Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) — один из ведущих бактериальных патогенов, ответственный за широкий спектр инфекций: от поверхностных кожных воспалений до тяжелых, жизнеугрожающих состояний, таких как пневмония, сепсис и эндокардит [1]. Особое внимание к микроорганизму уделяют вследствие его устойчивости к широкому спектру антибиотиков, причем наибольшую значимость имеют метициллин-резистентные штаммы S. aureus (MRSA, от англ. methicillin-resistant Staphylococcus aureus).

Лечение стафилококковых инфекций осложнено не только антибиотикорезистентностью, но и обилием факторов вирулентности, один из которых — способность стафилококков образовывать биопленку. Подобно биопленкам других бактерий, биопленка S. aureus состоит из двух основных компонентов: воды (около 97%) и органических веществ, представленных внеклеточными полимерами и колониями микроорганизмов. Внеклеточные полимеры составляют 50–90% от всей органической массы биопленки и включают комплекс различных соединений, таких как внеклеточная ДНК (внДНК), белки и полисахариды. Оставшаяся часть биопленки представлена бактериальными клетками [2, 3].

Биопленка обеспечивает прочное прикрепление бактерий к различным поверхностям, включая ткани организма и медицинские изделия [2]. Кроме того, она существенно повышает устойчивость бактерий к факторам иммунной системы и антимикробным препаратам: минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков, необходимые для разрушения бактерий в биопленках, могут в 1000 раз превышать концентрации, достаточные для уничтожения планктонных клеток [3, 4].

Бактериофаги все чаще рассматривают как перспективное средство для лечения бактериальных инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами. В медицинской практике применяют исключительно вирулентные бактериофаги, которые реализуют только литический жизненный цикл. К числу таких фагов, способных инфицировать и разрушать клетки S. aureus, относятся представители семейств Herelleviridae и Rountreeviridae. Они демонстрируют высокую эффективность как в in vitro экспериментах, так и в in vivo моделях, а также уже успешно применяются в терапии, что обеспечивает снижение бактериальной нагрузки и улучшение клинических исходов [5].

В этом контексте особый интерес вызывают исследования, направленные на оценку действия фагов на биопленку. Показано, что некоторые фаги S. aureus могут эффективно снижать количество биомассы биопленки [6, 7]. Тем не менее ряд исследований указывает на возможность стимуляции образования биопленки под воздействием фагов, что может быть связано с особенностями их взаимодействия с бактериальными клетками [8, 9]. Подобные эффекты, вероятно, зависят от ряда факторов: непосредственно от бактериального штамма, используемого бактериофага и их концентраций, от физиологического состояния клеток, а также от морфологических и структурных характеристик самой биопленки.

Цель настоящей работы — исследовать влияние литических бактериофагов vB_SauM-515A1 (семейство Herelleviridae) и vB_SauP-436A (семейство Rountreeviridae) на биопленки, сформированные клиническими изолятами S. aureus.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и бактериофаги

В работе использовали 20 наиболее различающихся по происхождению и локусу выделения штаммов S. aureus из коллекции ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю. М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства». Штаммы были собраны в период с 2015 по 2020 г. из стационаров различных регионов России.

Бактериальную культуру выращивали в жидкой среде LB (от англ. lysogeny broth) (Oxoid, Великобритания) или на LB-агаре (Oxoid) в модификации Миллера при 37 °C в течение 18 ч. Клетки, выращенные в жидкой среде, использовали для получения ночных культур, которые затем применяли в качестве инокулята как в экспериментах по определению чувствительности к антибиотикам, так и во всех исследованиях, связанных с оценкой образования биопленок и влиянием на них антибактериальных агентов. Культивирование бактерий на LB-агаре проводили для поддержания бактериальной культуры, а также для подсчета клеток в экспериментах по оценке влияния бактериофагов на сформированные биопленки.

Чувствительность к оксациллину (бета-лактамный антибиотик), ванкомицину (гликопептид), гентамицину (аминогликозид), тетрациклину (тетрациклиновый антибиотик), левофлоксацину (фторхинолон) и эритромицину (макролид) (все препараты производства Sigma-Aldrich, США) определяли методом последовательных разведений в соответствии с рекомендациями EUCAST (v.14.0) [10]. Штаммы с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) определяли как устойчивые к трем и более антибиотикам различных классов.

В работе использовали литические бактериофаги vB_SauM-515A1 (род Kayvirus семейства Herelleviridae) и vB_SauP-436A (род Rosenblumvirus семейства Rountreeviridae), которые применяли в виде стерильных фильтратов фаголизатов в среде LB. Бактериофаги ранее были выделены из коммерческого комплексного фагового препарата «Бактериофаг стафилококковый» серии P332 («Микроген», Россия) на штаммах S. aureus SA515 (ST8 (ST, от англ. sequence type)) и SA436 (ST1) и детально охарактеризованы [11]. Выращивание фагов проводили на соответствующих штаммах-хозяевах.

Молекулярно-генетическая характеристика бактериальных штаммов

Выделение ДНК проводили с использованием набора ДНКэкспресс (Литех, Россия) в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Пробы ДНК хранили при –20 °C.

Штаммы типировали методом мультилокусного секвенирования-типирования (МЛСТ) с использованием стандартной схемы [12]. Детекцию генов icaA, icaB, icaC и icaD, ответственных за образование биопленки, выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ранее описанных праймеров [13]. Реакционная смесь (25 мкл) для ПЦР содержала 66 мМ Tris-HCl (рН = 9), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 2,5 мМ MgCl₂, 250 мкМ каждого dNTP, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы («Литех», Россия) и по 10 пмоль соответствующих праймеров. Реакцию амплификации выполняли с использованием прибора DNA Engine Tetrad 2 (MJ Research, США) согласно ранее предложенным режимам [13]. Продукты амплификации анализировали методом горизонтального гель-электрофореза в 2% агарозном геле с визуализацией бромистым этидием.

Оценка биопленкообразования

Оценку проводили согласно ранее описанной методике [14] с некоторыми модификациями. Для этого суспензию бактериальных клеток в экспоненциальной фазе роста (оптическая плотность (ОП) при 620 нм — 0,12) инокулировали в лунки 96-луночного плоскодонного вентилируемого планшета без покрытия (Thermo Scientific, США), содержащего TSBg (tryptic soy broth с добавлением 1% глюкозы) (Himedia, Индия) до конечной концентрации 10⁴ клеток на лунку и инкубировали при 37 °C в течение 24 ч без встряхивания. Конечный объем в каждой лунке составил 200 мкл. В качестве отрицательного контроля использовали стерильную среду. После инкубации лунки трижды аккуратно промывали стерильным фосфатным буфером (PBS, pH = 7,4) для удаления планктонных клеток, затем окрашивали 0,1% водно-спиртовым раствором кристаллического фиолетового (КФ) (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации краситель промывали стерильным PBS трижды. Для последующего анализа связанный краситель в каждой лунке элюировали добавлением 200 мкл 96%-го этанола и измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре Microplate Reader Flex-A (Allsheng, China) при 570 нм. Все эксперименты были выполнены в трех биологических повторах.

Определение способности бактерии к биопленкообразованию проводили согласно ранее предложенным критериям: ОП ≤ ОПс — штамм не образует биопленку; ОПс < ОП ≤ 2 × ОПс — штамм слабо образует биопленку; 2 × ОПс < ОП ≤ 4 × ОПс — штамм является умеренным продуцентом биопленки; 4 × ОПс < ОП — штамм сильно продуцирует биопленку, где ОПс — средняя ОП отрицательного контроля + 3 × СО (стандартное отклонение). В качестве отрицательного контроля использовали стерильную среду [15].

Чувствительность планктонных форм штаммов к бактериофагам

Чувствительность штаммов к бактериофагам определяли в ходе оценки эффективности посева (EOP, от англ. efficiency of plating), как было описано ранее [11]. EOP представляет собой отношение титра бактериофага на тестируемом штамме к титру бактериофага на штамме-хозяине (S. aureus SA515 для фага vB_SauM-515A1; S. aureus SA436 для фага vB_SauP-436A), выраженное в процентах. Титр бактериофага на исследуемом штамме определяли методом титрования по Грациа, как описано ранее [16]. Для этого аликвоты (5 мкл) десятикратных последовательных разведений каждого препарата бактериофага (сток 2 × 10⁹ бляшкообразующих единиц/мл, или БОЕ/мл) наносили на поверхность чашек с полужидким LB-агаром (0,6% агара), содержащих 0,1 мл ночной культуры тестируемого штамма (10⁶ колониеобразующих единиц/мл, или КОЕ/мл), и инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 ч. Концентрацию фаговых частиц в БОЕ/мл оценивали для каждого тестируемого штамма. Оценку эффективности посева проводили в трех повторностях.

Оценка влияния бактериофагов на сформированные биопленки

Для экспериментов использовали 24-часовые биопленки, сформированные и промытые в соответствии с описанным выше способом. После промывки в лунку добавляли TSBg и фаговый лизат до конечной концентрации 10⁸ БОЕ/мл, объем каждой лунки составил 200 мкл. В контрольные образцы вместо фагового лизата вносили стерильный PBS. Инкубацию проводили в течение 24 ч при 37 °C. Далее проводили окрашивание КФ, как описано выше, с последующим измерением ОП при 570 нм. Все эксперименты выполняли в трех биологических повторах.

В предварительных экспериментах определяли количество клеток в биопленке, добавляя 200 мкл стерильного PBS к промытой биопленке и разрушая ее с помощью активного пипетирования. Серийные разведения суспензии клеток высевали на LB-агар. После 24-часовой инкубации при 37 °C подсчитывали количество колоний.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism версии 8.0.1 (GraphPad Software Inc., США) на основании данных t-теста. В ходе анализа сравнивали значения оптических плотностей, полученных через 24 ч инкубации биопленок, обработанных и необработанных бактериофагом. Различия считали значимыми при p < 0,05. Для подтверждения нормального распределения данных использовали метод Шапиро–Уилка, данные в выборках считали близкими к нормальному распределению при p > 0,05.

Для выявления достоверных корреляций по двум номинальным признакам в небольших выборках использовали критерий Фишера. Корреляции считали достоверными при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика штаммов и их способности к биопленкообразованию

Согласно результатам МЛСТ, штаммы коллекции относились к восьми сиквенс-типам, наиболее представленным из которых был ST8 (4/20, 20%) (таблица). На ST1, ST121, ST5 и ST25 приходилось по три штамма (по 15%). По чувствительности к антибиотикам значительная часть штаммов относилась к MRSA (9/20, 45%). Кроме того, семь штаммов (35%) характеризовались МЛУ.

Все проанализированные штаммы обладали способностью к биопленкообразованию, причем более половины являлись ее сильными продуцентами (13/20, 65%). В оставшихся случаях (7/20, 35%) штаммы умеренно образовывали биопленку. Подсчет КОЕ показал, что количество клеток в составе 24-часовых биопленок достигает 10⁸ КОЕ/мл для всех исследуемых штаммов. Результаты амплификации продемонстрировали, что все изоляты содержали полный набор генов оперона icaADBC.

Воздействие бактериофагов различных таксономических групп на планктонные клетки и биопленки S. aureus

По результатам оценки действия бактериофагов vB_SauM515A1 и vB_SauP-436A на планктонные клетки штаммов коллекции было установлено, что 14 (70%) штаммов проявляли чувствительность к фагу vB_SauM-515A1, тогда как к фагу vB_SauP-436A чувствительны были 10 штаммов (50%). Три штамма коллекции (15%) оказались устойчивыми к обоим фагам. Эффективность посева фага vB_SauM-515A1 на чувствительных штаммах варьировалась от 90 до 500%, а для фага vB_SauP-436A — от 75 до 400%.

Оценку воздействия бактериофагов на сформированную биопленку проводили только для штаммов, чувствительных к соответствующему бактериофагу по данным экспериментов на планктонных клетках. Обработку биопленок проводили бактериофагом в титре 10⁸ БОЕ/мл, что на основании подсчета количества КОЕ в необработанных биопленках соответствует значению множественности инфекции 1 (MOI, от англ. multiplicity of infection).

Согласно результатам экспериментов (рисунок), в большинстве случаев (9/14, 64,3%) обработка бактериофагом vB_SauM-515A1 в течение 24 ч не вызывала снижения биомассы биопленок, а, наоборот, стимулировала ее образование. Для оставшихся пяти штаммов (5/14, 35,7%) воздействие бактериофага vB_SauM515A1 не оказывало достоверного влияния на биопленку. Воздействие бактериофага vB_SauP-436A, напротив, достоверно снижало биомассу биопленки для четырех штаммов (4/10, 40%). На биопленки, сформированные остальными штаммами, данный бактериофаг не влиял.

Следует отметить, что по результатам статистического анализа не было выявлено значимых корреляций между принадлежностью штамма к MRSA или какомулибо сиквенс-типу и способностью бактериофагов стимулировать (в случае vB_SauM-515A1) либо разрушать (в случае vB_SauP-436A) биопленку. Эти эффекты также не зависели от исходной способности штаммов к биопленкообразованию.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В рамках данного исследования рассматривали штаммы, выделенные из разнородного клинического материала и относящиеся к эпидемиологически значимым сиквенстипам (таблица). Среди них наибольшую представленность имел ST8 — один из наиболее распространенных сиквенстипов на территории России и во всем мире среди госпитальных штаммов [17, 18]. Штаммы данного сиквенстипа включают пандемические клоны, например, USA300, вызывающие многочисленные вспышки инфекции и часто относящиеся к MRSA [19]. Помимо ST8 были выявлены штаммы ST1, ST5 и ST121, которые, согласно литературным данным, характеризуются устойчивостью к антибиотикам и обладают способностью вызывать серьезные инфекции [20–22].

Полученные результаты продемонстрировали способность всех исследуемых образцов, независимо от происхождения и принадлежности к сиквенстипу, образовывать биопленки. При этом все штаммы характеризовались наличием в геноме icaADBCоперона, ответственного за биосинтез полисахаридного межклеточного адгезина (PIA, от англ. polysaccharide intercellular adhesin) — основного и наиболее изученного компонента матрикса биопленок клинических штаммов S. aureus [23, 24]. Следует также отметить, что большинство штаммов оказались сильными продуцентами биопленки. В сочетании с антибиотикорезистентностью это еще раз подчеркивает серьезность проблемы терапии инфекций, вызванных ими.

Для оценки эффективности бактериофагов использовали представителей семейств Herelleviridae и Rountreeviridae. Выбор фагов был обусловлен их различиями в морфологических (миовирусы и подовирусы), микробиологических (спектр хозяев, параметры инфекции на основании кривой единичного цикла роста) и генетических (размер генома и количество кодируемых генов) характеристиках [11]. Согласно полученным результатам, vB_SauM-515A1 (род Kayvirus, семейство Herelleviridae) показал большую эффективность против планктонных клеток, в сравнении с vB_SauP-436A (род Rosenblumvirus, семейство Rountreeviridae), что согласуется с ранее опубликованной информацией по этим бактериофагам [11]. Для других литических бактериофагов семейства Herelleviridae (ранее Myoviridae) также показано, что спектр их литической активности в зависимости от коллекции варьируется от 85,3 до 99,2%, в то время как для представителей семейства Rountreeviridae (ранее Podoviridae) этот показатель составляет 64–68% [11, 25, 26].

В случае биопленок было показано, что бактериофаг vB_SauM-515A1 стимулировал увеличение биомассы биопленки, тогда как фаг vB_SauP-436A способствовал снижению ее количества (рисунок). Ранее сообщалось о способности миовируса phiIPLA-RODI, относящегося к тому же роду, что и vB_SauM-515A1, стимулировать образование биопленок у S. aureus [9]. Авторы объясняют наблюдаемые результаты увеличением количества внДНК в матриксе, что, в свою очередь, связано с высокой литической активностью бактериофагов этого семейства. Увеличенное количество внДНК способствует структурной целостности и стабильности биопленки, а также модулирует образование амилоидных волокон, необходимых для поддержания архитектуры биопленки [27]. В другой работе исследователи показали, что использование фагов родов Kayvirus и Rosenblumvirus (отдельно и в комбинации) на начальных стадиях формирования или на зрелой биопленке не приводит к снижению ее количества [8]. Авторы наблюдали такой эффект при использовании фагов как при низких (0,1), так и при высоких (10) значениях MOI. При этом спустя 24 ч инкубации наблюдалось увеличение количества биопленки, за исключением случая обработки зрелой биопленки смесью фагов в MOI 10.

Стоит отметить, что в обсуждаемых работах авторы ограничились тестированием одного и двух бактериальных изолятов, что накладывает ограничение на полноценное сравнение результатов. Тем не менее имеющиеся данные указывают на тенденцию фагов рода Kayvirus к стимуляции биопленкообразования у штаммов S. aureus. В случае обработки биопленок бактериофагом рода Rosenblumvirus, согласно нашим данным, наблюдалось либо снижение количества биомассы, либо отсутствие значимого воздействия. Возможно, vB_SauP-436A вызывает менее активный лизис клеток и меньшее высвобождение внДНК, что препятствует стимуляции образования биопленок. В связи с этим перспективным подходом в борьбе с биопленками представляется комбинированное применение бактериофагов, как в виде коктейля из нескольких фагов, так и в сочетании с агентами, разрушающими матрикс, такими как деполимеразы [28].

Необходимо также отметить, что в настоящей работе оценку эффективности фагов проводили методом окраски кристаллическим фиолетовым биомассы биопленок, включающей матрикс и клетки (как живые, так и мертвые). Такой метод не позволяет оценить долю жизнеспособных клеток после обработки антибактериальными агентами, поэтому для более полного представления о влиянии фагов на биопленки необходимо проводить дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

Проведенное исследование подчеркивает сложность и неоднозначность влияния бактериофагов на биопленку S. aureus, особенно в случае клинических изолятов с высокой антибиотикорезистентностью. Несмотря на способность фагов vB_SauM-515A1 и vB_SauP-436A подавлять рост планктонных клеток, их эффективность против биопленок штаммов S. aureus оказалась низкой. Полученные результаты подчеркивают важность подбора фагов с учетом их специфических характеристик и показателей эффективности против биопленок, а также возможную необходимость комбинированных подходов, включающих бактериофаги и агенты, разрушающие матрикс биопленки. Вместе с тем, следует учитывать, что результаты данной работы получены в эксперименте in vitro с использованием ограниченного набора методов. Для трансляции полученных результатов в клиническую практику необходимы дальнейшие исследования, включая эксперименты на моделях in vivo, которые позволят более точно оценить эффективность и безопасность предложенных подходов в условиях, приближенных к реальным.