В современном тканевом моделировании используют материалы, обладающие наибольшей биосовместимостью при имплантации, к которым относятся поликапролактон, поливинилпирролидон, полигликолевая кислота и др. [1–2]. В этом ряду поликапролактон (PCL) — синтетический полимер из класса алифатических полиэфиров, синтезированный в начале 1930-х гг., является наиболее перспективным для биоинженерных конструкций [3]. Его особые физико-химические и механические свойства, вязкоупругость и простота формования привели к производству продуктов различной формы для биомедицинской сферы: от наложения швов до замены тканей и органов с помощью 3D-печати, в частности, изоляционных (диффузионных) камер для имплантации клеточного материала. В настоящее время нанокомпозитные модификации и аддитивные технологии каркасных структур (скэффолдов) из поликапролактона для регенеративной медицины исследованы как с точки зрения терапевтической эффективности, так и с позиции безопасности применения [4]. Однако формирование из поликапролактона объемных, полых макрокамерносителей клеточного материала (диффузионных камер), позволяющих в определенной степени изолировать ее содержимое от сред организма-реципиента и не теряющих при этом достаточных адгезивных свойств, требует модификации условий 3D-печати, что ведет к изменению плотности и архитектуры волокон материала, а, следовательно, изменяет его физико-химические свойства и степень биосовместимости [5–6]. Для PCL доказана низкая биорезорбция в противовес умеренной биодеградации, которые можно корректировать изменением объема формируемой структуры, поляризацией или дополнительным введением противовоспалительных цитокинов [7–8]. Параметры деградации PCL зависят от молекулярной массы, формы полимера и локализации имплантации, а именно от степени васкуляризации. В соответствии с этим возможна как полная элиминация продуктов до углекислого газа, капроновой кислоты и воды, так и распад до промежуточных кристаллов полимера, 6-гидроксикапроновой кислоты, аморфных коллоидов в составе эндосом макрофагов [9]. Исследования подобных конструкций большей частью проводят на уровне реакции инородного тела (FBR), учитывающей локальные изменения в тканях, морфологию иммунного ответа in situ и резорбтивный потенциал в течение малого промежутка времени, что отчасти позволяет экспоненциально оценивать сроки возможной имплантации, период полувыведения и возможные последствия для организманосителя [1, 10–11]. Однако такой подход не позволяет с уверенностью говорить о том, что морфофункциональные изменения, включающие в себя повышение осмотического давления по отношению к окружающим тканям, сдвиг pH в кислую сторону, вялотекущее продуктивное воспаление и волновой окислительный стресс, связанный с неравномерным и аутокаталитическим отщеплением низкомолекулярных фрагментов, ограничиваются лишь локальным уровнем [12–14].

В условиях постановки диффузионной камеры на сосудисто-нервный пучок (СНП) важным критерием биорезорбции является прямой перенос кристаллов PCL и продуктов его распада макрофагами непосредственно в сосудистое русло [15–16], что в сочетании с физикохимическими свойствами материала может изменять как качественные характеристики сосуда, так и клеточный состав капсулы, вероятно, приводящие к более острому окислительному стрессу для организма-реципиента на локальном (в области постановки конструкции) [17] и системном уровнях [18].

Таким образом, существует необходимость в исследовании влияния продуктов биодеградации поликапролактона и общего значения имплантации на локальном и системном морфофункциональных уровнях, что может быть достигнуто в условиях применения диффузионной камеры in vivo на бедренном СНП крысы [19].

Цель работы — определить биосовместимость диффузионной камеры из поликапролактона при ее имплантации на бедренный сосудисто-нервный пучок крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Диффузионная камера (ДК) была спроектирована при помощи программного обеспечения с открытым исходным кодом Blender и выполнена методом послойного наплавления нитей (FFF) из поликапролактона (Natural works Ingeo 40-43d NatureWorks LLC), полученных электроспинингом, при помощи 3D-принтера CreatBot Duo (CreatBot 3D Printer; КНР). Камера состоит из двух частей, соединяющихся между собой защелками в полую капсулу с выемками в торцевых стенках (рис. 1), что позволяет фиксировать ее на СНП. Материал камеры представляет собой биоразлагаемый полиэфир (PCL 100%), разрешенный к медицинскому применению, с низкой температурой плавления (59–64 °С).

Стерилизацию ДК проводили в парах 100%-го этиленоксида при 37 °С в течение 9 ч в газовом стерилизаторе 3M Steri-Vac Sterilizer/Aerator (3М; США) согласно рекомендациям ГОСТ ISO 11135-2017.

В качестве экспериментальной модели использовали крыс линии Wistar массой 280–300 г, которых содержали в стандартных условиях вивария без проведения антибиотикотерапии на базе лаборатории биологических моделей Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск). Для эксперимента животные были разделены на две группы: в экспериментальную группу 1 (n = 4) вошли животные с имплантированными ДК на бедренный СНП; в контрольную группу 2 (n = 3) — интактные крысы. Имплантацию ДК экспериментальным животным производили под изофлураном. За 15 мин до операции внутримышечно вводили атропин в дозировке 0,2 мг/кг для предотвращения интраоперационных осложнений. Оперативный доступ выполняли из разреза в 2–3 см в глубине паховой складки, в направлении внутрь от пульсации бедренной артерии (рис. 1).

Через 40 дней по окончании эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии методом СО₂-ингаляции. Макроскопическую (визуальную) оценку места имплантации проводили на 3, 7, 12 сутки, а также через 40 суток после начала эксперимента при некропсии и оценивали по степени кровенаполнения сосудов, инкапсуляции и визуальных признаков воспалительной реакции (наличие гиперемии, отека, инфильтрата) в балловой системе, где 0 баллов означает отсутствие признака, 1 балл — слабая степень, 2 балла — умеренная степень.

В рамках исследования реактивной реакции организма реципиента проводили взятие мазка крови из хвостовой вены до имплантации и на 40-е сутки. Окрашивание мазков крови проводили по методике Романовского–Гимзы. Приготовление гистологических препаратов органовмишеней — печени, селезенки, почки, надпочечников  — после некропсии осуществляли по стандартной методике с окрашиванием гематоксилином и эозином [20]. Микроскопию проводили на световом микроскопе Karl Zeiss Observer D1 (Carl Zeiss; Германия).

Морфометрия для оценки возможных реактивных изменений органов была проведена по изображениям, полученным цифровой камерой для световой микроскопии Zeiss AxioCam ICc5 (Carl Zeiss; Германия), и основывалась на стромально-паренхиматозном отношении: стромальные компоненты (сосуды, межуточная ткань, септальные участки, капсула)/паренхима, а также на определении процентного содержания двуядерных гепатоцитов на 100 клеток. Картину крови оценивали по лейкоцитарной формуле. Для расчета параметров оценивали 10 полей зрения в каждой группе. Статистическую обработку проводили в программе Statistica 10.0, IBM (TIBCO Software; CША). Проверку статистических гипотез на характер распределения признака проводили при помощи критерия Шапиро–Уилка для малых (n < 30) выборок. При обработке полученных результатов использовали методы описательной и непараметрической статистики. Исследуемые параметры описывали как медиану (Ме), 25% (Q₁) и 75% (Q₃) квартили.  При сравнении независимых выборок использовали критерий Манна–Уитни с медианным тестом, для парных сравнений использовали критерий Фридмена. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В течение периода экспериментального моделирования имплантации ДК на СНП поведение животных опытной группы, их внешнее состояние, волосяной покров не отличались от таковых у контрольной группы. Местных постоперационных осложнений выявлено не было, подвижность оперируемой конечности была сохранена и не изменена.

Исследуемые параметры биосовместимости представлены в табл. 1.

Анатомо-топографическое состояние исследуемых внутренних органов животных (почек, надпочечников, селезенки, печени) экспериментальной группы не отличалось от контрольной группы.

При макроскопическом исследовании органов животных экспериментальной группы, по сравнению с органами животных контрольной группы, характерных новообразований и патологических изменений не было обнаружено (органы нормального цвета, с ровной поверхностью, интактны, не увеличены в размерах, отсутствуют признаки атрофии, фиброза, рубцевания, капсула сохранена, не утолщена).

Микроскопическое исследование печени крыс экспериментальной группы (рис. 2) показало: на малом увеличении определяется неутолщенная фиброзная капсула Глиссона, дольки правильной гексагональной формы, границы между дольками прослеживаются нечетко в связи с неразвитостью соединительной ткани, структура триад сохранена. Патологических образований и изменений выявлено не было.

На большом увеличении дольки состоят из радиально расположенных печеночных балок, представляющих собой анастомозирующие тяжи гепатоцитов. Между балками располагаются синусоидные капилляры печени, выстланные эндотелиальными клетками. В непосредственной близости от дольки определяется портальный тракт, состоящий из междольковой артерии, вены (диаметр вены в 3–4 раза больше диаметра артерии), желчного протока, выстланного однослойным кубическим эпителием с крупными темными округлыми ядрами и окруженного соединительнотканной оболочкой, и междолькового лимфатического сосуда. Гепатоциты чаще одноядерные, в них хорошо прослеживается базофильное ядро и гомогенная темно-красная цитоплазма. Относительное количество двуядерных гепатоцитов на 100 клеток в полях зрения составило 1,05% (1,02%; 1,11%), т. е. менее 10%.

Интерстициальная ткань определяется, не инфильтрирована, разрастания и признаков фиброза не обнаружено. Сосуды представлены центральными венами, расположенными в центре печеночных долек, поддольковыми венами со значительно большим просветом, собирательными венами, расположенными между дольками, портальным трактом (выявляются единичные лимфоциты, моноциты и гистиоциты), синусоидными капиллярами. Просвет одинаков в видимом поле, стенки не изменены, клеточной инфильтрации и признаков транссудации нет.

Микроскопическое исследование надпочечников крыс экспериментальной группы (рис. 3) показало: на малом увеличении определяется неутолщенная фиброзная капсула, определяется граница между корковым и мозговым веществом. Корковое вещество состоит из клубочковой, пучковой и сетчатой зоны. Мозговое вещество содержало более темные и крупные клетки. Патологических образований и изменений выявлено не было.

На большом увеличении клубочковая зона представлена небольшими мономорфными клетками с равномерно окрашенной оксифильной цитоплазмой и эксцентрично расположенным ядром, формирующими гроздевидные фигуры. Определяются единичные более крупные клетки с полиморфным ядром. Пучковая зона объемнее, корковое плато состоит из ветвящихся разнонаправленных синусоидов, между которыми расположены тяжи оксифильных вакуолизированных в большинстве случаев крупных клеток с гиперхромными ядрами. Граница между пучковой и сетчатой зонами определяется соединительнотканной прослойкой. Сетчатая зона представлена мелкими кровеносными сосудами, интенсивно окрашенными округлыми и угловатыми клетки с мелким гиперхромным ядром.

Мозговое вещество визуализируется сосудистой сетью, паренхиматозными крупными клетками, которые образуют плотные клеточные тяжи, ядро крупное и светлое, цитоплазма вакуолизированная, выявляется мелкоточечная гранулярность. Определяются широкие выносящие собирательные вены и синусоидные капилляры, которые окружены хромаффинными клетками с базофильной цитоплазмой.

Интерстициальная ткань определяется, не инфильтрирована, разрастания не обнаружено. Просвет сосудов одинаков в видимом поле, стенки не изменены, клеточной инфильтрации и признаков транссудации нет.

Микроскопическое исследование селезенки крыс экспериментальной группы (рис. 4) показало: на малом увеличении определяется неутолщенная фиброзная капсула, от которой отходят нечетко выраженные перекладины-трабекулы, анастомозирующие между собой. Граница между белой и красной пульпой сохранена. Белая пульпа занимает 1/5 часть органа, распределена диффузно, в большей степени подкапсулярно. Красная пульпа занимает оставшуюся часть органа (без капсулы и трабекул), состоит из селезеночных капилляров и селезеночных тяжей. Патологических образований и изменений выявлено не было.

На большом увеличении определяется состав оксифильной капсулы: мезотелий, плотная волокнистая ткань и гладкие миоциты. Оксифильные трабекулы состоят из коллагеновых волокон и гладких миоцитов. Между трабекулами находится пульпа селезенки с основой из ретикулярной ткани. Белая пульпа селезенки представлена лимфоидной тканью из лимфатических узелков (скопления лимфоцитов) и лимфатических периартериальных влагалищ (состав: ретикулярные клетки, лимфоциты, макрофаги, плазматические клетки), которые окружают артерии в области выхода из трабекулы. В короне лимфатических узелков определяются лимфоциты, макрофаги, ретикулярные клетки, а в герминативном центре — лимфоциты на разных стадиях пролиферации и дифференцировки, плазматические клетки, макрофаги. Вокруг периартериальной и реактивной областей располагается мантийная зона (скопление В-клеток памяти и проплазмоцитов). Маргинальная зона узелков окружена синусоидальными капиллярами. Основные компоненты красной пульпы — ретикулярная ткань с клетками крови (эритроцитами, зернистыми и незернистыми лейкоцитами) и синусоиды, анастомозирующие между собой. 

Интерстициальная ткань определяется, не инфильтрирована, разрастания нет. Сосуды представлены трабекулярными венами, трабекулярными артериями, пульпарными артериями (вокруг которых скапливаются Т-лимфоциты), центральными артериями, находящимися эксцентрично на периферии фолликула, венозными синусами и капиллярами. Просвет одинаков в видимом поле, стенки не изменены, клеточной инфильтрации и признаков транссудации нет.

Микроскопическое исследование почек крыс экспериментальной группы также определило типичное строение органа: на малом увеличении определяется неутолщенная фиброзная капсула, сохранена граница между корковым и мозговым веществом. Корковое вещество включает в себя почечные тельца, аппарат извитых канальцев, радиально сводящихся к мозговому веществу, состоящих из прямых канальцев. Патологических образований и изменений выявлено не было.

На большом увеличении почечное тельце представлено клубочком капилляров, неутолщенной наружной капсулой, париетальный и висцеральный листки которой плотно прилегают друг к другу, пространство Боуменовой капсулы практически не выявляется. На гистологическом срезе определяются проксимальные извитые канальцы, однослойный кубический эпителий которых имеет оксифильную окраску, базофильные ядра. Просветы этих канальцев неширокие, свободные. Дистальные канальцы с широким просветом выстланы призматическим эпителием с опалесцирующей цитоплазмой, кайма не определяется, в окружении выявляется плотное пятно. Мозговое вещество представлено прямыми канальцами и собирательными трубочками. Прямые канальцы с узким просветом представлены однослойным кубическим каемчатым эпителием. Собирательные трубочки со свободными просветами состоят из однослойного кубического эпителия более бледной оксифильной окраски, ядра расположены ближе к просвету. Патологических образований и изменений выявлено не было.

Интерстициальная ткань определяется, не инфильтрирована, занимает межуточное положение от паренхимы, разрастания нет. Сосуды представлены подкапсулярными венами, приносящими артериями, междольковыми артериями и венами в корковом веществе и дуговыми артериями и венами в мозговом. Просвет одинаков в видимом поле, стенки не изменены, клеточной инфильтрации и признаков транссудации нет.

Дескриптивная оценка морфометрического критерия стромально-паренхиматозного соотношения в контрольной группе животных в сравнении с экспериментальной не показала статистически значимых изменений. Исследуемый показатель при изучении гистологического препарата надпочечников показал следующие значения: контроль — 1/21,21 (1/21,27; 1/23,13), эксперимент — 1/19,53 (1/17,85; 1/20,56); при подсчете на микроскопических срезах печени крыс величина рассматриваемого критерия в контрольной группе была равна 1/33,85 (1/31,69; 1/39,05), а в экспериментальной — 1/33,20 (1/33,14; 1/34,67); значение исследуемого соотношения гистопрепаратов селезенки в группе контроля соответствовало 1/24,36 (1/20,58; 1/25,61), а группе эксперимента — 1/26,52 (1/24,39; 1/28,86); в свою очередь, морфометрический показатель гистологических срезов почек характеризовался следующими данными: контроль — 1/21,87 (1/17,33; 1/28,50), эксперимент — 1/23,65 (1/21,78; 1/26,93). 

Подсчет лейкоцитарной формулы выявил следующие характеристики: до имплантации лимфоциты составили 78,00 (75,50; 80,50); моноциты — 6,00 (6,00; 7,50); количество сегментоядерных нейтрофилов — 12,00 (9,00; 13,50), что превышало количество палочокоядерных форм — 5,00 (3,00; 5,00); эозинофилы — 0,00 (0,00; 0,50) и базофилы — 1,00 (0,00; 1,00) были представлены в сравнительно небольшом количестве.

После имплантации на 40-е сутки в лейкоцитарной формуле крыс отмечалось незначительно повышенное количество лимфоцитов до 81,00 (77,50; 83,00), незначимое снижение количества сегментоядерных нейтрофилов — 10,00 (8,50; 11,50), уменьшение процентного содержания моноцитов — 5,00 (3,50; 6,00) (p < 0,05).

Значения показателей гранулоцитов и агранулоцитов крови лабораторных животных до и после эксперминета отражены в табл. 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Регистрация макроскопических изменений возможна при резко выраженном влиянии камеры и ее продуктов деградации, что свидетельствует о быстроразвивающихся процессах адаптации к инородному телу [21]. Результаты макроскопической оценки (внешний вид, срез и капсула) органов-мишеней белых крыс, в которых возможно накопление продуктов деградации поликапролактона, в группе эксперимента не выявили видимых патологических изменений, что может свидетельствовать об отсутствии влияния ДК из PCL на структуру макропрепаратов.

Данные микроскопического анализа (характер строения и окраски основных гистологических структур, отсутствие патологических регенеративных и дегенеративных форм клеток) не позволили выявить изменения в гистоархитектонике органов. Гистопрепараты экспериментальных групп лабораторных животных характеризуются типичным строением без возникновения альтеративных, дистрофических и некротических изменений.

Схемы возможных патогенетических изменений исследуемых органов (почек, печени, селезенки) вследствие имплантации ДК (PCL) крысам на бедренный СНП представлены на рис. 5 [21–24], 6 [21, 25].

Так, предполагаемый патогенез надпочечниковой ткани характеризуется септическим или токсическим (биодеградация PCL) повреждением такни железы, патологическим увеличением выработки кортизола, увеличением выброса альдостерона в кровь независимо от ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, что происходит из-за гиперплазии надпочечниковой ткани и, в конечном счете, приводит к гипернатриемии, гипокалиемии, гипертонии и метаболическому ацидозу [21, 26–27].

Подсчет стромально-паренхиматозного соотношения исследуемых органов крыс линии Wistar при сравнении групп контроля и эксперимента верифицировал отсутствие увеличения соединительнотканного компонента и гипо- или гиперплазии клеточных структур основной ткани гистопрепаратов. Данный критерий является проспективным при оценке динамических состояний изменения морфологической структуры органа, причем его удобство заключается в универсальной характеристике состояния клеточного пула тканей, что значимо при цирротических изменениях печени, гипер- и гипофункции как надпочечников, так и селезенки, а также при оценке дистрофических и атрофических изменений почечных канальцев и телец [28].

Увеличение количества двуядерных гепатоцитов верифицирует повреждение основной ткани печени, что указывает на связь степени токсичности материала с возможностями самообновления гепатоцитов в условиях будущей более длительной имплантации [28]. Полученные данные же указывают на отсутствие активных процессов регенеративной пролиферации клеток в паренхиме органа.

Системная воспалительная реакция оценивается путем определения содержания цитокинов [29] и лейкограммы перифеческой крови. Картина крови до имплантации и на 40-е сутки после нее характеризуется перераспределением функционально неравнозначных клеток в пределах физиологических норм [30].

Таким образом, исключается возможность возникновения системного вялотекущего хронического воспаления при имплантации ДК из PCL на бедренный СНП, что подтверждает использование подобных конструкций в областях реконструктивной хирургии (артериовенозные шунты, лоскуты) [16], онкологии (моделирование опухолевого процесса) [19] и эндокринологии (модель поджелудочной железы).

При этом стоит отметить, что дальнейшее исследование PCL необходимо проводить на молекулярном уровне с изучением влияния физических параметров камеры (размер пор, упругость (в том числе продольная)) на взаимодействие с микроокружением камеры (пролиферация фибробластов, рост эндотелиоцитов, возможный гиалиноз или кальциноз артерий как внутри камеры, так и на протяжении сосудов) и процесс деградации материала: скорость, характер получаемых продуктов и основные пути обезвреживания и выведения из организма. Для большей чистоты эксперимента дальнейшая работа должна проводиться на животных SPF-статуса с более длительными сроками имплантации для уточнения возможного ремоделирования сосудов с учетом динамики кровотока, определения наиболее функциональных vasa vasorum, а также развития отсроченных постимплантационных осложнений (тромбообразование).

ВЫВОДЫ

По данным настоящего исследования, диффузионная камера из поликапролактона, поставленная на бедренный СНП, не оказала патологических влияний как на место имплантации, так и на органы-мишени. Макро- и микроскопическая структура органов лабораторных животных экспериментальной группы определялась нормальным строением без выявления патологических изменений: не обнаружено атипии, признаков воспаления или прогрессирующих дегенеративных изменений тканей. Подсчет стромально-паренхиматозного соотношения показал отсутствие патологических изменений регенеративного характера: признаков фиброза, избыточного ангиогенеза или экспансивного роста паренхимы.

Показатели лейкоцитарной формулы крови до эксперимента и на 40-е сутки после него свидетельствуют об отсутствии патологических системных изменений в организме лабораторных животных при имплантации диффузионных камер на бедренный СНП. Колебания при таких сроках не показали статистических отклонений от доимплантационного периода, что свидетельствует о достаточной изоляции материала от внутренних сред организма.

Применение ДК (PCL) можно считать безопасной инженерной конструкцией при имплантации на крупные сосуды, в частности, бедренный СНП с позиции ее биосовместимости. Важно отметить, что изучение влияния продуктов биодеградации поликапролактона до сих пор остается актуальным при выборе предмета научных исследований, что требует дальнейшего изучения системного влияния PCL при более длительных сроках биоинтеграции.