Известно, что существует три основных типа иммунного ответа — Т1, Т2 и Т17 [1], регулируемые с помощью одной из популяций Т-лимфоцитов-хелперов (T helper, Th): Th1, Th2 и Th17 соответственно. Иммунная система находится в состоянии баланса, или иммунного «равновесия», между возможными типами иммунного ответа [2]. Это состояние динамическое, и вклад в него различных типов иммунного ответа меняется со временем в течение жизни человека под действием ряда внешних и внутренних факторов [3–5]. Кроме Тh влиять на иммунный баланс способны лимфоидные клетки врожденного иммунитета (innate lymphoid cells, ILC), способные синтезировать характерные для Th цитокины, причем гораздо быстрее и в большем количестве, а значит либо усиливать, либо подавлять иммунный ответ на самых ранних этапах его реализации [6].

По способности продуцировать цитокины, характерные для T1, T2 и T17 иммунного ответа, «хелперные» ILC делят на ILC1, ILC2 и ILC3 соответственно. Однако в настоящее время считается, что ILC не только являются аналогами Т-хелперных клеток, но и участвуют в качестве связующего звена между сенсорными клетками, отслеживающими любые изменения в окружающей среде, которые не обязательно являются патогенными, и эффекторными клетками, вследствие чего осуществляется поддержка гомеостаза организма и иммунного равновесия [7]. Хотя зависимое от MHC (major histocompatibility complex) перекрестное взаимодействие ILC-T-клеток было продемонстрировано на нескольких мышиных моделях [8–12], антигенпрезентирующие свойства ILC человека остаются недостаточно изученными. Показано, что ткани опухоли кишечника человека содержат ILC с повышенной экспрессией HLA-DR и у большинства ILC отсутствуют дополнительные сигнальные молекулы для стимуляции Т-клеток. Клетки ILC с фенотипом HLA-DR⁺CD127⁺ совместно с Т-клетками локализуются в непораженной ткани толстой кишки, а также на границе опухоли, что указывает на возможность физического взаимодействия между этими двумя типами клеток. Супрессия Т-клеточного ответа на кишечные комменсальные бактерии, основанная на функционировании ILC, была ранее продемонстрирована в мезентериальных лимфатических узлах у мышей [10, 11]. Следовательно, презентация антигена ILC в комплексе c MHC II класса (МНСII) без костимуляторных сигналов может играть роль в развитии иммуносупрессии при защите опухоли от уничтожения клетками иммунной системы. Тем не менее в случае ILC2 процесс презентации антигена может существенно отличаться. Показано, что в дополнение к продукции Т2-цитокинов ILC2 экспрессируют MHCII в сочетании с костимулирующими молекулами CD80, CD86 и лигандом OX40L. Вследствие этого ILC2 могут действовать как антигенпрезентирующие клетки (AПК), процессируя и представляя антигены Т-клеткам, тем самым индуцируя антиген-специфический ответ CD4⁺-Т-клеток [13, 14].

При развитии онкопатологии нарушение иммунного баланса является одним из ключевых факторов ее возникновения: цитокины T1 иммунного ответа ассоциированы с усилением противоопухолевого иммунного ответа, тогда как Т2-цитокины могут способствовать опухолевому росту и метастазированию [15, 16]. Если для солидной опухоли негемопоэтического происхождения цитокины являются преимущественно средством достижения иммуносупрессии противоопухолевого ответа, то при гемобластозах они могут выступать как факторы роста опухолевых клеток. У пациентов с хроническим лимфолейкозом, характеризующимся наработкой атипичных зрелых В-лимфоцитов, отмечен сдвиг в сторону Th2, который корректируется при лечении ибрутинибом (ингибитором тирозинкиназы Брутона) [17].

В случае множественной миеломы (ММ) количество CD4⁺-Th1 и CD4⁺-Th17 у пациентов было выше, чем у доноров [18]. Однако несмотря на численное преобладание этой популяции клеток, концентрация Т2-цитокина IL4 (интерлейкина-4) была значительно повышена в сыворотке крови. Поэтому высокая продукция данного цитокина может быть связана прежде всего с секрецией его клетками ILC2.

Цель данного исследования — оценить особенности врожденных лимфоидных клеток у пациентов с ММ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены 14 пациентов ММ и 13 условно здоровых доноров. Обе исследуемые группы были сопоставимы по гендерным и возрастным характеристикам. Исследование проводили с мая  по ноябрь 2024 г. Критерии включения лиц в исследование: пациенты с ММ обоего пола в возрасте 18–65 лет; II и III клиническая стадия заболевания по классификации Durie–Salmon; на момент включения у пациентов достигнута полная ремиссия (ПР) или очень хорошая частичная ремиссия (ОХЧР); наличие письменного информированного согласия. Критерии включения лиц в контрольную группу: здоровые доноры обоего пола 18–65 лет; отсутствие аутоиммунных, онкологических и хронических рецидивирующих вирусных инфекций.

Критерии для исключения лиц обеих групп из исследования: несоответствие критериям включения; выраженная декомпенсированная сердечно-сосудистая, дыхательная, печеночная недостаточность; наличие острого инфекционного заболевания; беременность; психические нарушения; отказ пациента либо донора от участия в исследовании.

Материалом для исследования служили мононуклеарные клетки периферической крови (МНК ПК). Выделение МНК ПК проводили из периферической крови (30–50 мл) пациентов с ММ и здоровых доноров с помощью стандартного метода центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина.

Для оценки иммунофенотипа ILC выделенные МНК ПК окрашивали моноклональными антителами, конъюгированными с флюорохромами: анти-Lineage (CD2/3/14/16/19/20/56/235a), антиCD11c и анти-FceR1 alpha-FITC, анти-CD294-PE, анти-CD127-PerCP/Cy5.5, антиCD117-APC, HLA-DR-PE/Cy7. Общее количество ILC клеток определяли как Lin–CD127⁺, поскольку данные клетки не несут на себе линейных маркеров, но имеют на своей поверхности альфа-цепь рецептора к IL7. Для оценки соотношения различных субпопуляций ILC выявляли количество клеток CD294⁺ILC (ILC2), CD117–CD294–ILC определяли как ILC1, а CD117⁺СD294–ILC идентифицированы как ILC3. Фенотип клеток анализировали на проточном цитофлуориметре LongCyte (Challenbio, Китай).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью GraphPadPrizm 9.0.0 (GraphPad Software, Inc., США). Для сравнения показателей в исследуемых группах использовали критерий Манна–Уитни. Результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом [25-й; 75-й перцентили]. Результаты считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Показано, что у пациентов с ММ снижено относительное количество ILC в периферической крови по сравнению с группой условно здоровых лиц (рис. 1). Доля «хелперных» ILC составила у пациентов с ММ 0,05% [0,03; 0,16] от МНК ПК, в то время как у доноров доля этих клеток была в четыре раза меньше и составила 0,24% [0,06; 0,48]. Следует отметить, что снижение общей численности ILC связано с нарушением субпопуляционного состава этих клеток. Обнаружено, что у пациентов относительное количество ILC2 среди МНК ПК у условно здоровых лиц и у пациентов с ММ составило 0,06% [0,02; 0,17] и 0,04% [0,02; 0,09] соответственно и не имело статистически значимых различий (рис. 2). У здоровых доноров в периферической крови преобладали ILC1, их доля составила 0,07% [0,02; 0,19], а содержание ILC3 — 0,008% [0,003; 0,018], тогда как у пациентов относительное количество ILC1 (рис. 3) и ILC3 (рис. 4) — 0,02% [0,01; 0,04] и 0,001% [0; 0,004] соответственно и достоверно снижалось по сравнению с донорами.

Закономерно, что подобные изменения вели к изменению баланса различных популяций ILC. При оценке доли ILC2 среди общей популяции ILC у пациентов с ММ отмечено увеличение процентного содержания ILC2 среди ILC по сравнению с донорами (рис. 5).

Проведена также оценка экспрессии молекул HLA-DR на поверхности ILC2, одного из антигенов MHC II класса, необходимых для осуществления презентации антигена. Показано, что у пациентов с ММ относительное количество ILC2, экспрессирующих на своей мембране антиген HLA-DR, было значительно ниже, чем у доноров (рис. 6). Следовательно, несмотря на повышенное относительное количество ILC2 у пациентов с ММ, способность к презентации антигена при этом заболевании клетками снижена, что может приводить к ослаблению противоопухолевого иммунного ответа и снижению активации Т-лимфоцитов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно литературным данным, функционирование ILC при гемобластозах, продемонстированное на примерах острого миелоидного лейкоза и хронического лимфолейкоза, может быть связано с несколькими особенностями [19]. Во-первых, при этих заболеваниях наблюдаются снижение количества и ослабление функциональной активности ILC, что приводит к снижению концентрации цитокинов в микроокружении опухоли и, как следствие, к супрессии иммунного ответа. Во-вторых, активация ILC2 и поляризация иммунного ответа в сторону Т2 могут приводить к усилению активности супрессорных клеток. В-третьих, вне опухоли в нормальных тканях ILC осуществляют поддержание гомеостаза и участвуют в репарации тканей, в том числе и при развитии реакции «трансплантат против хозяина», являющейся распространенным осложнением после аллогенной трансплантации стволовых клеток. 

В ходе данного исследования нами обнаружено, что у пациентов с ММ, несмотря на снижение относительного количества «хелперных» ILC среди МНК ПК, число cубпопуляции ILC2 сохранялось на уровне, аналогичном таковому у здоровых лиц. Следовательно, подобные изменения могли быть причиной дисбаланса различных субпопуляций ILC, увеличения доли ILC2 cреди всех ILC и усиления направленности иммунного ответа в сторону Т2, а также снижения количества ILC1, способствующих Т1типу иммунного ответа, наиболее эффективного против клеток опухоли. Известно, что поляризация иммунного ответа в сторону Т2 и ослабление иммунного ответа Т1 способствуют инактивации противопухолевого иммунитета, усилению опухолевого роста и часто наблюдаются при злокачественных новообразованиях.

Следует также отметить, что полученные нами результаты сопоставимы с опубликованными данными о росте уровня Т2-цитокинов при ММ [18]. Кроме того, уровень ILC2 в периферической крови повышен при моноклональной гаммапатии неясного генеза (МГНГ) — состоянии, предшествующем развитию ММ [20]. Известно, что в костном мозге при МГНГ, напротив, увеличивалась доля ILC1, но при этом функциональная активность ILC1 и ILC2, определяемая по внутриклеточному содержанию цитокинов, была снижена. В нашем исследовании при ММ также наблюдалось уменьшение доли клеток среди ILC2, способных к презентации антигена. Другими же авторами продемонстрировано снижение доли ILC2 среди Lin–CD127⁺-клеток периферической крови [21], что, возможно, связано с различиями между группами пациентов, поскольку в указанное исследование были включены пациенты с недавно установленным диагнозом до начала терапии. При этом было отмечено изменение функциональных свойств ILC2 в периферической крови у пациентов с МГНГ и ММ по сравнению с ILC2 у условно здоровых лиц, вследствие чего ILC2 у пациентов приобретали цитотоксическую активность по отношению к опухолевым клеткам. Возможно, подобные изменения связаны с дифференциацией ILC2 пациентов с ММ в ILC1-подобные клетки [23], противоопухолевая активность которых, с одной стороны, может возрастать вследствие поляризации иммунного ответа в сторону Т1 и приобретения цитотоксической активности, но, с другой стороны, может нарушаться при гемобластозах, в частности, остром миелобластном лейкозе.

ВЫВОДЫ

Таким образом, у пациентов с ММ наблюдается изменение субпопуляционного состава ILC c увеличением доли ILC2 среди ILC, что способствует поляризации в сторону Т2-типа иммунного ответа. Показано, что при этом на поверхности клеточной мембраны ILC2 отмечено ослабление экспрессии HLA-DR, что приводит к снижению способности активировать иммунный ответ. Следовательно, дальнейший интерес представляет изучение механизмов и особенностей поляризации иммунного ответа, в том числе проведение комплексной оценки продукции Т1/Т2/ T17 цитокинов различными популяциями регуляторных клеток при ММ и других видах гемобластозов. Кроме того, актуальным остается поиск потенциальных мишеней для проведения таргетной терапии у пациентов с ММ.