Бесплодие на сегодняшний день является актуальной и до конца не решенной проблемой, затрагивающей как мужчин, так и женщин. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире насчитывается 50–80 млн пар, страдающих нарушением репродуктивной функции. В частности, в нашей стране, по оценкам исследователей, до 15% пар имеют проблемы с фертильностью.

Проблема женского бесплодия привлекает значительное внимание исследователей из-за сложности строения и физиологии женской репродуктивной системы и решающей роли, которую она играет в репродукции человека [1]. Принято выделять несколько факторов, приводящих к нарушению женской фертильности, такие как возраст, наличие хронических заболеваний, образ жизни, токсины окружающей среды и генетические особенности [2]. В последнее время активно изучают взаимосвязь между хронической экстрагенитальной патологией воспалительного генеза и развитием бесплодия. Известно, что экстрагенитальная патология может оказывать значительное влияние на женскую репродуктивную систему, приводя к нарушениям фертильности [2, 3]. Такие заболевания, как сахарный диабет, аутоиммунные процессы, заболевания щитовидной железы, дисфункция иммунной и гипоталамо-гипофизарнояичниковой системы, могут негативно влиять на функцию матки, яичников и процесс созревания ооцитов [2, 3]. Нарушение процессов созревания ооцитов большинство исследователей называют как одну из основных причин женского бесплодия [3, 4].

Оогенез — сложный и многоступенчатый процесс, который контролируется взаимодействием различных типов клеток, гормонов, факторов роста и сигнальных молекул. Любое нарушение в нем может привести к множеству проблем с фертильностью, так как качество яйцеклеток имеет первостепенное значение для успешного зачатия и беременности [4]. 

Одну из ключевых ролей в созревании ооцита играет взаимодействие соматических клеток, окружающих его, включая гранулезные и так называемые кумулюсные клетки [5]. Хотя гранулезные и кумулюсные клетки имеют с гистологической точки зрения общее происхождение, они выполняют разные функции. Гранулезные клетки отвечают, в частности, за выработку эстрогена и участвуют в регуляции фолликулостимулирующего гормона, необходимого для развития фолликула [6, 7]. Недавно проведенные исследования показали, что гранулезные клетки напрямую влияют на качество яйцеклеток, поскольку продуцируют ряд факторов роста и других сигнальных молекул, определяющих их созревание [8].

Кумулюсные клетки представляют собой специализированные клетки, которые находятся в непосредственной близости от созревающего ооцита. Они обеспечивают физическую и биохимическую поддержку развивающейся яйцеклетке, отвечают за выработку ряда факторов роста и других сигнальных молекул, например, гиалуроновой кислоты [9, 10].

Ряд исследователей количественно и качественно оценивают апоптоз в гранулезных и кумулюсных клетках, а также его влияние на процессы созревания ооцита. Отмечается, что ингибирование апоптоза в гранулезных клетках способствует росту фолликулов и улучшению качества яйцеклеток [8]. Другие авторы показали, что избирательный апоптоз гранулезных клеток во время созревания ооцита все же необходим для успешной овуляции [11]. Установлено, что регуляция апоптоза находится под сложным взаимодействием сигнальных путей, включая систему Fas/FasL и семейство белков Bcl-2 [12]. Многие эксперты сходятся во мнении, что исследования механизмов, лежащих в основе апоптоза в гранулезных и кумулюсных клетках, необходимы для разработки таргетных методов лечения бесплодия и других нарушений репродуктивной функции [12, 13].

Однако надо отметить, что объектами большинства исследований были клетки, полученные у животных (мыши, крысы, свиньи), а человеческие образцы использовали для изучения в единичных случаях. Поэтому в нашей работе для более детальной оценки процесса оогенеза, его роли в женской фертильности мы использовали гранулезные клетки, полученные от пациенток, проходивших лечение бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Целью исследования было оценить уровень апоптоза гранулезных клеток у женщин с нарушением репродуктивной функции, имеющих в анамнезе хронические заболевания дыхательной и/или пищеварительной систем воспалительного генеза, а также определить, имеется ли взаимосвязь между изучаемым параметром и репродуктивной дисфункцией в исследуемой группе.

Результаты исследования могут дать представления о глубинных механизмах патогенеза бесплодия, что потенциально может быть использовано для разработки новых методов лечения и таргетной терапии для улучшения репродуктивных результатов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование относится к разнонаправленным когортным исследованиям, дизайн представлен на рисунке (рисунок). В работе проанализированы образцы гранулезных клеток 60 пациенток, проходивших лечение бесплодия методами ВРТ в Клинике № 1 ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России в период с 2021 по 2022 г. В исследовании участвовали женщины репродуктивного возраста, имеющие в анамнезе экстрагенитальную патологию воспалительного генеза органов пищеварения или дыхательной системы. Данный вид экстрагенитальной патологии был выбран в связи с высокой степенью распространенности в популяции и ранее проведенными исследованиями, которые указывают на снижение эффективности лечения бесплодия методами ВРТ у лиц данной категории [14].

После анализа медицинской документации для исследования был произведен отбор пациентов по следующим критериям включения: возраст пациенток 20–45 лет; наличие в анамнезе подтвержденного хронического воспалительного заболевания пищеварительной системы (гастриты, дуодениты, язвенная болезнь желудка и (или) двенадцатиперстной кишки, панкреатиты) или воспалительного заболевания дыхательной системы (хроническая патология — хронические бронхиты или частая острая патология (более 4 раз в год) — ОРВИ, грипп, бронхит, ларингит, трахеит, пневмония), для контрольной группы отбирались пациентки без экстрагенитальной патологии в анамнезе; период предшествующего бесплодия не менее года; наличие подписанного информированного добровольного согласия пациента на участие в исследовании.

Критерии исключения из исследования: сочетанная патология дыхательной и пищеварительной системы в анамнезе; онкологические заболевания в анамнезе; отказ пациентки от исследования и обработки персональных данных; социально незащищенные группы населения.

Всего для исследования было отобрано 60 пациенток, которых разделили на три группы: группа 1 (n = 20) — женщины, не имеющие экстрагенитальную патологию в анамнезе; группа 2 (n = 20) — женщины, имеющие воспалительные заболевания дыхательной системы в анамнезе (хроническая патология — хронические бронхиты или частая острая патология (более 4 раз в год) — ОРВИ, грипп, бронхит, ларингит, трахеит, пневмония); группа 3 (n = 20) — женщины, имеющие хронические воспалительные заболевания пищеварительной системы в анамнезе (гастриты, дуодениты, язвенная болезнь желудка и (или) двенадцатиперстной кишки, панкреатиты). Количество отобранных пациентов было ограничено техническими возможностями проведения дальнейшего исследования апоптоза в образцах гранулезных клеток.

Возраст женщин варьировал от 21 до 43 лет и в среднем составил 33,5 ± 4,7 года. Период предшествующего бесплодия у обследованных был равен 4–16 годам, в среднем 7,4 ± 1,5 года. Для установления причин бесплодия пациенткам проводили стандартное клиниколабораторное обследование и собирали подробный анамнез о наличии экстрагенитальной патологии. Стимуляцию овуляции во всех лечебных циклах, а также все последующие процедуры осуществляли в строгом соответствии с общепринятыми клиническими рекомендациями и протоколами [15].

Образцы гранулезных клеток были собраны из фолликулярной жидкости, полученной во время трансвагинальной пункции преовуляторных фолликулов. Клетки помещали в буферный раствор (гепарин 10МЕ/мл, раствор альбумина человека 1%, рекомбинантный инсулин человека 0,01%, гентамицина сульфат 10 мкг/мл) и транспортировали в лабораторию для определения уровня апоптоза. Время от момента забора образцов до проведения анализа в лаборатории не превышало 3 ч.

Оценку количества клеток с признаками апоптоза проводили с использованием коммерческого набора для проточной цитометрии «Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V FITC and PI» (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Inc.; США). Суспензию клеток отмывали физиологическим раствором. Отмытые гранулезные клетки подсчитывали, затем ресуспензировали в аннексин-связывающем буфере для получения концентрации 1 × 10⁶ клеток в мл, инкубировали 15 мин при комнатной температуре с аннексином V-FITC и йодидом пропидия (PI), согласно инструкции производителя набора. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Attune® Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Fisher Scientific Inc.; США) (не менее 10 тыс. событий). Результаты интерпретировали следующим образом: живые клетки не проявляли флуоресценции (Annexin V-FITC-/PI-), клетки в состоянии раннего апоптоза — Annexin V-FITC+/PI-, клетки в состоянии позднего апоптозпа — Annexin V-FITC+/PI+.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием программы StatTech v. 2.8.8 («Статтех»; Россия). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Колмогорова– Смирнова. Количественные показатели, имеющие нормальное распределение, описывали с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD), границ 95%-го доверительного интервала (95% ДИ). В случае отсутствия нормального распределения количественные данные описывали с помощью медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q₁–Q₃). Сравнение трех и более групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа, апостериорные сравнения проводили с помощью критерия Фишера (при условии равенства дисперсий), критерия Уэлча (при неравных дисперсиях). Сравнение трех и более групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью критерия Краскела–Уоллиса.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании уровня апоптоза в гранулезных клетках установлено, что наиболее активно этот процесс протекал в группе женщин, имеющих в анамнезе воспалительную патологию дыхательной системы, менее активно — у женщин, имеющих в анамнезе воспалительные заболевания пищеварительной системы, а наименьший показатель был в группе женщин без патологии в анамнезе (табл. 1).

Для оценки влияния уровня апоптоза гранулезных клеток на процессы оогенеза и оплодотворения у пациенток исследуемых групп было определено количество зрелых ооцитов, полученных в ходе трансвагинальной пункции преовуляторных фолликулов, и количество оплодотворенных яйцеклеток в результате экстракорпорального оплодотворения. Установлено, что наибольшее количество зрелых ооцитов и наилучший результат оплодотворения был у женщин, не имеющих экстрагенитальную патологию в анамнезе, а наименьшее количество зрелых ооцитов и, соответственно, более негативный результат оплодотворения — у женщин, имеющих воспалительные заболевания дыхательной системы в анамнезе (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе проведенного исследования установлено, что экстрагенитальная воспалительная патология пищеварительной и дыхательной систем в анамнезе пациенток влияет на процесс оогенеза. Это подтверждается тем фактом, что у женщин без вышеуказанных заболеваний количество зрелых ооцитов, полученных в результате пункции фолликулов, составляло 13,44 ± 2,60, тогда как у женщин, имеющих патологию дыхательной системы и желудочно-кишечного тракта воспалительного генеза, количество ооцитов было достоверно ниже — 4,47 ± 2,00 (p = 0,001) и 7,10 ± 1,85 (p = 0,001) соответственно. Известно, что при воспалительных заболеваниях как пищеварительной, так и дыхательной систем происходит динамическое персистирование в крови различных медиаторов воспаления, таких как интерлейкины, факторы некроза опухоли и др. [16, 17]. В литературе имеются сведения, что ряд цитокинов, например Il6 и Il8, являются негативными регуляторами оогенеза, поскольку их высокий уровень в крови связан с низким качеством яйцеклеток, не способных к оплодотворению [18].

Известно, что процесс созревания женских гамет достаточно сложен и его контролирует ряд механизмов и факторов, в том числе взаимодействие ооцита с соматическими клетками микроокружения. В связи с тем что гранулезные клетки обеспечивают оптимальные условия для оогенеза [6], чрезмерная индукция апоптоза в них может способствовать гибели яйцеклетки или нарушению нормального ее созревания [19]. Увеличение содержания в крови Il2, Il4, TNFα и др. при воспалительных заболеваниях дыхательной и пищеварительной систем может выступать в качестве индукторов апоптоза, посредством увеличения количества активных форм кислорода и снижением трансмембранного митохондриального потенциала, что может запускать внутренний путь запрограммированной клеточной гибели [20]. С этим может быть связан тот факт, что у женщин, не имеющих экстрагенитальную патологию, процент живых гранулезных клеток был статистически значимо выше (0,2673 ± 0,0151%), а показатель раннего и позднего апоптоза значимо ниже (0,0088 ± 0,0062% и 0,0028% [0,0012–0,0046%]), чем у пациенток, имеющих хроническую воспалительную патологию пищеварительной системы (количество живых клеток — 0,2195 ± 0,0154%, показатель раннего и позднего апоптоза — 0,0140 ± 0,0099% и 0,0132% [0,0102–0,0206%]) и у пациенток с хронической воспалительной патологией дыхательной системы (количество живых клеток — 0,1946 ± 0,0227%, показатель раннего и позднего апоптоза — 0,0650 ± 0,0391% и 0,0300% [0,0161–0,0393%]).

Необходимо также отметить, что у женщин, имеющих заболевания дыхательной системы, был самый низкий показатель живых клеток и самый высокий уровень раннего и позднего апоптоза гранулезных клеток, и, соответственно, более негативные результаты оогенеза (малое число зрелых ооцитов) и оплодотворения по сравнению с другими исследуемыми группами. Это, вероятно, можно объяснить тем, что у данной группы пациенток на фоне имеющейся патологии может развиваться гипоксия, которая, в свою очередь, может служить дополнительным индуктором апоптоза и нарушать процессы оогенеза [21].

ВЫВОДЫ

Экстрагенитальная патология дыхательной и пищеварительной систем воспалительного генеза ассоциируется с повышением уровня апоптоза в гранулезных клетках, что влияет на процессы оогенеза и негативно сказывается на фертильности у женщин. Экстрагенитальная воспалительная патология дыхательной системы в большей степени влияет на процент апоптоза и жизнеспособность гранулезных клеток. С этим связано ухудшение показателей результативности лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий у данной группы пациенток по сравнению с контрольной группой. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых подходов в оптимизации подготовки к экстракорпоральному оплодотворению женщин с хроническими воспалительными заболеваниями дыхательной и пищеварительной систем в анамнезе.