Туберкулез легких (ТБ) — острая общемировая проблема теоретической медицины и практического здравоохранения [1]. В ряде стран сохраняется высокий уровень заболеваемости и смертности, причиной которых являются лекарственная устойчивость возбудителя, высокая распространенность ВИЧ-инфекции у больных туберкулезом, низкая приверженность пациентов к терапии, а также генетическая детерминированность особенностей ответа на инфекцию и терапию [2–5].

С целью изучения значения генетической компоненты проводят разноплановые исследования, в том числе анализ геномов Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) и организма-хозяина. Одним из направлений в этой области является поиск ассоциативных связей носительства определенных генотипических и аллельных вариантов генов со спецификой ответа организма человека на инфицирование M. tuberculosis и противотуберкулезную терапию. Несмотря на значительный объем накопленных данных [6–9], сохраняются неоднозначность и даже определенная противоречивость полученных результатов, что определяет необходимость продолжения исследований в данной области.

С учетом современных представлений о ключевых иммунных механизмах, обеспечивающих распознавание M. tuberculosis и последующую деструкцию патогена [10, 11], высокий интерес у научного сообщества вызывают внутриклеточные сигнальные пути и молекулярные каскады, вовлеченные в дифференциальную экспрессию генов, задействованных в иммунных реакциях и регулирующих воспаление как системную защитную реакцию организма [12–14]. К их числу относится NF-kBсигнальный путь, результатом активации которого является стимуляция воспаления через усиление биосинтеза провоспалительных факторов TNFα, IFNγ, IL6, IL8 и других цитокинов [15].

Транскрипционный фактор NF-kB1 (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) представлен в клетке в виде полноразмерного белка-предшественника (р105) и его процессированной формы (р50). NF-kB1/р50 в составе комплекса с р65 (RelA) является активатором транскрипции, а NF-kB1/р105 в виде гомодимеров (либо вместе с ингибитором NF-kB — IkB) выступает в качестве репрессора данного процесса. Следовательно, модификация процессинга р105–р50 может влиять на направленность и эффективность NF-kB-пути, а внутриклеточный баланс р105/р50 — определять адекватность ответа клеток на активирующие сигналы и, тем самым, вносить вклад в патогенез туберкулеза.

Посттрансляционный процессинг р105–р50 Ubнезависимым способом с участием протеасомы 20S в настоящее время рассматривают как основой механизм образования NF-kB1/р50 [16]. Область эндопротеолиза имеет достаточную протяженность и включает аминокислотные остатки (АК) с 430 по 530. На генном уровне данный регион охватывает область экзонов (Е) Е13 (403–433 АК) — Е15 (499–546 АК) общей протяженностью 2771 пн. Цель настоящего исследования — изучение ассоциаций с туберкулезом легких аллельных вариантов гена NFKB1 по панели SNP, локализованных в зоне процессинга NF-kB1 р105→р50.  

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужила тотальная ДНК, выделенная из образцов крови пациентов ГБУЗ «Кузбасский клинический фтизиопульмонологический медицинский центр имени  И. Ф. Копыловой» (ГБУЗ ККФПМЦ) (г. Кемерово) больных туберкулезом легких (группа «ТБ», n = 93) и группы популяционного контроля (группа «ПК», n = 96), представленной выборкой жителей г. Кемерово и Кемеровской области. В группу пациентов с туберкулезом легких вошло 74 мужчин и 19 женщин в возрасте 26–88 лет с впервые установленным диагнозом (n = 78) и рецидивом (n = 15). Клинические формы были представлены инфильтративным (n = 49), диссеминированным (n  = 23), очаговым (n  = 6), фибрознокавернозным (n = 5) туберкулезом легких, туберкулемой (n = 7), плевритом (n = 3). Обе группы формировались с учетом национальности (по самоопределению), демографических и анамнестических данных.

Критерии включения в группу ТБ: установленный диагноз впервые выявленного туберкулеза или рецидива заболевания; возраст старше 18 лет. Критерии исключения: наличие ВИЧ-инфекции; наличие в сыворотке крови антител к вирусу гепатита С (HCVAg) и гепатиту В (HBsAg); отказ от участия в исследовании. Всем пациентам проводили обследование в объеме, регламентированном действующими клиническими рекомендациями. Для верификации диагноза использовали комплекс клинических, лабораторных и инструментальных данных. Диагноз туберкулеза устанавливали центральной врачебной комиссией ГБУЗ ККФПМЦ. ДНК из биологических образцов выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование по rs4648050, rs4648051, rs4648055, rs4648058, rs4648068, rs1609993  проводили методом ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе «Applied Biosystems QuantStudio 5» (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием коммерческих наборов («ДНК-Синтез», Россия). Согласно инструкции производителя программы амплификации включали следующие условия: первичная денатурация в течение 3 мин при температуре 95 °C; 40 циклов отжига праймеров при специфичной температуре для каждого полиморфизма (54–59 °C); элонгации цепи при температуре 72 °C и денатурации при температуре 95 °С. Состав смеси реагентов для амплификации: ДНК исследуемого образца — 1 мкл, Taq-ДНК-полимераза — 0,5 мкл, 10× буфер для Taq-ДНК-полимеразы — 2,5 мкл, смесь праймеров (прямой F, обратный R) — 2,5 мкл, раствор четырех dNTP — 1 мкл, флуоресцентно-меченные зонды TaqMan (FAM, VIC) — по 1 мкл, деионизированная вода — до общего объема смеси 25 мкл. Первичные результаты подвергнуты стандартной процедуре анализа с использованием ресурсов программ Statictica, SNPStats, Arlequin. Рассчитывали генотипические и аллельные частоты. Равновесие Харди–Вайнберга оценивали с помощью критерия χ² Пирсона (χ²_X-W). Анализ ассоциативных связей полиморфных вариантов геновкандидатов проводили на основе показателей отношения шансов (OR) с учетом доверительного интервала (CI) для отношения шансов (95% CI). Нулевую гипотезу отвергали при p-value меньше 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ген NFKB1 (HGNC:7794) локализован на 4q24, имеет протяженность 115 973 пн  (GRCh38: CM000666.2 – 4: 102 501 330-102 617 302) и содержит 27 экзонов (Е). Формирование панели SNP (Single Nucleotide Polymorphism) для исследования осуществляли с учетом: 1) локализации SNP в зоне процессинга — в качестве таргетной выступала область экзонов Е13-Е15, а также примыкающих к ней интронов (I) — I12, I15; 2) частоты в популяции минорного аллеля (MAF) — не менее 0,1. Источником информации послужил геномный браузер Ensembl (http://www.ensembl.org), а также данные NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Общее число SNP в гене NFKB1 составляет 41 781. Число SNP, встречающихся в популяциях с частотой минорного аллеля (MAF) более 0,1, равно 152. В результате отбора полиморфных вариантов в таргетной для исследования области I12-E13-I13-E14-I14-E15-I15 протяженностью 7325 пн (102 593 569–102 600 894 пн) выявлено пять вариантов, локализованных в интронах, и один — с экзонной локализацией. Характеристика сформированной SNP-панели представлена в табл. 1.

Данные, характеризующие частоты альтернативного аллеля по панели из шести SNP (rs4648050, rs4648051, rs4648055, rs4648058, rs4648068, rs1609993) в гене NFKB1 у пациентов с ТБ и в группе ПК в сопровождении показателей равновесия генотипических частот (χ²_X-W), а также данные о частотах альтернативного аллеля в общемировой (Global) и европейской (EUR) популяциях представлены в табл. 2.

Определение состояния равновесия частот генотипов в исследованных нами выборках показало следующее. Величины показателя χ²_X-W в группе ПК свидетельствуют об отсутствии значимых отклонений от равновесия Харди– Вайнберга по всей исследованной панели SNP в гене NFKB1. В выборке пациентов с ТБ по двум SNP (rs4648068 и rs1609993) выявлено отклонение (p < 0,05) генотипических частот — χ²_X-W составил 5,06 и 9,15 соответственно. 

Для анализа специфики генофонда русских Сибири было проведено попарное сравнение частот аллелей rs4648050, rs4648051, rs4648055, rs4648058, rs4648068, rs1609993 в гене NFKB1 в исследованной нами выборке русских Кемеровской области (Кузбасс; группа ПК) с данными, известными для общемировой и европейской популяций.  Полученные результаты отражают особенности генетического профиля русского населения Сибири в сравнении с общемировыми частотами и частотами, характерными для популяций Европы по rs4648050 (p < 0,05), а также в части сопоставления с общемировой популяцией по rs4648051 (p < 0,05). В отношении остальной части исследованных SNP аллельные частоты в группе ПК статистически значимо не отличались.

Сравнение характера распределения аллельных частот в выборке ТБ и в группе ПК выявило значимое отличие (p < 0,05) по rs4648068, для которого значение χ² составило 3,86. Обращает на себя внимание, что сравнение аллельных частот в выборке пациентов с ТБ с частотами общемировой и европейской популяции демонстрирует специфику по всему исследованному комплексу SNP, за исключением rs1609993. Это позволяет предположить, что увеличение объемов выборок позволит в перспективе выявить более широкий спектр значимых ассоциаций между изученными SNP и ТБ.

Частоты генотипов rs4648050, rs4648051, rs4648055, rs4648058, rs4648068, rs1609993 в гене NFKB1 и результаты исследования ассоциации сформированной панели SNP с ТБ представлены в табл. 3.

Сравнение генотипических частот выявило статистически значимые отличия в отношении двух SNP — rs4648068 (p = 0,03) и rs4648055 (p = 0,05). По rs4648068, как отмечено выше, нами показаны значимые различия и по данным сопоставления частот аллелей. Исследованием продемонстрирована повышенная частота гомозиготного варианта GG, в составе которого находится альтернативный аллель. Что касается rs4648055, то и в этом случае в выборке пациентов с ТБ отмечена более высокая частота гомозиготного генотипа, содержащего альтернативный аллель — АА. Оба генотипа GG*rs4648068 и АА*rs4648055 были отнесены к генотипам этиологической фракции, т. е. их носительство сопряжено с повышенной подверженностью к развитию ТБ при микобактериальном инфицировании. Исследованием установлена статистически значимая связь с ТБ генотипических вариантов АА*rs4648055 (OR = 2,51; p = 0,05) и GG*rs4648068 (OR = 2,16; p = 0,03).  

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты сопоставления частот альтернативного аллеля с суммарными данными по проектам (ALFA dataset, https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/2020/03/26/alfa/) (табл. 2) указывают на отличия значений, полученных настоящим исследованием для групп населения Сибирского региона, как относительно общемировых значений (Global), так и европеоидных популяций (EUR) по всему спектру исследованных SNP, за исключением rs1609993. Это свидетельствует об особенностях «генетического портрета» русского населения Сибири в отношении изученного комплекса, что необходимо учитывать при проведении метаанализа, организации ассоциативных исследований и определении спектра информативных биомаркеров ТБ.

В настоящем исследовании значимые ассоциативные связи с риском развития ТБ получены для интронных вариантов rs4648055, rs4648068 (табл. 3). При варианте rs4648055 альтернативный аллель А в гомозиготном состоянии повышает риск развития заболевания в два с половиной раза, а в отношении rs4648068 повышение рисков развития заболевания в два раза обусловлено наличием в генотипе альтернативного варианта аллеля G в гомозиготном состоянии. Также можно отметить наличие тенденции к статистической значимости в отношении протективного эффекта мажорных генотипов GG*rs4648055 (OR = 0,55; p = 0,07) и АА*rs4648068 (OR = 0,54; p = 0,07).

Отметим, что литературные данные о вкладе rs4648055 и rs4648068 в развитие патологических состояний к настоящему времени немногочисленны и их результаты неоднозначны. В ряде работ сообщается об отсутствии значимых ассоциативных связей rs4648055 и rs4648068 с развитием таких патологических состояний, как рак легкого [17] и ишемическая болезнь сердца [18]. В то же время при исследовании рака головы и шеи у ВПЧинфицированных жителей Пакистана для rs4648068 установлена роль аллеля G в гетеро- и гомозиготном состояниях в повышении риска развития онкологии [19]. При исследовании факторов риска развития рака желудка в популяции ханьцев значимые результаты установлены в отношении аллеля G rs4648068 (OR = 1,43; p = 0,0001) [20]. Частоты распределения генотипов в контрольной группе составили АА — 27,71%, AG — 53,58%, GG — 18,71%; в группе пациентов — 22,94%, 45,64%, 31,42%. Частота альтернативного аллеля G в группе сравнения составила 0,455, а в группе с онкопатологией — 0,542, что сопоставимо с данными, полученными в настоящем исследовании для группы ТБ (0,538). Аналогичные результаты установлены при изучении вклада rs4648055 и rs4648068 в развитие рака яичников в китайской популяции, при этом значимые ассоциации выявлены также только в отношении аллеля G rs4648068 (OR = 1,38; p = 0,001), частота которого в группе пациентов составила 0,532, а в группе сравнения — 0,454 [21].

ВЫВОДЫ

К основным результатам исследования можно отнести следующие. Во-первых, получены новые научные данные о частотах rs4648050, rs4648051, rs4648055, rs4648058, rs4648068, rs1609993 в гене NFKB1 у русских Сибири. Эти данные позволяют сделать заключение о специфике генетической структуры русского населения, которую необходимо учитывать при проведении ассоциативных исследований. Вовторых, статистически достоверное отличие аллельных частот rs4648050, rs4648051, rs4648055, rs4648058, rs4648068 в выборке пациентов с туберкулезом легких от общемировых частот и частот, характерных для популяций Европы, свидетельствует о потенциальной информативной значимости сформированной панели SNP, что требует продолжения исследования. В-третьих, выявление ассоциаций между подверженностью ТБ и гомозиготными генотипами по альтернативному аллелю в отношении rs4648055 и rs4648068 косвенно свидетельствует в пользу гипотезы о модифицирующем влиянии генетического полиморфизма — SNP, локализованных в зоне процессинга в гене NFKB1, и его возможном вкладе в эффективность процессинга р105→р50, баланс продуктов гена NF-kB1 (р105/ р50) и регуляцию экспрессии генов-мишеней. Это предположение требует дальнейшего изучения на основе анализа количественного содержания р105 и р50 с параллельным исследованием транскрипционной активности генов-мишеней данного транскрипционного фактора. Выявление и анализ особенностей молекулярных механизмов на популяционном и индивидуальном уровне не только детализируют представления о молекулярных механизмах патогенеза ТБ, но и способствуют совершенствованию диагностических процедур, в том числе с прогнозированием прогрессирования процесса, совершенствованию терапевтических стратегий и поиску путей разработки новых лекарственных препаратов.