Регенерация раневого дефекта представляет собой сложный процесс взаимодействия между клетками эпителия, трофического аппарата, фибробластического ряда и воспалительной инфильтрации [1]. В ходе заживления происходят стадии воспаления, регенерации, реорганизации, на каждой из которых перечисленные компоненты имеют свои морфологические особенности рубца [2]. Для заживления посредством первичного натяжения необходимо, чтобы стадия воспаления в кратчайшие сроки перешла на стадию регенерации. В то время как для заживления вторичным натяжением, итогом которого является образование рубца, характерно превалирование воспалительной стадии [3].

Современным подходом ведения раневых дефектов слизистой оболочки рта является использование покровных материалов, которые обеспечивают защиту раневой поверхности от повторной травматизации. Поэтому актуальной задачей является поиск новых раневых повязок, которые не только будут защищать раневой дефект, но и, за счет дополнительных свойств, снижать выраженность воспалительных явлений и ускорять регенерацию [4].

Изучаемая полимерная пьезоэлектрическая мембрана была изготовлена в лаборатории гибридных материалов НИ ТПУ. Ее особенностью, помимо пьезоэлектрических свойств, является модификация при помощи ионов меди, которые обладают доказанными противомикробными и противовоспалительными свойствами [5].

Целью данного исследования было изучить морфологические особенности регенерации слизистой оболочки рта в условиях экспериментального раневого дефекта при применении полимерных пьезоэлектрических мембран.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполнен на 45-ти крысах-самцах линии Вистар, выведенных в виварии на базе ЦНИЛ СибГМУ. Животные содержались в стандартных условиях вивария, с ограничением приема пищи в течение суток после операции. Животные были разделены на три группы: экспериментальную группу 1 (n = 15), в  которой у животных раневой дефект оставляли открытым согласно стандартному ведению раневого процесса в полости рта; экспериментальную группу 2 (n = 15), в  которой раневой дефект перекрывали полимерной мембраной на основе винилиденфторида с тетрафторэтиленом, модифицированной медью; контрольную группу 3 (n = 15), в которой крысы имели интактную слизистую оболочку. Животных содержали в стандартных условиях вивария.

С целью моделирования раневого дефекта слизистой оболочки рта животные были введены в состояние наркоза в ходе внутримышечной инъекции препаратом «Золетил» в дозировке 0,3 мг. После антисептической обработки операционного поля 2%-м раствором хлоргексидина крысам был иссечен лоскут слизистой оболочки в области щеки размером 7 × 4 мм. Далее животным экспериментальной группы 2 по краям раны атравматичной иглой простыми узловыми швами фиксировали полимерную мембрану.

Выведение животных из эксперимента производили на 3-и, 7-е и 12-е сутки исследования путем введения в состояние гипоксии в СО₂-камере. После повторно иссекали слизистую оболочку щеки на месте раневого дефекта.

Приготовление гистологических препаратов осуществляли по общепринятой методике, просматривали их на световом микроскопе Observer D1 (Karl Zeuss; Германия) с использованием камеры для световой микроскопии AxioCam ICc5 (Karl Zeuss; Германия). Для этого после депарафинизации срезы окрашивали гематоксилиномэозином по стандартной методике.

Для иммуногистохимического исследования после приготовления серийных парафиновых срезов толщиной 4–6 мкм, была проведена их депарафинизация, затем иммуногистохимическое окрашивание, для которого использовали кроличьи рекомбинантные поликлональные антитела VEGF и S-100 изотипа IgG (Abcam; США). Оценивали интенсивность иммуногистохимической окраски по четырехбалльной шкале: 0 — нет окрашивания, 1 — слабое окрашивание, 2 — умеренное окрашивание, 3 — сильное, 4 — очень сильное окрашивание. 

Формула подсчета:

Гистохимический индекс (H-score) = ∑ P(i) × i, где i — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0–4, P(i) — процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Подсчет проводили в трех когортах по 100 клеток в различных полях зрения (объектив ×40).

Для электронной микроскопии полученный материал помещали в 2,5%-й раствор глутарового альдегида на 0,2 М какодилатном буфере (1 : 9) для фиксации, постфиксировали в 1%-м растворе OsO₄ в холодильнике в течение 4 ч. Производили дегидратацию и заливали в смесь эпона и аралдита М.

Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-5 (BROMMA; Швеция), контрастировали уранила ацетатом и цитратом свинца и изучали с помощью электронного микроскопа JEM -1400 CX (JEOL; Япония).

В основе морфометрического анализа лежали классические методы стереометрии. Подсчитывали показатели толщины эпителиального пласта, численной плотности фибробластов, удельной площади рыхлой и плотной волокнистой соединительной ткани, грануляционной ткани, воспалительной инфильтрации, используя программу обработки графических изображений Axio Vision (Karl Zeuss; Германия) и ImageJ, версия 1.52u (National institute of Public health; США).

На ультратонких срезах изучали ультраструктуру клеток эпителиального пласта, трофического аппарата, фибробластического ряда.

Статистическую обработку проводили в программе Statistica 10.0 (IBM; США). Проверку статистических гипотез на характер распределения признака проводили при помощи критерия Колмогорова–Смирнова. При обработке полученных результатов использовали методы описательной и непараметрической статистики. Исследуемые параметры описывали как медиану и квартили, М (Q₁; Q₃). При сравнении независимых выборок использовали критерий Краскела–Уоллиса с медианным тестом, для парных сравнений — критерий Вилкоксона. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На 3-и сутки исследования в экспериментальной группе 1 наблюдали краевую эпителизацию раны, в то время как во группе 2 дефект был полностью перекрыт эпителием, в котором обнаруживались акантолитические пузыри (рис. 1A).

На ультраструктурном уровне в обеих экспериментальных группах базальные клетки были вытянуты в ширину, апикально-базальная полярность не определялась. В группе 2 имелись признаки высокой пролиферативной активности, некоторые клетки находились в процессе митоза (рис. 1Б).

Была обнаружена область регенерации, заполненная грануляционной тканью с многочисленными тонкостенными сосудами (рис. 1В). Удельная площадь грануляционной ткани в группе с покрытием была в 1,4 раз достоверно больше, чем в группе без него (p = 0,033) (см. таблица). Здоровые ткани отделяла от раневого дефекта зона обширной воспалительной клеточной инфильтрации, удельная площадь которой в группе 2 была в 1,4 раз достоверно меньше, чем в группе 1 (p = 0,017). Она состояла из нейтрофилов, макрофагов, плазмоцитов, лимфоцитов и эозинофилов (см. таблица) (рис. 1Г).

Численная плотность фибробластов в 1 мм² среза была достоверно выше в группе 2 (р = 0,035) (см. таблица). Кроме того, у животных этой группы были выявлены отдельные пучки соединительнотканных волокон (рис. 1А).

В области раневого дефекта обнаружены новообразованные тонкостенные сосуды грануляционной ткани. Их эндотелиоциты активно экспрессировали VEGF (рис. 1Д). При этом подсчитываемый показатель H-score в группе 2 был в 1,4 и 4,7 раз достоверно больше, чем в группе 1 и контрольной группе (р = 0,029, р = 0,019) (см. таблица).

Эндотелиальная выстилка и базальная мембрана капилляров грануляционной ткани были тонкими, межэндотелиальные пространства расширенными. Эндотелиоциты бедны органеллами. В группе с покрытием в области люминального края сосудов в эндотелиоцитах визуализировалось большое количество микропиноцитозных пузырьков и многочисленные микроворсинки.

На 7-е сутки исследования во всех экспериментальных группах эпителий полностью перекрывал раневой дефект. В 1-й экспериментальной группе толщина эпителиального пласта была достоверно ниже, чем в интактной слизистой оболочке и во 2-й группе (таблица), были выражены акантолитические процессы (рис. 2А).

В группе 2 патологические изменения эпителия были выражены в меньшей степени, чем в группе без покрытия. Начинал определяться типичный рельеф в виде сосочков в сторону соединительной ткани. Тем не менее, встречались участки с акантозом и акантолизом. Толщина эпителия была в 2,3 раза значимо меньше, чем в контрольной группе (р = 0,023), но в 2 раза достоверно больше, чем в группе без покрытия (р = 0,019) (см. таблица). Базальные клетки постепенно приобретали типичную вытянутую в высоту форму и апикально-базальную полярность, восстанавливались контакты с базальной мембраной в виде полудесмосом.

В собственной пластинке слизистой оболочки щеки на месте раневого дефекта во всех экспериментальных группах определялись участки со сформированной рыхлой волокнистой соединительной тканью. Ее удельная площадь в группе 2 была значимо больше в 4,5 раза (р = 0,041), чем в группе 1, но в 2,6 раз достоверно меньше, чем в группе контроля (р = 0,034).

В группе с покрытием численная плотность фибробластов увеличивалась по сравнению с группой без него в 1,35 раз (р = 0,041). В группе с покрытием преобладали крупные дифференцированные фибробласты отростчатой формы с высокой синтетической активностью. Их плазматическая мембрана образовывала многочисленные выросты. В окружении клеток обнаружены пучки соединительнотканных волокон, расположенные в разных плоскостях (рис. 2Б). В группе без покрытия по-прежнему преобладали юные фибробласты, ультраструктура которых практически не изменилась по сравнению с результатами 3-х суток.

У новообразованных сосудов экспрессия VEGF в группе 2 была в 1,7 и 3,6 раз достоверно больше, чем в группе 1 и в контрольной (р = 0,022, р = 0,015) (см. таблица).

В группе 1 на ультраструктурном уровне в эндотелиоцитах по-прежнему встречались признаки нарушения транскапиллярного обмена в отличие от группы 2 (рис. 2В). В группе 2 базальная мембрана сосудов становилась непрерывной, равномерной по толщине.

На границе с раневым дефектом во всех экспериментальных группах выявлены периферические нервы, располагающиеся недалеко от кровеносных сосудов. В отростках нервных клеток определены единичные отечные митохондрии с деструкцией крист. Отмечен отек периневрального и эндоневрального пространства (рис. 2Г).

На 12-е сутки исследования в группе 2 толщина эпителиального пласта восстанавливалась, тогда как в группе 1 она была значимо меньше, чем в интактной слизистой оболочке (см. таблица). Патологические процессы в эпителии в группе 2 отсутствовали, подлежащая соединительная ткань вдавалась в эпителий, образуя выраженные сосочки, содержащие сосуды микроциркуляторного русла (рис. 3A). В группе 1 обнаружены явления акантолиза, что на ультраструктурном уровне выражалось в наличии вакуолей в межклеточном пространстве и акантоза в шиповатом слое за счет пролиферации клеток (рис. 3Б).

На 12-е сутки исследования во всех экспериментальных группах исчезла грануляционная ткань, вместо нее появилась молодая рыхлая волокнистая соединительная ткань (рис. 3A). Ее удельная площадь достигала контрольных значений только в группе с покрытием. В группе без покрытия между соединительнотканными волокнами обнаружены участки с внутритканевым отеком, встречались очаги с рубцовыми изменениями, основу которых составляла плотная волокнистая соединительная ткань (рис. 3Б). Ее максимальная удельная площадь была зафиксирована в группе, где не использовали раневое покрытие (см. таблица).

Численная плотность фибробластов в группе с раневым покрытием достигала контрольных значений и была в 6,9 раз достоверно меньше, чем в группе без него (р = 0,032). В группе 2 преобладали зрелые функционально неактивные клетки — фиброциты. Экстрацеллюлярный отек вокруг клеток не определялся, зато визуализировались четко организованные коллагеновые волокна. В группе 1 по-прежнему преобладали отростчатые клетки с развитыми органеллами синтеза и дисперсным хроматином. 

В группе с покрытием визуализировались зрелые сформированные сосуды микроциркуляторного русла без явлений сладжа, стаза и тромбоза. Сосуды были окружены структурированными волокнами соединительной ткани, периваскулярный отек отсутствовал. Базальная мембрана была непрерывной, равномерной толщины. Органеллы были представлены в достаточном количестве, имели типичную структуру. Активно протекал транскапиллярный обмен. В группе 1 базальная мембрана капилляров была тонкая, у эндотелиоцитов зафиксировано небольшое количество микроворсинок и микропиноцитозных пузырьков, окруженных периваскулярным отеком.

Экспрессия VEGF снижалась по сравнению с 7-ми сутками во всех экспериментальных группах. Индекс H-score VEGF в экспериментальной группе 1 становился в 1,45 раз меньше контрольных значений (р = 0,026) (рис. 3В, Г).

Только в группе с раневым покрытием в области раневого дефекта отмечены периферические нервы с безмиелиновыми нервными волокнами (рис. 3Д). Несмотря на это, иммуногистохимическое исследование не выявило экспрессию маркера S-100, что свидетельствовало о начальных стадиях восстановления нервного аппарата (рис. 3Е). 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе настоящего исследования были показаны основные морфологические аспекты восстановления тканей слизистой оболочки рта при использовании полимерной пьезоэлектрической мембраны, модифицированной медью.

Так, уже на 3-и сутки исследования в группе с раневым покрытием раневой дефект был полностью перекрыт тонким слоем эпителия в отличие от группы без лечения, где наблюдалась краевая эпителизация.

Процесс эпителизации сопровождался изменениями на ультраструктурном уровне, благодаря которым могла происходить миграция эпителиоцитов от краев к центру раны [6].  Сохранение единичных десмосомных контактов наблюдал в своих работах  Rorth, который объяснил их наличие необходимостью скоординированной коллективной миграции эпителия [7].

Высокая пролиферативная активность клеток базального слоя обнаружена  только в группе с покрытием. В группе без раневого покрытия мы наблюдали отсутствие ультраструктурных признаков высокой пролиферативной активности. Отсутствие признаков высокой пролиферативной активности у клеток базального слоя может быть связано с тем, что мигрирующие клетки не способны делиться до момента полного перекрытия раневого дефекта слоем эпителия изза снижения содержания циклинов G1/S-фаз и усиления активности циклинзависимой киназы [8].

Первый этап заживления ран протекал с преобладанием воспалительной реакции первые трое суток. Она была направлена на ограничение дефекта, содержащего некротические ткани, микроорганизмы и элементы первичной контаминации от здоровых тканей, удаление этих патологических продуктов, ликвидацию последствий повреждения, а также активацию цитокинов и факторов роста [9]. В связи с этим во всех экспериментальных группах наблюдалось увеличение удельной площади воспалительной инфильтрации.

Параллельно с воспалительной реакцией происходило формирование молодой грануляционной ткани с большим количеством новообразованных сосудов. При этом в группе с раневым покрытием соотношение удельной площади грануляционной ткани и воспалительной инфильтрации смещалось в сторону первого показателя, а в группе без лечения — в сторону второго, что свидетельствовало о преобладании воспалительных процессов над регенераторными.

Развитие грануляционной ткани способствовало отторжению мертвого субстрата, являлось барьером для предотвращения распространения микроорганизмов, а также становилось основой для формирования молодой соединительной ткани на последующих стадиях регенерации раны [10].

Базисным механизмом заживления раны был неоангеогенез [11]. Во всех экспериментальных группах происходило активное образование капилляров в грануляционной ткани. Неоангиогенез и воспалительная реакция способствовали высвобождению эндотелием и клетками воспалительного инфильтрата проангиогенных молекул — фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и хемокинов, необходимых для обеспечения роста капилляров. Ранее было отмечено, что присутствие VEGF в области регенерирующего раневого дефекта также поддерживало воспалительный ответ и увеличивало проницаемость сосудов, что дополнительно способствовало отеку окружающих тканей [12]. В нашем исследовании экспрессия VEGF увеличивалась во всех экспериментальных группах, особенно с раневым покрытием, что указывало на более интенсивное сосудообразование при отсутствии воздействий со стороны агрессивных факторов ротовой полости.

На 7-й день исследования доминирующим процессом становилась пролиферация, основную роль в которой играли фибробласты, отвечавшие за синтез коллагена и сокращение площади раны [13]. Они секретировали экстрацеллюлярный матрикс, заменяющий матрикс фибрина [14], в связи с чем происходило усиление их синтетической активности, что обнаруживалось на ультраструктурном уровне в экспериментальной группе 2. Благодаря их присутствию в области раневого дефекта отмечалось значимое увеличение удельной площади рыхлой волокнистой соединительной ткани по сравнению с  экспериментальной группой 1, в которой, по данным электронной микроскопии, в основном появлялись юные фибробласты с низкой синтетической активностью.

На 7-е сутки уменьшилась удельная площадь грануляционной ткани, в связи с чем новообразованные сосуды претерпевали изменения на ультраструктурном уровне и по данным иммуногистохимического исследования. Достоверно снижалась экспрессия VEGF для группы 1 по сравнению с группой 2, что стало предпосылкой к дальнейшему недостатку кровоснабжения в области раневого дефекта [15].

Для стадии пролиферации были характерны дифференцировка клеток эпителия и утолщение его слоев. На ультраструктурном уровне в группе 2 восстанавливались апикально-базальная полярность базального слоя, десмосомные контакты между клетками и полудесмосомы с базальной мембраной. Были обнаружены также признаки нарастающей пролиферации. Во всех экспериментальных группах выявлены патологические изменения в виде акантоза и акантолиза, что морфологически проявлялось наличием тканевого детрита в межклеточном пространстве и утолщением шиповатого слоя. Эти патологические признаки были больше выражены в группе без покрытия.

Следующим этапом регенерации раны, наступавшим на 12-е сутки, была рубцовая реорганизация. В группах с покрытием, в отличие от экспериментальной группы 1, преобладала удельная площадь рыхлой волокнистой соединительной ткани над рубцовой, а также наблюдались преимущественно синтетически не активные фиброциты.

На 12-е сутки происходило уменьшение количества сосудов микроциркуляторного русла во всех экспериментальных группах. Уменьшение количества новообразованных сосудов микроциркуляторного русла связывают с их регрессией в результате избирательного апоптоза на фоне усиления выработки антиангиогенных и снижения проангиогенных факторов, таких как VEGF [12]. В подтверждение этому мы наблюдали, что в экспериментальной группе 1 экспрессия VEGF была значимо ниже, чем в интактной слизистой оболочке. Это свидетельствовало об ухудшении кровоснабжения ткани на месте раневого дефекта, что является одной из основных причин рубцовой деформации [16]. В группе с покрытием экспрессия маркеров сосудообразования была выше контрольных значений.

На 12-е сутки, по данным электронной микроскопии, в группе с раневым покрытием визуализировались периферические нервы, содержащие безмиелиновые нервные волокна, в группе без него они не определялись. Также в группе 1 по краям от раневого дефекта были обнаружены периферические нервы с признаками периневрального и эндоневрального отека, в аксонах которых визуализировались митохондрии с деструкцией крист. Исследование экспрессии белка периферических нервов S-100 показывало отрицательные результаты во всех группах, что свидетельствовало о начальных стадиях прорастания нервных волокон в область раневого дефекта.

Полное восстановление толщины и количества слоев эпителия в группе с покрытием происходило благодаря защите его от микроорганизмов. При нарушении целостности эпителиального пласта в случае открытой раны микроорганизмы проникали на дно дефекта, их экзотоксины воздействовали на рану как изнутри, так и снаружи, вызывая апоптоз эпителиоцитов и нарушая их пролиферацию и миграцию, что было связано с феноменом коллективной регуляции экспрессии генов бактерий в биопленке, который повышал их резистентность и способность к колонизации [17]. Кроме того, продукты метаболизма микроорганизмов вызывали в эпителиоцитах усиленную выработку провоспалительных медиаторов через толл-подобные рецепторы [18]. В результате этого мы наблюдали истончение эпителиального пласта и снижение количества его слоев в группе без покрытия, а также сохранение таких патологических изменений, как акантоз и акантолиз.

ВЫВОДЫ

Использование полимерной мембраны способствует полному перекрытию эпителиального пласта уже на 3-и сутки исследования и отсутствию патологических изменений на 12-е сутки. В то время как в группе без нее эпителизация раны наступала только на 7-е сутки, а патологические изменения в виде акантовая и акантолиза визуализировались на 12-е.

При использовании полимерной мембраны происходило более интенсивное замещение грануляционной ткани на рыхлую волокнистую соединительную ткань и наблюдалась меньшая выраженность воспалительной инфильтрации и рубцовых изменений. В то время как в группе без покрытия к моменту окончания исследования преобладала плотная волокнистая соединительная ткань и наблюдалась выраженная воспалительная инфильтрация.

При использовании полимерной мембраны ускорялся неоангиогенез, что выражалось в более интенсивной экспрессии маркера VEGF на каждой точке исследования по сравнению с группой, где покрытие не использовалось.

В целом, исследование показало, что использование полимерной пьезоэлектрической мембраны благоприятно влияло на восстановление тканей слизистой оболочки рта в области раневого дефекта, что сопровождалось ускоренным восстановлением эпителия, трофического аппарата и соединительнотканного компонента. В дальнейшем это способствует оптимизации процесса лечения ран данной локализации и улучшению качества жизни пациентов.