Одним из важных условий проведения витреоретинальной хирургии является достаточная интраоперационная визуализация внутриглазных структур, что достигается за счет внешних источников внутриглазного освещения [1–3]. Разработка новых источников освещения для эндоиллюминации (ЭИ) также связана с переходом к малым доступам хирургии (25 G, 27 G, 29 G), однако усиление мощности светового потока, сопровождающего этот переход, неизбежно повышает риск фототоксического повреждения сетчатки и пигментного эпителия  [4, 5].

Выделяют следующие основные параметры, влияющие на фототоксичность эндовитреальных источников освещения: тип осветителя, показатель афакической опасности, яркость освещения, числовая апертура волокна (конус освещения), продолжительность светового воздействия, рабочее расстояние (между эндоосветителем и сетчаткой) и зона сетчатки, на которую воздействует световой поток [2, 3].

Благодаря многолетним экспериментальным исследованиям были раскрыты ключевые патогенетические звенья фотоповреждения структур и тканей глаза. За счет большой концентрации в фоторецепторах фотосенсибилизаторов, высокого парциального давления кислорода в сетчатке и содержания полиненасыщенных жирных кислот деструктивные фотохимические реакции могут развиваться в результате усиления оксидативных процессов [6–12]. Показано, что в клетках ретинального пигментного эпителия содержатся липофусциновые гранулы, содержащие  бисретиноиды-флуорофоры, которые при воздействии  света начинают вырабатывать активные формы кислорода, приводящие в дальнейшем к образованию окисленных продуктов  [13].

В первую очередь, фотосенсибилизаторы, такие как ретиналь и его метаболиты, представляют потенциальную фототоксическую опасность. Под воздействием света они способны генерировать синглетный кислород и супероксидные радикалы [14]. К другим патогенетическим факторам относится высокое напряжение кислорода, которое на уровне верхушек наружных сегментов фоторецепторов достигает 100 мм рт. ст. И, наконец, следует отметить, что окислительная деструкция меланосом может приводить к образованию токсичных альдегидов и кетонов, а также модификации белков [15].

Таким образом, согласно данным публикаций, в ходе витреоретинальных вмешательств возникают все потенциально опасные условия для фотоповреждения тканей и структур глаза, особенно комплекса фоторецептор – пигментный эпителий.

Целью работы было оценить влияние эндоиллюминации различной интенсивности и продолжительности на изменение оксидативных процессов в крови кроликов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводили на 16 кроликах (самцах), возрастом от 6 до 9 месяцев и весом 2–3 кг на кафедре офтальмологии и в Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета. Животные были приобретены в специализированном питомнике (ИП Тулупов; Россия). Кролики находились в контролируемых условиях, обеспечивающих оптимальную температуру, влажность и освещенность, и получали сбалансированный рацион, включающий специализированные корма и свежую воду. За полчаса до операции животным внутримышечно вводили 2%-й раствор ксилазина (Alfasan International B.V.; Нидерланды) в дозировке 1 мг на 1 кг массы тела, чтобы обеспечить выраженный седативный эффект. Для общей анестезии внутримышечно использовали «Золетил 100» (Вирбак, Франция) в дозе 7,5 мг на 1 кг массы тела кроликов. Для расширения зрачка за 15–20 мин до процедуры в конъюнктивальный мешок инстиллировали капли «Мидримакс» (Sentiss Pharma; Индия). Местную анестезию проводили с использованием 0,5%-го раствора проксиметакаина гидрохлорида.

В качестве образцов для исследования отбирали кровь из ушной вены (УВ) кролика. Такой подход обусловлен тем, что ранее, на пилотном этапе исследования, мы производили отбор образцов из центральной вены сетчатки (ЦВС) канюлей MedOne диаметром 27–40 G. Однако непосредственный забор крови из ЦВС в наших экспериментах имел серьезные методические ограничения, поскольку при этом происходит дополнительное нарушение внутриглазных сред. Анализ параметров биохемилюминесценции (БХЛ), произведенный на образцах из ЦВС и УВ кролика, статистически значимых различий не выявил, что позволило использовать в качестве образцов для анализа именно кровь из УВ. 

Для моделирования эндовитреального воздействия использовали порт 25 G, установленный в проекции плоской части цилиарного тела. В качестве осветителя применяли ксеноновый источник, интегрированный в офтальмологическую микрохирургическую систему «Оптимед Профи» (ЗАО «Оптимедсервис»; Россия). Эндоосветитель вводили через порт, при этом его кончик располагали на расстоянии 8 мм (консус освещения 30°) от сетчатки в направлении макулярной зоны.

Экспериментальные животные были разделены на две группы.

Группа 1: воздействие света с 8 кд/м² (50%) в течение 30 мин (4 кролика, 4 глаза) и 60 мин (4 кролика, 4 глаза).

Группа 2: воздействие света с 16 кд/м² (100%) в течение 30 мин (4 кролика, 4 глаза) и 60 мин (4 кролика, 4 глаза).

По завершении световой экспозиции проводили повторный отбор крови из ушной вены.

Для оценки влияния эндоиллюминации при витрэктомии на оксидативные процессы использовали метод регистрации БХЛ. В основе применения БХЛ в витреоретинальной хирургии для оценки фотоповреждений тканей глаза лежит то, что хемилюминесценция отражает излучение света от электронно-возбужденных состояний атомов и молекул, возникающих при химических реакциях. При этом свободнорадикальные процессы являются единственными источниками биохемилюминесценции [16].

БХЛ крови регистрировали на приборе «ХЛМ003» (Уфимский государственный авиационный технический университет, Россия), измеряя светосумму S и максимальную амплитуду медленной вспышки Imax в единицах квант/с в течение 3 мин [17]. БХЛ цельной крови использовали как индикатор уровня оксидативных процессов генерации активных форм кислорода клетками крови, в первую очередь нейтрофилами. Для регистрации люминол-зависимой биохемилюминесценции (ЛЗБХЛ) использовали люминол (10^–4 М) в растворе на основе диметилсульфоксида (DMSO). 0,1 мл крови смешивали с 2 мл раствора люминола, после чего смесь помещали в камеру прибора при 37 °С. Кроме ЛЗБХЛ исследовали железоиндуцированную биохемилюминесценцию (ЖБХЛ) сыворотки крови, чтобы определить уровень оксидативных процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Для получения сыворотки кровь центрифугировали, затем разводили сыворотку фосфатным буфером. Свечение индуцировали добавлением раствора FeSO₄ × 7H₂O, интенсивность которого отражает уровень ПОЛ.

Данные анализировали с использованием непараметрического U-теста Манна–Уитни. Результаты считали достоверными при p ≤ 0,05 и представляли в виде медианы (Me) и межквартильного интервала (IQR).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

После 30-минутной экспозиции световых источников с интенсивностью 50% (8 кд/м²; группа 1) наблюдалось значительное увеличение уровня биохемилюминесценции с люминолом. В ходе эксперимента значение ЛЗБХЛ возросло с исходного уровня 26,4 × 10⁵ квант/с до 38,2 × 10⁵ квант/с. Это увеличение соответствует росту интенсивности почти на 50%, что свидетельствует о заметном влиянии излучения умеренной интенсивности на данный показатель. При воздействии излучением с увеличенной интенсивностью 100% (16 кд/м²; группа 2), уровень ЛЗБХЛ показал еще более выраженное усиление, достигнув значения 62,2 × 10⁵ квант/с. Такое увеличение эквивалентно росту интенсивности почти в 2,5 раза по сравнению с исходным значением. Полученные данные показывают, что более интенсивное излучение оказывает более сильное влияние на уровень ЛЗБХЛ. Это подтверждает зависимость эффекта от интенсивности применяемого излучения. Для оценки более продолжительной ЭИ мы провели соответствующие измерения ЛЗБХЛ и при 60-минутной экспозиции. Данные представлены в табл. 1.

Согласно данным таблицы, ЭИ приводит к усилению ЛЗБХЛ, что отражает увеличение генерации свободных радикалов клетками крови. Увеличение времени экспозиции вызывает усиление параметров ЛЗБХЛ, что свидетельствует об интенсификации оксидативных процессов в крови. После длительности воздействия в 60 мин значение ЛЗБХЛ увеличилось в 3 раза: значение контроля составляло 26,4 × 10⁵ квант/с, а значение после излучения — 79,1 × 10⁵ квант/с. Почти в 7 раз вырос показатель ЛЗБХЛ при увеличении интенсивности до 100% (16 кд/м²).

При регистрации ЖБХЛ образцов, подвергнутых действию ЭИ, были выявлены следующие закономерности: получасовая экспозиция источников ЭИ вызывала значительное снижение параметров ЖБХЛ: в первой группе в 1,2 раза в сравнении с контролем. Увеличение интенсивности до полного значения в 100% (16 кд/м²; группа 2) приводило к двукратному снижению параметров светимости. Контроль — 408,2 × 10⁵ квант/с, после воздействия — 206,1 × 10⁵ квант/с.

При увеличении длительности воздействия до 60 мин снижение параметров ЖБХЛ стало еще более заметным. При 50-процентной интенсивности (8 кд/м²; группа 1) ЖБХЛ снижался до 204,0 × 10⁵ квант/с, что меньше в 2 раза. При 100-процентной интенсивности (16 кд/м²; группа 2) ЖБХЛ упала до значения 137,1×10⁵ квант/с, что меньше в 3 раза. Эти результаты демонстрируют значительное влияние длительности и интенсивности излучения на биохемилюминесценцию сыворотки крови (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты нашего исследования показали, что изменения оксидативных процессов в крови имеют явный дозозависимый характер, обусловливаемый  интенсивностью и длительностью эндоиллюминации. При увеличении интенсивности и длительности ЭИ было отмечено усиление ЛЗБХЛ исследуемых образцов, что свидетельствует об усилении оксидативных процессов в клетках крови. Очевидно, первоначально активируются кислород-зависимые механизмы клеток, реализующие генерацию активных форм кислорода. 

Полученные результаты соответствуют общим выводам о том, что под действием света запускаются окислительные процессы в молекулярных структурах глаза, которые приводят к образованию продуктов окислительной деградации [13, 18].

Выявленные пониженные показатели ЖБХЛ отражают повышение антиоксидантной активности и снижение уровня липопероксидации. Это может быть связано с тем, что усиление оксидативных процессов вызывает активацию антиоксидантных ферментных систем. В отдельных исследованиях показано, что ингибирующее действие в отношении продуктов окислительной фотодеструкции связано с антиоксидантной активностью [19]. Увеличение антиоксидантной активности в сыворотке крови, вероятно, можно объяснить компенсаторной перестройкой антиоксидантных систем, вызванной накоплением свободных радикалов вследствие эндоиллюминации. Этот процесс можно рассматривать как адаптивный механизм, позволяющий организму нейтрализовать избыток свободных радикалов и поддерживать клеточный гомеостаз.

Таким образом, последствия воздействия ЭИ приводят к сложному адаптивному ответу системы крови, который направлен на уменьшение повреждения от свободнорадикального окисления и поддержание жизнеспособности клеток. В исследованиях по  механизмам светового повреждения глаза показано, что продукты окислительной деградации способны диффундировать в цитоплазму клеток и вызывать токсические эффекты уже тогда, когда отсутствует действие света [13]. Время и интенсивность ЭИ, как показало настоящее исследование, выступают важным фактором в изменении параметров ЛЗБХЛ и ЖБХЛ. Чем длительнее и интенсивнее  ЭИ, тем сильнее изменения в виде увеличения ЛЗБХЛ и снижения ЖБХЛ.

ВЫВОДЫ

На основании представленных данных, можно заключить, что продолжительность и интенсивность светового воздействия от источников эндоиллюминации приводят к значительным изменениям в оксидативных процессах крови. Наиболее выраженные изменения в окислительных процессах выявлены после 60-минутного воздействия 100%-й интенсивности эндоиллюминации. Дальнейшие морфологические и электрофизиологические исследования помогут определить вклад и временной характер обнаруженных изменений оксидативных процессов в развитие фототоксических рисков источников эндоиллюминации.