степенью распространенности НГЭ. Этот факт тоже мог повлиять на отличия ассоциаций IL8 с представителями микробиоты кишечника у пациенток с НГЭ от имеющихся в литературе. Необходимо также отметить малый размер выборки (12 пациенток) в ранее описанном исследовании [34]. Кроме того, в своей работе мы обнаружили прямую высокую связь между уровнем в крови TNFα и численностью Prevotella divia. В доступной нам литературе мы не встретили работ, авторы которых изучали этот вопрос при НГЭ. Вместе с тем ранее показано, что обработка клеточной линии моноцитов ЛПС Prevotella приводит к одновременной активации трех базовых сигнальных путей митогенактивированной протеинкиназы (MAPK) (внеклеточной сигнальной киназы 1/2 (ERK1/2), c-Jun N-концевой киназы 1/2 (JNK1/2) и p38) с последующим индуцированием экспрессии мРНК TNFα и стимуляцией секреции TNFα [37].

Результаты настоящего исследования позволяют предположить значимую роль микробиоты кишечника в иммуногенезе НГЭ. По-видимому, причинно-следственные связи между микробиотой кишечника и уровнем провоспалительных цитокинов в крови при НГЭ требуют более детальной проработки и продолжения исследований в этом направлении.

ВЫВОДЫ

У пациенток с НГЭ обнаружены значительные нарушения представленности и таксономического состава микробиоты кишечника. Кроме того, выявленные нами статистически значимые корреляции некоторых видов бактерий с уровнями IL6, IL8 и TNFα в плазме указывают на наличие связи между представленностью и составом микробиоты кишечника с иммунопатогенезом НГЭ.

Необходимо проведение дальнейших исследований для подтверждения роли микробиоты кишечника в патофизиологии НГЭ. Прицельное воздействие на микробиоту кишечника может способствовать повышению эффективности терапевтических подходов в лечении НГЭ.