Одним из ограничений внедрения в оборот новых фармацевтических субстанций, химических веществ и косметической продукции является риск развития повреждений или раздражения кожных покровов. В связи с этим, сертификационная оценка безопасности данных продуктов подразумевает обязательное тестирование на дерматотоксичность.

Известен ряд стандартизованных тестов in vivo, одобренных Организацией экономического сотрудничества и развития (OECD) и регламентированных ГОСТ РФ. В частности, для оценки дерматотоксичности широкое применение нашли протоколы OECD № 429 на основе анализа локальных лимфатических узлов мышей [1], № 406 — максимизационный тест на морских свинках Магнуссона и Клигмана [2], а также Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека, в том числе «Испытания по оценке кожной сенсибилизации» (ГОСТ 32375-2013) [3] и «Определение токсичности при повторном/многократном накожном поступлении. 28/21-дневный тест» (ГОСТ 32642-2014) [4] и др.

Однако исследования неблагоприятных эффектов препаратов с использованием животных приобретают все больше ограничений [5], в то время как тесты in vitro, основанные на использовании клеток человека видоспецифичны, лучше воспроизводимы и обладают достаточной достоверностью [6, 7]. В частности, исследование повреждений и/или раздражений глаз могут быть проведены с использованием реконструированного роговице-подобного эпителия человека (EpiOcular™ (MatTek; США), MCTT HCE™ (Biosolution; Южная Корея)) [8, 9], а коррозионных свойств — на реконструированном эпидермисе человека (EpiSkin™ (L’Oréal; Франция), epiCS® (Phenion; Германия)) [10, 11].

Одним из этапов исследования биобезопасности тестируемых соединений является оценка цитотоксичности, например, в отношении иммортализованных кератиноцитов человека HaCaT, с помощью колориметрических или флуорометрических анализов (МТТ-тест, окрашивание аннексином V или трипановым синим) [12]. Однако цитотоксические эффекты могут заключаться не только в изменении метаболической активности или гибели клеток, но и в активации ряда сигнальных путей. Перспективный подход для регистрации цитотоксических эффектов — использование генетически модифицированных клеток, несущих репортерные гены под контролем чувствительных к стрессу промоторов [13–15]. Например, для оценки сенсибилизирующего действия тестируемых веществ на кожу человека активно используют тест KeratinoSens™, который представляет собой клеточную линию, содержащую репортерный ген люциферазы под контролем элемента антиоксидантного ответа — гена AKR1C2 [16].

Транскрипционные факторы, такие как NF-κB и AP-1, участвуют в клеточном ответе на широкий спектр стимулов: тяжелые металлы, ультрафиолет, цитокины, инфекционные агенты и др., и могут представлять интерес в качестве биомаркеров цитотоксического воздействия [15, 17]. Так, важный транскрипционный фактор NF-κB регулирует транскрипцию белков, участвующих в воспалительном ответе, иммунном ответе, окислительном стрессе, апоптозе. AP-1 играет ключевую роль в пролиферации, дифференцировке, старении и гибели клеток. Флуоресцентный биосенсор на основе линии преадипоцитов 3T3-L1, стабильно экспрессирующх GFP при активации пути NF-κB, ранее был использован для регистрации противовоспалительных эффектов антиоксидантов растительного происхождения [18]. Разработанная ранее клеточная модель стенки тонкого кишечника человека на основе клеток линии Сaco-2 обеспечивала дозозависимую регистрацию активации транскрипционного фактора NF-κB под действием кадмия [15].  Клеточный биосенсор на основе HT-29 с регуляторным элементом для транскрипционного фактора АР-1 и геном, кодирующим флуоресцентный белок mCherry, успешно применяли для скрининга токсичности тяжелых металлов [17]. Однако клеточные сенсоры, регистрирующие активацию сигнальных путей NF-κB и AP-1, при оценке дерматотоксических эффектов в тестах in vitro ранее не исследовали.

Цель исследования — разработать клеточные сенсоры на основе иммортализованных кератиноцитов человека линии HaCaT, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) при активации сигнальных путей NF-κB (HaCaT/NF-κB) или AP-1 (HaCaT/AP-1) и изучить их информативность при регистрации дозозависимого повреждения клеток. 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Трансдукция клеточной линии HaCaT лентивирусной конструкцией с регуляторными элементами для транскрипционных факторов NF-κB/AP-1 и геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок

Культивирование клеток HaCaT (CLS Cell Lines Service, 300493; Германия) проводили в питательной среде ДMEM/F12 (Gibco; США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco; США), 0,1% GlutaMAX^TM и пенициллина/стрептомицина в объеме 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно (Gibco; США) в СО₂-инкубаторе (MCO-20АIС Sanyo; Япония) при температуре 37 ± 1 °C, влажности 90 ± 10% и концентрации CO₂ 5,0 ± 1,0%. Замену питательной среды производили каждые 48 ч. По достижении 80% конфлюентности, клетки диссоциировали 0,25%-м раствором трипсин-ЭДТА («Пан-Эко»; Россия) и ресуспендировали в свежей культуральной среде.

Трансдукцию клеток проводили с помощью наборов Cignal Lenti Reporter Assay (QIAGEN; США), содержащих лентивирусные частицы с индуцируемым NF-κB/AP-1 GFP-репортером. Концентрация лентивирусных частиц составляла 2 × 10⁷ частиц/мл. Для проведения трансдукции клетки высевали в количестве 4 × 10⁴ клеток на лунку в 24-луночный планшет (Corning; США) и инкубировали в течение ночи в СО₂-инкубаторе (MCO-20АIС; Sanyo, Япония).

Через 18 ч среду отбирали, добавляли лентивирусные частицы в объеме 80 мкл, что соответствовало множественности трансфекции 40, и 6 мкл SureENTRY Transduction Reagent (QIAGEN; США) для улучшения эффективности трансфекции. Общий объем раствора доводили до 600 мкл. Инкубировали в течение 24 ч в СО₂инкубаторе (MCO-20АIС; Sanyo, Япония). В контрольной лунке среду заменяли на 600 мкл полной культуральной среды. После этого среду с лентивирусными частицами заменяли на ДMEM/F12 (Gibco; США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco; США), пенициллина/ стрептомицина в объеме 100 ед./мл и 100 мкг/мл соответственно и 0,1% GlutaMAX (Gibco; США).

Селекция трансдуцированных клеток с GFP-репортером, индуцируемым NF-κB и AP-1

Для селекции использовали антибиотик пуромицин (InvivoGen; США), к которому были устойчивы трансдуцированные клетки. Для оценки устойчивости нетрансдуцированных клеток HaCaT (дикого типа) к пуромицину применяли МТТ-тест. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (Corning; США) по 2 × 10³ клеток в 200 мкл среды на лунку в ДМЕМ/F12, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и GlutaMAX (Gibco; США). Затем вносили 0; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 и 8,0 мкг/мл пуромицина и культивировали клетки в течение 10 дней, заменяя среду в лунках каждые 96 ч. Ежедневно исследовали клетки с помощью фазово-контрастного светового микроскопа Primovert (Carl Zeiss; Германия).

По истечении срока воздействия отбирали из лунок питательную среду с пуромицином (опыт) или питательную среду (контроль), промывали фосфатно-солевым буфером с pH 7,4 (PBS; «ПанЭко», Россия) и добавляли 200 мкл свежей полной питательной среды, содержащей 0,5 мг/мл МТТ. Инкубировали в течение 2 ч в СО₂-инкубаторе MCO-20АIС (Sanyo; Япония) при температуре 37 °C и 5% CO₂. Затем отбирали среду, промывали 200 мкл PBS и добавляли в каждую лунку 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО; Helicon, Россия). После 15 мин перемешивания на шейкере (150–200 об./мин, в темноте) измеряли оптическую плотность растворов на длине волны 595 нм (за вычетом фонового поглощения на длине волны 655 нм) с помощью планшетного спектрофотометра iMark (BioRad; США). Жизнеспособность определяли по формуле:

формула

где ОП — оптическая плотность.

Сортировка трансдуцированных клеток с GFP-репортером, индуцируемым NF-κB и AP-1

Для сортировки полученные после селекции популяции трансдуцированных клеток рассаживали на чашку Петри диаметром 100 мм (Corning; США) или культуральный матрас Т75 (Corning; США) в концентрации 4 × 10⁵ клеток на чашку. При достижении 70–80% конфлюента заменяли среду на содержащую активатор сигнального пути NF-κB — 20 нг/мл фактора некроза опухоли альфа (TNFα) (чистота > 95%; Elabscience, Китай) или AP-1 — Cd(NO₃)₂ в концентрации 10 мкМ. Через 24 ч инкубации клетки обрабатывали 0,25%-м раствором трипсина-ЭДТА, осаждали при 300 g 5 мин и ресуспендировали в 1 мл свежей питательной среды для последующей сортировки GFP-положительных клеток.

Сортировку GFP-положительных клеток проводили при помощи клеточного сортера BD FACSMelody™ Cell Sorter (BD Biosciences; США). Анализируемую клеточную популяцию определяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния для исключения дебриса и дуплетов. В качестве негативного контроля (контроля автофлуоресценции) использовали нетрансдуцированные клетки. В результате сортировки получали трансдуцированные клеточные линии с максимальным уровнем флуоресцентного белка в ответ на индукцию.

Исследование дозозависимого изменения интенсивности флуоресценции трансдуцированных клеток HaCaT при активации путей NF-κB/AP-1

Трансдуцированные клетки HaCaT высевали в 96-луночный планшет по 7 × 10³ клеток на каждую лунку, затем инкубировали в течение ночи в СО₂-инкубаторе MCO-20АIС (Sanyo; Япония) при температуре 37 °C. К клеткам добавляли различные концентрации тестовых веществ: TNFα и липополисахарид (LPS) (чистота ≥ 99%; Servicebio, Китай) — для активации NF-κB; Cd(NO₃)₂ — для активации AP-1. Было также исследовано влияние ультрафиолетового излучения (УФ-A) с длиной волны 365 нм на уровень флуоресценции трансдуцированных клеток HaCaT/AP-1. Интенсивность флуоресценции фиксировали на многофункциональном ридере Infinite M200 (Tecan; Швейцария) с длинами волн возбуждения 477 нм и эмиссии 507 нм для флуоресценции и длиной волны 600 нм для абсорбции. Вычисляли среднюю интенсивность флуоресценции в клетках (за вычетом средней интенсивности флуоресценции фона без клеток) по отношению к контрольным клеткам без индукторов (100%). Микрофотографии биосенсора в интактном и активированном состояниях были получены на флуоресцентном микроскопе ZOE (Bio-Rad; США). Полученные фотографии обрабатывали с помощью графической программы ImageJ (NIH; США).

Анализ экспрессии целевых генов методом полимеразной цепной реакции

Полученные результаты измерения интенсивности флуоресценции сравнивали с результатами исследования экспрессии генов, полученных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, различных субъединиц белка NF-κB (RelA — субъединица p65; NFKB1 — субъединица p50) и AP-1 (C-JUN). Для этого выделяли РНК (с использованием набора для выделения РНК на колонках («Биолабмикс»; Россия) согласно протоколу производителя и измеряли ее количество на приборе NanoDrop 2000c (Thermo Scientific; США). Реакцию обратной транскрипции с 1 мкг РНК проводили с помощью MMLV RT kit («Евроген»; Россия) согласно протоколу производителя. ПЦР осуществляли с помощью qPCRmix-HS SYBR+LowROX («Евроген»; Россия). Праймеры представлены в табл. 1. В качестве референсного гена использовали GAPDH.

Анализ данных

Полученные результаты обрабатывали с помощью языка программирования для статистической обработки данных R. Различие между группами определяли с помощью t-критерия с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественное сравнение. Статистически значимыми различия считали при p < 0,05. Данные представлены в виде M ± m.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Трансдукция, селекция и сортировка клеток HaCaT

Клетки HaCaT были трансдуцированы с использованием лентивирусной конструкции Cignal Lenti Reporter Assay (QIAGEN; США), содержащей лентивирусные частицы с индуцируемым NF-κB/AP-1 GFP-репортером. В результате оценки цитотоксичного действия пуромицина с помощью МТТ-теста была выбрана рабочая концентрация антибиотика (минимальная концентрация, вызывающая полную гибель исходных клеток) для селекции трансдуцированных клеток, соответствующая 1000 нг/мл. Селекцию проводили в течение 10 дней, заменяя культуральную среду каждые 3 дня.

На следующем этапе, мы проводили сортировку трансдуцированных клеток после активации с помощью 20 нг/мл TNFα для HaCaT/NF-κB и 10 мкМ Cd (NO₃)₂ для HaCaT/AP-1 в течение 24 ч. В результате активации соответствующих сигнальных путей функциональные трансдуцированные клетки начинают вырабатывать GFP, что было зафиксировано с помощью проточной цитометрии. Сортировку GFP-положительных клеток проводили при помощи клеточного сортера BD FACSMelody™ Cell Sorter (BD Biosciences; США). Анализируемую клеточную популяцию определяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния для исключения дебриса и дуплетов (рис. 1). В качестве негативного контроля (контроля автофлуоресценции) использовали нетрансдуцированные клетки (рис. 1А, В). Трансдуцированные клеточные линии с максимальным уровнем флуоресценции в ответ на индукцию (гейт Р1, рис. 1Б; гейт Р2, рис. 1Г), были отобраны для последующего анализа работы биосенсора.

Исследование дозозависимого изменения интенсивности флуоресценции трансдуцированных клеток HaCaT при активации пути NF-κB с использованием TNFα и LPS

Полученные в результате селекции и последующей сортировки клетки линии HaCaT, трансдуцированные лентивирусной конструкцией, содержащей GFP-репортер, индуцируемый NF-κB, исследовали на дозозависимое изменение интенсивности флуоресценции методом флуориметрии с использованием различных концентраций известных индукторов данного сигнального пути — TNFα и LPS (далее — индукторы). К трансдуцированным клеткам добавляли различные концентрации индукторов, после чего фиксировали интенсивность флуоресценции клеток сенсора на многофункциональном ридере Infinite M200 (Tecan; Швейцария) и исследовали микрофотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа ZOE (Bio-Rad; США). Так, для активации NF-kB к клеткам вносили TNFα и LPS в концентрациях 0–80 нг/мл для обоих веществ. В результате инкубации с индукторами фиксировали изменение интенсивности флуоресценции (рис. 2). Кроме того, при воздействии TNFα уже в концентрации 5 нг/мл по появлению флуоресцирующих в зеленой области спектра клеток фиксировали активацию сигнального пути NF-κB. При увеличении концентрации TNFα вплоть до 10 нг/мл увеличивались интенсивность флуоресценции и количество флуоресцирующих клеток (рис. 2А, Б).

При воздействии LPS достоверное увеличение интенсивности флуоресценции и, соответственно, активация сигнального пути NF-κB также выявлены при минимальной исследуемой концентрации 5 нг/мл. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации обоих использованных индукторов выходила на плато при концентрации выше 20 нг/мл (рис. 2В, Г).

Полученные данные измерения интенсивности флуоресценции сравнивали с результатами исследования экспрессии генов различных субъединиц белка NF-κB (RelA — субъединица p65; NFKB1 — субъединица p50) (рис. 3). Показано, что воздействие TNFα приводит к увеличению экспрессии мРНК генов RelA и NFKB1, но статистически значимые различия по сравнению с контролем были получены только для концентрации 10 нг/мл, без дальнейшего роста экспрессии (рис. 3А). При воздействии LPS (рис. 3Б) обнаружена аналогичная тенденция: статистически значимое увеличение экспрессии мРНК генов RelA и NFKB1 происходило только при воздействии LPS в концентрации 20 нг/мл без статистически значимого изменения экспрессии при дальнейшем увеличении концентрации.

Исследование дозозависимого изменения интенсивности флуоресценции трансдуцированных клеток HaCaT при активации пути AP-1

Для оценки информативности клеточного сенсора, позволяющего фиксировать активность сигнального пути AP-1, мы использовали индукторы, вызывающие нарушение редокс-баланса клеток — Cd(NO₃)₂ и УФ-A. Мы фиксировали зависимость интенсивности флуоресценции биосенсора от концентрации Cd(NO₃)₂ или интенсивности излучения (рис. 4; табл. 2). Полученные данные об активации пути AP-1 сравнивали с результатами исследования экспрессии гена C-JUN, кодирующего субъединицу белка AP-1.

Показано, что воздействие Cd(NO₃)₂ приводит к увеличению флуоресценции клеток HaCaT/AP-1 при концентрации 20 мкМ до 40 мкМ. Однако изменение флуоресценции не было дозозависимым. Вероятно, при увеличении концентрации Cd(NO₃)₂ проявлялись цитотоксические эффекты данного индуктора, что приводило к снижению количества жизнеспособных флуоресцирующих клеток. При этом экспрессия мРНК C-JUN повышалась уже при воздействии 5 мкМ, однако не зависела от дозы воздействия при увеличении концентрации (табл. 2; рис. 4А).

Также исследовали ответ клеток сенсора на 24-часовое воздействие различных доз УФ-излучения с длиной волны 365 нм. Полученные результаты измерения интенсивности флуоресценции также сравнивали с результатами исследования экспрессии гена C-JUN, кодирующего субъединицу белка AP-1. Значительное увеличение интенсивности флуоресценции клеток сенсора наблюдали при дозе воздействии УФ в дозе 12–18 Дж/см² (достоверно в сравнении с клетками контроля). Интенсивность флуоресценции значимо отличается от контроля при увеличении дозы воздействия вплоть до 18 Дж (табл. 2; рис. 4Б). В то же время увеличение экспрессии мРНК гена C-JUN наблюдали при воздействии на клетки исследованных доз УФ-A. Однако изменения не носили дозозависимый характер.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Разработка тестов in vitro для оценки биобезопасности химических соединений (ХС) является актуальной задачей, поскольку исследования на животных приобретают все больше ограничений в последнее время [5, 19]. Поскольку кератиноциты первыми сталкиваются с повреждающими агентами и участвуют в иммунном ответе, они представляют собой перспективную модель для скрининга дерматологических эффектов. При этом линия иммортализованных кератиноцитов HaCaT представляет собой удобную альтернативу первичным клеткам для токсикологических исследований in vitro [12]. Так, клетки линии HaCaT демонстрируют нормальный морфогенез и экспрессируют все основные поверхностные маркеры первичных кератиноцитов, а также могут быть дифференцированы при стимуляции и экспрессируют специфические маркеры дифференцировки, такие как кератин 14, кератин 10 и инволюкрин, при этом могут переключаться между дифференцированным и базальным состоянием путем изменения концентрации Ca²⁺ в культуральной среде [20, 21]. Однако при использовании линии клеток HaCaT важно принимать во внимание наличие GOF (от англ. gain-of-function) мутаций в гене TP53, которые приводят к повышенной скорости пролиферации и нарушениям терминальной стадии дифференцировки [22]. Тем не менее, клетки HaCaT не требуют наличия в среде культивирования факторов роста и/или дифференцировки, обладают неограниченным потенциалом пролиферации и демонстрируют стабильный фенотип независимо от количества пассажей, в отличие от первичных кератиноцитов [23]. Таким образом, клетки линии HaCaT являются перспективной экспериментальной моделью для исследования различных физиологических процессов, происходящих в кератиноцитах человека, в том числе при анализе токсикологических эффектов ХС.

При разработке тест-систем для идентификации раздражения считается перспективным обеспечение возможности анализа конкретных биомаркеров, ассоциированных с повреждением [6, 24]. Это позволяет делать заключение не только о степени потенциальной цитотоксичности тестируемого вещества, но и о молекулярных механизмах ее реализации.

В настоящее время в центре внимания находятся те подходы, которые направлены на изучение ранней реакции клеток на повреждение, предпочтительно с помощью мониторинга в реальном времени. Такие подходы представляют собой перспективную альтернативу стандартным измерениям конечного эффекта воздействия, например, основанных на обнаружении специфических метаболических процессов с помощью колориметрических или флуорометрических анализов (МТТ-тест, окрашивание трипановым синим и др.). Так, на сегодняшний день известны тесты, например, STACK (от англ. scalable timelapse analysis of cell death kinetics), позволяющие выполнять высокопроизводительный анализ динамики процесса повреждения клеток в реальном времени [25]. В частности, флуоресценцию используют для идентификации популяций живых и мертвых клеток с помощью флуоресцентной микроскопии и тщательной оптимизации процедур анализа изображений. Однако цитотоксические эффекты могут не только включать в себя гибель клеток, но и быть связанными с развитием кожной сенсибилизации, одним из ключевых событий формирования которой, согласно OECD-сертифицированным тестам, является активация специфичных сигнальных путей в кератиноцитах (например, Keap1/Nrf2-ARE, NF-κB и др.) [26].

Для оценки потенциального повреждающего действия тестируемых веществ в тестах клеточного ответа при оценке их потенциальной биобезопасности на молекулярно-биологическом уровне, в данной работе были разработаны клеточные сенсоры на основе иммортализованных кератиноцитов человека HaCaT с регуляторными элементами для транскрипционных факторов NF-κB и AP-1 и геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок GFP. В результате доставки данных генетических конструкций клетки вырабатывали GFP при активации соответствующего сигнального пути. При этом интенсивность флуоресценции измеряли количественно. Несмотря на то что пик экспрессии белка GFP в клетках достигается через 24 ч с момента события, детектируемого с его помощью, динамика экспрессии GFP в клетках хорошо известна и точно описана.  В этой связи клеточные сенсоры на основе GFP позволяют оценивать динамику клеточного ответа на тестируемое воздействие. При этом необходимо учитывать отсроченный эффект появления флуоресценции и самого клеточного события [15].

Несмотря на то что транскрипционные факторы NF-κB и AP-1 являются одними из наиболее частых участников реализации процессов повреждения клеток на молекулярном уровне, проведенный экспериментальный анализ показал различные возможности разработанных сенсоров HaCaT/NF-κB и HaCaT/AP-1 в регистрации дозозависимых эффектов известных индукторов соответствующих сигнальных путей в клетках. Полученный клеточный сенсор с репортерной конструкцией, ассоциированной с активацией NF-κB, продемонстрировал возможность чувствительной дозозависимой регистрации активности данного сигнального пути в модельных клетках эпидермиса человека в тесте in vitro. Уровень экспрессии GFP-белка биосенсорной конструкции, ассоциированный с активацией сигнального пути NF-κB, измеренный с помощью флуориметрии, хорошо коррелировал с изменением экспрессии целевых мРНК, измеренных методом ПЦР в реальном времени. В свою очередь, клеточный сенсор HaCaT/AP-1 позволял зафиксировать факт активации индукторами соответствующего сигнального пути, однако регистрация дозозависимых эффектов индукторов оказалась невозможной.

Также следует обратить внимание, что информативность результатов тестирования с использованием обоих сенсоров снижалась по мере увеличения концентрации использованных индукторов. Это, вероятно, связано со значительным снижением количества жизнеспособных клеток сенсора в данных условиях, что не позволяет корректно оценивать результаты измерения флуоресценции. В этой связи до проведения тестов с использованием сенсоров HaCaT/ NF-κB и HaCaT/ AP-1 целесообразно провести МТТ-тест или иной аналогичный тест, позволяющий установить концентрации тестируемых веществ, приводящие к гибели клеток сенсора. Это позволит более корректно оценивать ранние события в клетках в ответ на действие тестируемых веществ, в том числе субтоксического характера.

ВЫВОДЫ

В данной работе разработаны биосенсоры на основе иммортализованных кератиноцитов HaCaT, содержащих генетические системы активации флуоресцентного белкарепортера GFP, экспрессия которого дозозависимо возрастает при активации сигнальных путей AP-1 и NF-κB, ассоциированных с повреждением клеток эпидермиса человека. Проведено экспериментальное определение чувствительности разработанных биосенсоров. Исследована возможность количественной регистрации интенсивности активации клеток сенсоров в ответ на воздействие индукторов. Установлено, что изменение флуоресценции HaCaT/NF-κB наблюдается при воздействии низких концентраций TNFα или LPS, что согласуется с изменением экспрессии генов RelA и NFKB1, и имеет дозозависимый характер. Клетки с биосенсором HaCaT/AP-1 также реагируют на воздействие Cd(NO₃)₂ и УФ-A увеличением интенсивности флуоресценции и экспрессии целевых генов, однако зафиксировать дозозависимые эффекты данных индукторов на клетки сенсора не удалось. Разработанные клеточные сенсоры могут найти применение в области оценки цитотоксических эффектов тестируемых веществ на клетки кожи человека в тестах in vitro, а также в фундаментальных исследованиях механизмов цитотоксичности. При этом сенсор HaCaT/ NF-κB представляется наиболее перспективным с точки зрения возможности регистрации дозозависимых эффектов повреждающих веществ.