Исследования, посвященные изучению роли цитокинов в аспекте особенностей постковидного периода, актуальны, так как в период пандемии получен большой объем знаний об изменении этого звена иммунного регулирования при COVID-19, и восстановление происходит длительно, включая как ранний, так поздний период реконвалисценции. При этом вирус-опосредованные изменения цитокинового звена, в связи с их полиорганными эффетами действия, в постковидном периоде могут определять модификацию патогенеза заболеваний неинфекционной природы, в том числе у больных с эссенциальной артериальной гипертензией (ЭАГ). Важно отметить, что, несмотря на большое число исследований, посвященных количественным характеристикам цитокинового профиля пациентов с различными заболеваниями, нет точных референсных интервалов. Не менее важно, ограничено число исследований, анализирующих циркадианные ритмы синтеза цитокинов у лиц с определенными заболеваниями. Вышеперичисленное наиболее значимо для пациентов с ЭАГ, так как суточные кривые уровней АД имеют принципиальное значение и их уже давно учитывают на практике. В постковидном периоде описано как повышение частоты сердечно-сосудистых осложнений, так и развитие метаболического синдрома, что может быть связано и с методами терапии (широкое применение кортикостероидов), и с ролью коронавируса в зависимости от предсуществующих иммунопатогенетических и клинических характеристик больных. Уровни синтеза цитокинов не только выступают факторами, подчиняющимися суточным закономерностям, но и при клиническом или субклиническом дисбалансе способны влиять на главный центр циркадианных часов — супрахиазматическое ядро в головном мозге, а также способствовать потере синхронизации между главным центром и периферическими «часами» [1, 2]. Хронибиология перспективна, обладает большим объемом значимых научных данных [3, 4] и требует расширения числа исследований в постковидном периоде. Важно отметить, что индивидуальный анализ суточных кривых содержания цитокинов в периферической крови позволяет говорить о более сложных закономерностях, чем двухфазные изменения день–ночь. По некоторым данным, количество IL2 в сыворотке крови образует единый пик примерно в полдень, а IL10, TNF и GМ-CSF демонстрируют двухфазный паттерн [5]. У испытуемых первый пик TNF приходился на 07:30, а второй — на 13:30, что не позволяет однозначно относить его к группе цитокинов покоя. Уровни IL10 также демонстрировали двухфазную картину с одним пиком в 07:30 и вторым — 12 ч спустя — в 19:30. Эти результаты показывают, что временные паттерны уникальны для каждого цитокина, как правило, с дневными максимумами и ночными минимумами [2], в связи с чем фундаментальные данные об изменении циркадианных ритмов синтеза цитокинов после перенесенной новой коронавируной инфекции могут представлять не только научный, но практический интерес в будущем.

Цель исследования — проанализировать особенности циркадианных ритмов содержания цитокинов (IL18, IL18 BP, LIF, sLIFr, M-CSF, MCSFR) в крови пациентов с ЭАГ II стадии и выделить патогенетически значимые особенности, сформированные после перенесенной новой коронавирусной инфекцией.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполняли в 2019–2023 гг. на базах кафедры иммунологии, микробиологии, вирусологии Медицинского института ФГБОУ ВО «НИ МГУ им. Н. П. Огарева» (микробиологическая и иммунологическая лаборатория — лицензия № 13.01.04. 0001. Л.000005.06.11, бессрочная), ГБУЗ РМ «РКБ имени С. В. Каткова», ФГБУ «Санаторнокурортный комплекс «Северокавказский» МО РФ.

Под динамическим комплексным (клиническим, лабораторно-инструментальным) наблюдением находились 27 больных (10 женщин и 17 мужчин) с ЭАГ II стадии (группа 1) и 16 здоровых лиц (7 женщин и 9 мужчин) с нормальным уровнем АД (группа 2), у которых в 2019 г. (до пандемии) были проанализированы уровни цитокинов (7.00–8.00 ч, 12.00–13.00 ч, 19.00–20.00, 00.00–1.00) в крови в течение трех суток. В 2020 г. (циркуляция штамма Wuhan-Hu-1) у 18 пациентов из первой группы (8 женщин и 10 мужчин) и у 9 человек (4 женщины и 5 мужчин) из второй группы был диагностирован COVID-19 в соответствии с актуальными временными методическими рекомендациями по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции, среднетяжелое течение, пневмония (КТ I–II ст). Применяли сопоставимые схемы терапии: дексаметазон — 16 мг/сут., сумамед 500 — 3 раза в день, гепарин (коллектив исследователей не влиял на терапию).

Критерии включения пациентов в исследование 2019 г.: ЭАГ II стадии, длительность заболевания — 10 лет (первый этап исследования), сопоставимая гипотензивная терапия (и-АПФ ± диуретик), 55–60 лет, уровень общего холестерина менее 5,0 ммоль/л, ЛПНП менее 3,0 ммоль/л, ЛПВП более 1,0 ммоль/л, ТГ менее 1,7 ммоль/л, ТИМ менее 0,9 мм, глюкоза менее 5,5 мг/дл, ИМТ менее 30 кг/м², сопоставимые характеристики режима дня (сон с 23.00 до 6.00, последний прием пищи в 20.00, отсутствие нарушения сна и приема снотворных средств и/или препаратов, содержащих мелатонин (оценку данных характеристик проводил врач-невролог), подписание пациентом информированного согласия.

Дополнительные критерии включения пациентов в 2020 г.: участие в исследовании циркадианных ритмов содержания цитокинов у больных с ЭАГ в 2019 г.; COVID-19 в анамнезе (10-й день после клиниколабораторного выздоровления при сопоставимой длительности госпитализации 14–16 дней); в группу 2 — лица без ЭАГ + COVID-19 в анамнезе (10-й день после клинико-лабораторного выздоровления при сопоставимой длительности госпитализации 14–16 дней); COVID-19 подтвержден методом ПЦР и данными серологического исследования; среднетяжелое течение, с поражением легких (KT I–II ст.); сопоставимая терапия COVID-19, а также наличие письменного согласия на обследование.

Критерии исключения были общими в 2019 и 2020 гг.: сахарный диабет 1-го или 2-го типа, заболевания аллергического/аутоиммунного характера, психические заболевания, симптоматическая АГ, курение, претенденты, не готовые к долгосрочному обследованию, применение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов в период COVID-19 и за шесть месяцев до исследования. Исключали больных, которым необходим прием антигипертензивных препаратов, помимо ИАПФ и/или тиазидных/тиазидопобных диуретиков (только для группы с ЭАГ II стадии).

Время забора крови (7.00–8.00, 12.00–13.00, 19.00–20.00, 00.00–1.00) и спектр цитокинов (IL18, IL18 BP, LIF, sLIFr, M-CSF, MCSFR) были определены на основании научных исследований о циркадианных ритмах биологии цитокинов человека [6, 7] и ранее проведенных собственных исследований по изучению цитокинов в патогенезе ЭАГ [8].

По данным нашего 10-летнего исследования, уровни IL18, IL18 BP, LIF, sLIFr, M-CSF, MCSFR статистически независимо ассоциированы с частотой развития сердечно-сосудистых осложнений у больных с ЭАГ, что объясняют и данные о спектре клеток, обладающих рецепторами для этих цитокинов [9], и их связи с метаболизмом вазопрессоров и вазодилятаторов.

Забор крови проводили в 7.00–8.00, 12.00–13.00, 18.00–19.00.00, 00.00–1.00 (трое суток) с использованием систем BD Vacutainer (Becton Dickinson; США (для выделения сыворотки крови), кровь центрифугировали (1500–2000 об./мин, 15 мин) для выделения сыворотки с последующим хранением сыворотки крови в маркированных пробирках при температуре –30 °С не более 30 суток. Время от забора крови до замораживания составляло 60 мин. Цитокины (IL18, IL18 BP, LIF, sLIFr, M-CSF, MCSFR) определял сертифицированный специалист методом ИФА на иммуноферментном анализаторе Personal Lab TM (Adaltis; Италия). Тест-системы фирм eBioscience (Bender MedSystems; Австрия), R&D Systems (США).

Суточные характеристки пациентов определены в соответствии с классификацией: снижение АД от 10 до 20% соответствует типу «Диппер»; снижение менее 10% — «Нон-диппер»; рост в ночное время — «Hайт-пикер». Суточное мониторирование проводили всем пациентам параллельно с забором крови для определения уровней цитокинов.

Статистическую обработку полученных результатов провели с использованием программы StatTech v. 2.8.8 («Статтех»; Россия) и Stat Soft Statistica 10.0 (США). Результаты представлены в виде медианы (Ме) и перцентилей (Q0,25–Q0,75). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. При сравнении зависимых выборок использовали критерий Уилкоксона, независимых групп — критерий Манна– Уитни. Применяли регресионную модель Кокса с оценкой коэффициента регрессии. За статистически достоверные были приняты различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ данных динамики содержания изучаемых цитокинов в крови пациентов с ЭАГ в течение двух суток в допандемический период (табл. 1) позволил определить отличия от закономерностей здоровых лиц (табл. 2).

В системе IL18–IL18BP на фоне ЭАГ отмечено повышение с 19.00 и в 0.00 ч содержания в сыворотке периферической крови IL18 при сопоставлении с результатами, полученными в 7.00 и 12.00 (р < 0,001) без роста IL18 BP в течение времени наблюдения. У здоровых лиц не зарегистрировано увеличение IL18, но было повышение IL18 BP (р < 0,05) в 00.00. При этом количественно уровни IL18 у лиц с гипертензией достоверно превышают данные группы здоровых лиц (р < 0,001). В период ранней реконвалисценции после перенесенной новой коронавирусной инфекции у пациентов с ЭАГ дополнительно зафиксировано снижение уровня 18 BP в 19.00, которое сохранялось и в 00.00 (р < 0,001) при сопоставлении  с данными в 7.00, 13.00, 19.00 (табл. 3), что отличало данную группу от здоровых, имеющих повышение концентрации IL18 в 00.00, но при компенсаторном увеличении IL18 ВР с 20.00 (табл. 4).

Анализ системы LIF-sLIFR до SARS-CoV-2 инфицирования выявил у лиц с ЭАГ рост двух компонентов системы в 19.00 со снижением в 00.00 (табл. 1), данная динамика отсутствовала у здоровых лиц (табл. 2). В период реконвалисценции после перенесенной новой коронавирусной инфекции у больных с ЭАГ обнаружено более выраженное (200%) увеличение sLIFr в 19.00, с сохранением динамики и количественных характеристик LIF.

Уровни M-CSF, а также его рецептора у лиц с ЭАГ не изменялись в течение суток в доковидном периоде (табл. 1), при этом у здоровых лиц отмечен рост в 00.00 M-CSF на фоне увеличения M-CSFR в 19.00 и 00.00 с восстановлением в 7.00. Количественные характеристики M-CSF были достоверно выше у пациентов с гипертензией во все временные промежутки (р < 0,001) при сопоставлении с данными здоровых лиц. В период реконвалисценции после COVID-19 отмечено формирование пикового увеличения M-CSF в 19.00 со снижением в 00.00 у лиц с ЭАГ (не выявлено ранее) без динамики  M-CSFR. У здоровых лиц отсутвуют изменения циркадианных ритмов данных цитокинов при сопоставлении с данными до SARSCoV-2 инфицирования.

Важно отметить, что через шесть месяцев после перенесенного COVID-19 при мониторинге аналогичных цитокинов у 85% пациентов с ЭАГ закрепились циркадианные закономерности, сформированные после COVID-19 в виде снижения в 19.00 содержания IL18 BP, двукратного увеличения sLIFr  и MCSF (табл. 5), а у здоровых лиц обнаружено восстановление закономерностей доковидного периода (табл. 6).

Сопоставление особенностей циркадианных ритмов содержания анализируемых цитокинов в постковидном периоде и изменения течения ЭАГ позволили выявить (в ходе проведенного интраквартильного анализа), что для пациентов при увеличении уровня sLIFr на 200% и более (III и IV квартили изменения уровня sLIFr — 8 человек) в 19.00 характерен вечерний рост систолического артериального давления выше 150 мм рт. ст., несмотря на антигипертензивную терапию, дающую терапевтический эффект до перенесенной новой короновирусной терапии и в утреннее/дневное время после перенесенной инфекции, что потребовало изменения терапии (времени приема препарата) и увеличения дозы базовых препаратов. К тому же в постковидном периоде у 8 из 18 пациентов с ЭАГ, включенных в исследование, сформировался суточный ритм АД по результатам холтеровского мониторирования — «Hайт-пикер» (повышение АД в ночное время), до SARSCoV-2-инфицирования все пациенты относились к группе Dipper. Указанные пациенты имели совокупность изменений циркадианных ритмов, описанную выше: снижение содержания IL18 BP более 58%, двухкратное увеличение sLIFr и MCSF. При этом многофакторный корреляционный анализ связи уровней цитокинов (IL18, IL18 BP, LIF, sLIFr, M-CSF, MCSFR) во всех анализируемых временных точках и уровня систолического артериального давления (по данным суточного мониторирования АД) выявил достоверную статистически независимую связь между концентрацией sLIFr и систолическим АД: коэффициент регрессии — 2,48, стандартная ошибка — 0,22, t-критерий — 9,83, относительный риск повышения систолического АД в период после 18.00 — 4,2, критерий Уальди — 16,3.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные данные демонстрируют изменения циркадианных ритмов содержания цитокинов в периферической крови у пациентов и в зависимости от наличия ЭАГ, и их дополнительное искажение в постковидном периоде, что в значимом числе случаев имеет стойкий характер с сохранением более шести месяцев. Учитывая ранее опубликованные данные о корреляционных связях увеличения sLIFr более 5000 пг/мл с ростом NT-proBNP (r = 0,87; p = 0,0007), а MCSF с уровнем в крови SDMA (r = 0,83; p = 0,0008) [7], можно говорить о патогенетической значимости выявленных циркадианных изменений в аспекте прогрессирования ЭАГ. Так, вторичный рост NT-proBNP, несмотря на способность к вазодилятации, что позитивно при ЭАГ, будет определять прогрессирование хронической сердечной недостаточности с повышением риска формирования сердечно-сосудистых осложнений [10]. Положительная связь MCSF и IL18 с ростом SDMA [8] чаще имеет ренальный характер [11] и может определять вектор прогрессирования гипертензии, отменяя эссенциальный характер. Но есть данные о его продукции эндотелиальными клетками под воздействием провоспалительных цитокинов [12], что в данном случае может носить вирус-индуцированный характер.

Фундаментальные исследования, посвященные циркадианным ритмам синтеза тех или иных регуляторных пептидов, требуют высокой сопоставимости включеных в исследование пациентов (что было достигнуто в исследовании и позволило сократить объем выборки), а также стабильности суточных ритмов жизни, чередования фаз день/ночь, и имеют больше теоретическое значение. Однако в анализируемых клинических ситуациях выявлены значимые связи, определяющие и клинические особенности развития гипертензии с изменением схем терапии из-за потери контроля над уровнем АД при изменении его суточного ритма, который был достигнут до инфицирования SARS-CoV-2.

Отдельное внимание необходимо уделить отсутствию компенсаторного увеличения у лиц с ЭАГ в постковидном периоде цитокинов, обладающих протективными свойствами в отношении прогрессирования эндотелиальной дисфункции (IL18 BP, M-CSFR). IL18BP снижает риск повреждения почек на моделях ишемии–реперфузии на животных благодаря своей антиоксидантной и противовоспалительной активности, а также антиапоптотическим свойствам [13], что значимо при АГ. В ряде публикаций при этом отмечена перспективность IL18 BP как терапевтической мишени при сердечнососудистых заболеваниях [13, 14].

При детальном анализе подтверждаются данные о необходимости оценки четырех временных точек; наибольшая прогностическая значимость для анализируемых цитокинов определена в 19.00. Это значимо для дальнейших смежных исследований, которые изучают роль цитокинов в патогенезе сердечнососудистых заболеваний и постковидного синдрома, но ориентируются на утренний забор крови, возможно, менее значимый, чем в 19.00.

ВЫВОДЫ

Анализ роли инфицирования вирусом SARS-CoV-2 в изменении циркадианных ритмов содержания цитокинов (IL18, IL18 BP, LIF, sLIFr, M-CSF, MCSFR) в крови у лиц с ЭАГ открывает перспективы анализа роли и других инфекционных агентов в изменении цитокинового компонента прогрессирования эндотелиальной дисфункции. Сделана оценка изменения уровня цитокинов в нескольких временных точках в течение суток с верификацией повторения выявленных закономерностей при наблюдении пациента в течение несколько дней. Хронобиология требует многостороннего изучения для расширения объема фундаментальных данных, которые способны объяснить клинические особенности социальнозначимых заболеваний, и в будущем, возможно, станут основой новых принципов терапии.