Воспалительные заболевания пародонта являются одними из наиболее распространенных заболеваний полости рта. Тяжелые формы пародонтита встречаются более чем у 700 млн человек в мире [1]. Хотя пародонтит считают многофакторным процессом, ведущая роль микроорганизмов в его развитии неоспорима. Современные метагеномные исследования показывают, что пародонтит не обусловлен присутствием нескольких специфических пародонтальных патогенов, а является результатом полимикробной синергии десятков видов микроорганизмов [2, 3]. Патогенетическая значимость многих представителей домена Bacteria до настоящего времени остается неясной. Кроме типичных парадонтопатогенов, к которым относят Porphyromonas gingivalis, Prevotella spp., Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Filifactor alocis, Peptostreptococcus spp. и др. [4–7], в ротовой полости обитает множество резидентных бактерий с неизученными свойствами. Особый интерес вызывает группа некультивируемых бактерий, а именно эпибионты, ведущие симбиотический образ жизни на поверхности других бактерий. Nanosynbacter lyticus — типичный пример эпибионтов бактерий полости рта, который является эписимбионтом пародонтопатогена Schaalia odontolytica (прежнее название — Actinomyces odontolyticus) [8]. На сегодняшний день N. lyticus — единственный вид из рода Nanosynbacter, присутствие которого в полости рта человека доказано корректными исследованиями. О патогенетической роли N. lyticus имеются весьма противоречивые сведения.  По одним данным, количество N. lyticus положительно коррелирует с воспалительными заболеваниями полости рта — периодонтитом, перикоронитом [9, 10]. Другие авторы обнаружили обратные результаты: увеличение количества N. lyticus сочеталось с уменьшением воспаления за счет угнетения бактерий-возбудителей [11].

Цель настоящей работы — определить взаимосвязь между присутствием бактерий N. lyticus и воспалительными заболеваниями пародонта.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие 47 человек (31 женщина и 16 мужчин). Критерии включения в исследование: лица обоих полов, возраст 18–45 лет; отсутствие предшествующего стоматологического лечения в течение не менее шести месяцев. Критерии исключения: прием антибиотиков и применение антисептиков полости рта в течение последних трех месяцев; беременность, послеродовой период; возраст младше 18 лет и старше 45 лет; наличие острых воспалительных заболеваний; обострение хронической общесоматической патологии, соматические заболевания в стадии декомпенсации; онкологические заболевания, отказ от участия в исследовании. Общие сведение о пациентах представлены в табл. 1. Все участники дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Клиническая часть исследования включала сбор жалоб, анамнеза и осмотр полости рта. Диагностику заболеваний твердых тканей зубов и тканей пародонта проводили по МКБ-10 (К05.31 — хронический пародонтит, К05.10 — хронический гингивит, К02.1 — кариес), а также на основании классификации заболеваний пародонта Стоматологической ассоциации России.

Среди обследованных хронический катаральный генерализованный гингивит (К05.10) был выявлен в 21,3% случаев, хронический генерализованный пародонтит легкой степени тяжести (К05.31) — в 8,5% случаев, хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести (К05.31) — в 17%, хронический генерализованный пародонтит тяжелой степени (К05.31) — в 17% случаев. Доля лиц без воспалительных заболеваний пародонта составила 36,2% среди всех обследованных.

Для лабораторного исследования были собраны образцы поддесневого содержимого из зубодесневой борозды или пародонтального кармана. Образцы транспортировали в лабораторию для выделения ДНК в охлажденном состоянии в течение 6 ч.

Перед выделением ДНК образцы инкубировали с раствором лизоцима (Sisce Research Laborataries; Индия), конечная концентрация 1 мг/мл, при 37 °C, 60 мин [12]. Выделение геномной ДНК из образцов проводили с использованием набора «SKYAmp Micro DNA» (SkyGene; Россия). Проверку качества выделения проводили с помощью набора «Equalbit 1x dsDNA HS Assay Kit» (Vazyme; Китай), с использованием флуориметра «Fluo-200» (Allsheng; Китай). 

Образцы выделенной ДНК анализировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Определяли наличие консервативных последовательностей ДНК, специфичных для родов Nanosynbacter, Schaalia, а также домена Bacteria c использованием трех пар праймеров и трех зондов в разных каналах флуоресценции (табл. 2).

«Nuclease-free Water» (New England BioLabs; США) использовали как отрицательный контроль. В качестве положительных контролей использовали: 1) искусственно синтезированную олиго-ДНК, идентичную участку 23S рРНК Nanosynbacter (ранее эту группу бактерий называли Saccharibacteria или TM7), построенную на основе последовательностей из базы данных GenBank [13]; 2) ДНК бактерий из рода Schaalia spp. (прежнее название — Actinomyces spp.); 3) смесь бактериальной ДНК из культур Staphylococcus aureus ATCC 29213; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Escherichia coli ATCC 25922.

Состав смеси для ПЦР: 10 мкл «БиоМастер HS-qPCR» (HS-Taq ДНК-полимераза, смесь dNTP, ПЦР-буфер, Mg²⁺ и стерильная вода) (Biolabmix; Россия); по 2 мкл каждого специфического праймера (5 мкМ), 1 мкл специфического зонда (5 мкМ), 5 мкл образца с концентрацией ДНК не менее 0,1 нг/мкл. Смесь для ПЦР готовили согласно инструкции фирмы-производителя. Протокол реакции: 5 мин активации при 95 °C, затем 35 циклов по 15 с при 94 °C, 15 с при 62 °C и 20 с при 72 °C. Реакцию проводили при помощи амплификатора «ДТпрайм» («ДНКтехнология»; Россия).

Для оценки количества ДНК каждого из исследуемых видов определяли значения пороговых циклов Cp. Далее при помощи статистических инструментов Microsoft Excel 2010 рассчитывали условные показатели, отражающие количественные соотношения между: 1) представителями Nanosynbacter и рода Schaalia (индекс NS) по значениям Cp; 2) бактериями рода Nanosynbacter и домена Bacteria (индекс NB)  по значениям Cp. Показатели NS и NB рассчитывали по формулам:

формула

Статистический анализ полученных результатов был выполнен с помощью программы IBM SPSS Statistics for Windows, version 27.0 (IBM Corp., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При исследовании 47 образцов не было обнаружено какихлибо корреляций индексов NS и NB с возрастом и полом пациентов. В 12 образцах из 47 (25,5%) специфичные для рода Schaalia нуклеотидные последовательности не были обнаружены. Все Schaalia-негативные образцы были получены от пациентов без признаков пародонтита тяжелой и средней степени тяжести, лишь один Schaaliaнегативный образец был получен от пациента с легкой степенью пародонтита. В 7 из 12 Schaalia-негативных образцов были обнаружены N. lyticus.

У значительной доли (11/27, 40,7%) пациентов без пародонтита Schaalia spp. не были обнаружены. Все пациенты (100%) со средней и тяжелой степенью пародонтита, а также 3 из 4 (75%) пациентов с легкой степенью пародонтита были носителями Schaalia spp.

Индекс NS, отражающий соотношение между представителями рода Nanosynbacter и Schaalia spp., был равен нулю в 8 образцах из 47 (17%); ни один из этих образов не был получен у пациентов с пародонтитом. Для всех Schaalia-позитивных образцов от пациентов с пародонтитом (К05.31) индекс NS был высоким: Ме = 0,89 (0,79; 0,93), что значительно больше (p < 0,05) по сравнению с другими Schaalia-позитивными образцами, для которых Ме = 0,63 (0,00; 0,73).

Из 10 образцов, полученных от пациентов с хроническим катаральным генерализованным гингивитом, три образца не содержали специфичных для рода Schaalia генетических маркеров и один образец не содержал Nanosynbacterспецифичных маркеров. Поэтому позитивной корреляции между значениями индекса NS и диагнозом «хронический катаральный генерализованный гингивит» (К05.10) не выявлено (p > 0,05).

Более интересные результаты были получены при исследовании индекса NB (см. рисунок). Индекс NB у пациентов, страдающих хроническим генерализованным пародонтитом (К05.31) (Ме = 0,83 (0,79; 0,85)), был достоверно выше (р < 0,05), чем у пациентов без пародонтита Ме = 0,67 (0,00; 0,81)). Образцы от пациентов с пародонтитом легкой степени тяжести демонстрировали значения индекса NB (Ме = 0,77 (0,38; 0,78)), которые существенно не отличались (р > 0,05) от значений NB в образцах от пациентов без пародонтита, но были значительно ниже (р < 0,05), чем показатели NB в образцах от пациентов c хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени тяжести (Ме 0,85 (0,81; 0,85) и Ме 0,84 (0,81; 0,88) соответственно). Показатели NB от пациентов с пародонтитом средней и тяжелой степеней тяжести достоверно не отличались (р > 0,05).

Достоверных корреляций индекса NB с другими группами пациентов (гингивит, пациенты без воспалительных заболеваний полости рта) не обнаружено.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Первое интересное наблюдение, возникающее при анализе результатов, касается несоответствия между присутствием в анализируемых образцах N. lyticus и бактерий Schaalia spp. Это доказывает, что S. odontolytica не является единственным хозяином для N. lyticus. Факт симбиоза N. lyticus с представителями других таксонов, включая Actinomyces oris, Fusobacterium nucleatum, был предсказан ранее [17–19].

Второй результат подтверждает негативное участие бактерий Schaalia spp. в патогенезе среднетяжелых и тяжелых форм пародонтита. Действительно, 100% пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени тяжести (К05.31) были носителями Schaalia spp., тогда как значительная доля (40,7%) пациентов без пародонтита не являлись носителями этой группы бактерий. Эта находка дополняет литературные данные, свидетельствующие о том, что S. odontolytica (прежнее название — A. odontolyticus) активно образует биопленки в пародонтальных карманах, но не является значимым пародонтопатогеном [20].

Самый важный результат настоящего исследования касается положительной корреляции между индексом NS (отражает соотношение между представителями Nanosynbacter и Schaalia spp.) и степенью тяжести хронического генерализованного пародонтита. Наиболее логичным объяснением этого факта может быть повышение вирулентности бактерий S. odontolytica под влиянием увеличения количества закрепившихся на них эпибионтов N. lyticus. Схожее наблюдение было сделано другими авторами, которые зарегистрировали индуцированное эпибионтами через регуляторы системы «Quorum Sensing» усиление биопленкообразования у A. odontolyticus (современное название — S. odontolytica) [21].

В качестве полезного результата можно рассматривать наблюдение, касающееся отсутствия взаимосвязей между количеством Nanosynbacter и хроническим генерализованным гингивитом.

ВЫВОДЫ

Вероятно, N. lyticus являются симбионтами не только бактерий рода Schaalia, но и представителей других таксонов. Полученные нами результаты побуждают задуматься о проведении перспективного исследования, направленного на поиск новых хозяев N. Lyticus. Бактерии рода Schaalia spp. вовлечены в патогенез хронических генерализованных форм пародонтита средней и тяжелой степени. Индекс NB, отражающий соотношение между представителями рода Nanosynbacter и общим количеством бактерий, повышается при хроническом генерализованном пародонтите и может быть следствием усиления вирулентности патогенетически значимых бактерий под влиянием эпибионтов N. lyticus. Индекс NS, отражающий соотношение между представителями рода Nanosynbacter и Schaalia spp., не может быть полезным для оценки состояния тяжести у пациентов с хроническим генерализованным гингивитом.