Мукоэпидермоидная карцинома (МЭК) — самая распространенная злокачественная опухоль слюнных желез и встречается в 30% случаев выявления злокачественных опухолей слюнных желез [1]. Чаще всего МЭК поражает крупные слюнные железы, в частности околоушную слюнную железу (60% случаев), но может затрагивать и малые слюнные железы [2, 3]. 

В гистопатологической структуре МЭК выделяют мукоциты, промежуточные и эпидермоидные клетки в качестве основных компонентов, но могут также содержаться цилиндрические, светлые клетки и онкоциты, что представляет диагностические сложности для патологов [4–6]. Эти компоненты формируют различные гистологические структуры, такие как кистозная (наиболее распространенная и хорошо дифференцированная), солидная (редкая, с некрозом и со значительной клеточной и ядерной атипией) или солидно-кистозные структуры, которые характерны для опухолей, более склонных к инвазивному росту и формированию метастазов [7, 8].

МЭК может быть диагностирована на основании только ее гистологических особенностей, без использования других дополнительных исследований, таких как иммуногистохимическое (ИГХ) или генетические исследования, однако при постановке окончательного диагноза нередко возникают сложности [1]. В настоящее время создано множество систем градации для классификации МЭК, однако универсально признанной единой системы нет [9]. МЭК классифицируют как опухоль низкой (G1), средней (G2) или высокой (G3) степени злокачественности по четырем различным системам градации, таким как система Goode, Auclair и Ellis AFIP (Институт патологии Вооруженных сил) и система Brandwein, которые используют в повседневной гистопатологической практике [1, 4, 6], а также модифицированные системы градации Healy и MSKCC качественного характера (табл. 1). Методики AFIP и Brandwein не всегда согласуются при классификации одной и той же опухоли, особенно когда дело доходит до установления конкретных различий между опухолями G2- и G3-степени. Исследования, сравнивающие системы градации, показали различия при описании больших и малых слюнных желез [7, 10].

Канцерогенез — это многоэтапный процесс, в котором нарушения метаболизма глюкозы могут играть значительную роль из-за быстрого размножения клеток, характерного для злокачественного роста [11]. В современных исследованиях выявлены высокий энергетический метаболизм злокачественных опухолей и участие глюкозы в их росте. Глюкоза является основным источником энергии для клеток млекопитающих, а транспортеры глюкозы (GLUT) на цитоплазматической мембране способствуют ее проникновению в клетки. Таким образом, GLUT — важные ферменты, опосредующие метаболизм глюкозы в процессе канцерогенеза [12]. Высокая экспрессия GLUT1 в злокачественных опухолях связана с инвазией и метастазами, включая рак головы и шеи [13]. Золотым стандартом изучения злокачественных процессов слюнных желез является маркер пролиферации Ki-67. Роль Ki-67 в диагностике и классификации опухолей слюнных желез огромна: он напрямую коррелирует со скоростью клеточной пролиферации, которая является ключевым показателем агрессивности опухоли [14].

Цель исследования — дать оценку различных систем градации МЭК на основе пролиферативной активности и метаболизма глюкозы их клеток для определения степени злокачественности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ретроспективно были проанализированы парафиновые блоки опухолей 40 пациентов (женщин и мужчин) с диагнозом «мукоэпидермоидная карцинома» из архива Лаборатории патологической анатомии ФГБУ НМИЦ «Центрального научно-исследовательского института стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Министерства здравоохранения Российской Федерации за период с 2014 по 2023 г.

Морфологические исследования проводили согласно стандартным протоколам окраски гематоксилином и эозином. Гистологические препараты оценивали с использованием следующих четырех систем градации: модифицированная градация Healy, градация MSKCC, градация AFIP и градация Brandwein. Эти системы сравнивали с итоговыми оценками каждого случая и коррелировали с ИГХ-исследованиями.

Гистологическое и ИГХ-исследования проводили в соответствии со стандартным протоколом. Все образцы биопсийного материала окрашивали моноклональными антителами кролика от Thermo scientific (США, клон SP6) к белкам Ki-67, поликлональными антителами кролика от Thermo scientific (США) к белкам GLUT1. Полученный материал оценивали с помощью микроскопа Axioplan 2 Imaging (Karl Zeiss, Германия) и для фотографирования препаратов использовали камеру AxioCam ERc5s (Karl Zeiss, Германия). Визуализацию ИГХ проводили при помощи системы визуализации UltraVision Quanto Detection System HRP DAB (США). Экспрессию белка пролиферации Ki-67 оценивали по индексу пролиферативной активности (процент клеток с интенсивно окрашенными ядрами на 300 ядер каждого типа клеток МЭК). Экспрессию GLUT1 изучали по окрашиванию цитоплазмы и/или цитоплазматических мембран и оценивали по условным критериям в баллах: отсутствие экспрессии — 0, слабая экспрессия — 1, умеренная экспрессия — 2, сильная экспрессия — 3.

Градацию МЭК проводили с использованием четырех систем, и корреляции между маркерами, клеточными компонентами и градациями анализировали с помощью тестов Краскала–Уоллиса, попарных сравнений Данна– Бонферрони и корреляции Спирмена. Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS Statistics 23 версии в Windows 10 (IBM Corporation, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гистологическая градация

Система градации AFIP продемонстрировала более консервативный подход, позволяя классифицировать наибольшее количество опухолей, относящихся к низкой степени (G1) (40%), по сравнению с другими системами. Опухоли, классифицированные как опухоли средней степени (G2), составили 35%, в то время как опухоли высокой степени (G3) — только 25%. Это распределение позволяет предположить, что по системе AFIP происходит присвоение опухолям более низких градаций, что приводит к потенциальному недооцениванию их агрессивности по сравнению с другими системами.

Для системы градации Brandwein характерен более агрессивный подход: наименьшему числу опухолей присваивается низкая степень (G1) (20%), в то время как наибольшее число классифицируется высокой степенью (G3) (45%). Опухоли, оцененные как опухоли средней степени (G2), составили 35%, что схоже с системой AFIP. Это позволяет предположить, что в системе Brandwein потенциально больше опухолей определяется агрессивными, но в некоторых случаях с риском переоценки тяжести заболевания.

В системе градации Modified Healy представлено более сбалансированное распределение градаций: 25% опухолей, классифицированных как опухоли низкой степени (G1), 50% — как средней степени (G2) (наибольшая доля среди всех систем) и 25% — как высокой степени (G3). Эта система градации акцентирует внимание на промежуточной категории, что потенциально делает ее более полезной для идентификации граничных или умеренно агрессивных опухолей.

Система градации MSKCC продемонстрировала консервативный подход, аналогичный AFIP: 35% опухолей, классифицированных как опухоли низкой степени (G1), и 45% — как средней степени (G2). Однако наименьшее число опухолей было отнесено к высокой степени (G3) (20%), что отражает тенденцию снижения случаев более высоких степеней злокачественности МЭК. Это, в некоторых случаях, может привести к недооценке агрессивности опухолей.

Иммуногистохимическое исследование

При изучении МЭК на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, были обнаружены мукоциты, промежуточные и эпидермоидные клетки (рисунокA). ИГХ-исследование является эффективным дополнением к диагностике срезов, окрашенных гематоксилином и эозином. В данном исследовании обнаружение ядерных антигенов Ki-67, связанных с клеточным циклом, позволило оценить активность пролиферации клеток, а GLUT1 в качестве показателя метаболизма глюкозы в МЭК.

Во всех клеточных компонентах МЭК белок Ki-67 был обнаружен в ядрах клеток (рисунокБ, Г), а GLUT1 — в цитоплазме и на цитоплазматической мембране (рисунокВ, Д). Распределение индексов пролиферации Ki-67 значительно отличалось между тремя компонентами МЭК (эпидермоидный, промежуточный, мукоидный). Детализированный статистический анализ указывал на высокий уровень пролиферации по Ki-67 в эпидермоидных клетках, где медиана составила 13,3% (9,3; 20,0). Промежуточные клетки продемонстрировали более низкие уровни пролиферации по сравнению с эпидермоидными, с медианой равной 6,7% (3,5; 10,7), а мукоциты показали минимальную экспрессию Ki-67 с медианой 1,3% (0,0; 2,7).

Для оценки связи между индексами Ki-67 и градацией опухоли были проведены тест Краскала–Уоллиса и попарные сравнения. Статистически значимые различия в индексах Ki-67 были обнаружены между градациями опухолей для эпидермоидных (H = 16,25, p = 0,0003) и промежуточных (H = 10,85, p = 0,0045), но не для мукоцитов (H = 4,12, p = 0,12).

Попарные сравнения с использованием метода Данна– Бонферрони показали, что значительные различия были обнаружены для эпидермоидных и промежуточных клеток (табл. 2). Мукоциты не показали значительных различий по градациям.

При статистическом корреляционном анализе методом Спирмена определена значительная взаимосвязь между индексами пролиферации по Ki-67 и степенью злокачественности МЭК по трем изучаемым компонентам. Самая сильная корреляция обнаружена у эпидермоидных клеток (0,53, p = 0,0005). Данный показатель предполагает, что с увеличением степени злокачественности опухоли увеличивается индекс пролиферации Ki-67 в эпидермоидных клетках и увеличивается последовательно, что придает большое значение при изучении агрессивности опухолевого процесса и может быть использовано как маркер агрессивности опухоли. Умеренно положительная корреляция наблюдалась также у промежуточных клеток (rs = 0,47, p = 0,0025), что подтверждает их вклад в прогрессирование опухоли, хотя в меньшей степени, чем у эпидермоидных клеток. В отличие от этого, мукоциты показали слабую и статистически незначимую корреляцию (rs = 0,25, p = 0,12), что отражает их минимальную пролиферативную активность и ограниченную роль в градации опухоли (1Д).

Градация МЭК по подсчету пролиферативной активности в эпидермоидных и промечуточных клеток предполагает низкую степень (G1) с активностью менее 10%, промежуточную степень (G2) от 10% до 15% и высокую степень (G3), превышающую 15–20%. Эти градации, основанные на маркировке Ki-67, дают важную информацию о биологическом поведении МЭК, позволяя определять степень злокачественности опухоли с помощью количественных показателей пролиферации различных клеточных популяций внутри опухоли.

При анализе интенсивности окраски GLUT1 по всем образцам выявлены значительные различия между тремя компонентами. Промежуточные и эпидермоидные клетки продемонстрировали наивысшую среднюю интенсивность окраски с медианой 2 балла (1; 3), что указывает на умеренные уровни изменчивости, в то время как мукоциты показали наименьшую интенсивность медианой 0 баллов (0; 0), отражая последовательно низкое или отсутствующее выражение GLUT1 в этом компоненте (рисунокГ).

Тесты Краскала–Уоллиса позволили выявить значительные различия в интенсивности окраски GLUT1 по степеням злокачественности опухоли для эпидермоидных клеток (p = 0,005) и промежуточных клеток (p = 0,01), но не для мукоцитов (p = 0,15). Попарные сравнения с использованием метода Данна–Бонферрони показали, что для эпидермоидных и промежуточных клеток интенсивность окраски значительно увеличивалась между степенью 1 и степенью 2, а также между степенью 1 и степенью 3. Однако значимые различия между степенями 2 и 3 не обнаружены для обоих компонентов, что позволяет предположить наличие плато в экспрессии GLUT1 при более высоких степенях опухоли. Мукоидные клетки показали низкую интенсивность и равномерность окрашивания вне зависимости от степени малигнизации опухолевого процесса слюнной железы, статистически значимые различия тоже не были обнаружены.

В дополнение к статистическому анализу был проведен анализ корреляции Спирмена, где также определяли взаимосвязь интенсивности окрашивания по GLUT1 со степенью злокачественности опухоли. Были получены следующие результаты: эпидермоидные клетки — rs = 0,48 (p = 0,003), промежуточные клетки — rs = 0,42 (p = 0,008). Эти данные указывают на умеренно положительную корреляцию со степенью злокачественности опухоли и указывает на прогрессивное увеличение экспрессии GLUT1в зависимости от увеличения ее агрессивности. В отличие от этого, мукоциты показали слабую и незначимую корреляцию (rs = 0,15, p = 0,36), что отражает их незначительный вклад в градацию опухоли.

При МЭК оценка интенсивности окрашивания GLUT1 различных клеточных компонентов позволяет получить критическое представление о метаболической активности, связанной с различными степенями злокачественности. Эпидермоидные и промежуточные клетки демонстрируют прогрессирующее увеличение экспрессии GLUT1. Это прогрессирование отражает значительное повышение метаболической активности по мере увеличения степени злокачественности опухоли — от низкой степени с минимальной экспрессией GLUT1, что указывает на снижение метаболических потребностей, до высокой степени, когда интенсивность окрашивания приближается к максимальной, свидетельствуя о высокой метаболической активности, необходимой для быстрого роста и агрессивности опухоли.

Корреляция между GLUT1 и Ki-67 в различных компонентах МЭК

Анализ корреляции Спирмена позволил выявить сильную положительную связь между интенсивностью окраски

GLUT1 и Ki-67 в эпидермоидных клетках (rs = 0,68, p < 0,001). Это указывает на то, что более высокая экспрессия GLUT1 стабильно ассоциируется с увеличенной пролиферативной активностью в этом компоненте. Умеренная положительная корреляция была обнаружена в промежуточных клетках (rs = 0,52, p = 0,004), что позволяет предположить наличие значимой, хотя и менее выраженной, ассоциации между двумя маркерами. В отличие от этого, мукоциты показали слабую и незначимую корреляцию (rs = 0,20, p = 0,18), что отражает минимальное взаимодействие между экспрессией GLUT1 и пролиферацией Ki-67 в этом компоненте.

Оба маркера, GLUT1 и Ki-67, продемонстрировали высокую корреляцию и сильную взаимосвязь в эпидермоидных и промежуточных клетках. В эпидермоидных клетках для GLUT1 и Ki-67 были получены следующие значения: rs = 0,48 (p = 0,003) и rs = 0,53 (p = 0,0005). Аналогично, в промежуточных клетках: GLUT1 — rs = 0,42 (p = 0,008) и Ki-67 — rs = 0,47 (p = 0,0025). Это указывает на умеренную корреляцию со степенью малигнизации процесса, что придает выбранным маркерам большую роль в исследовании прогрессирования опухоли. В отличие от эпидермоидных и промежуточных клеток, мукоциты при изучении корреляции со степенью злокачественности показали слабую взаимосвязь как для GLUT1, где rs = 0,15 при p = 0,36, так и для Ki-67, где rs = 0,25 при p = 0,12, что еще раз подчеркивает их ограниченное участие в градации опухоли.

Корреляция GLUT1 с системами градации опухолей

Интенсивность окраски GLUT1 продемонстрировала умеренные положительные значения корреляции со степенями злокачественности опухолей во всех системах градации. Наиболее сильная корреляция наблюдалась с системой AFIP (rs = 0,50, p = 0,001), это указывает на то, что GLUT1 хорошо согласуется с агрессивностью опухолей, определенной критериями AFIP. Система Modified Healy (rs = 0,48, p = 0,002) также показала сопоставимую корреляцию. Системы Brandwein (rs = 0,45, p = 0,003) и MSKCC (rs = 0,40, p = 0,01) продемонстрировали несколько более слабые корреляции, что предполагает менее прочное соответствие GLUT1 их критериям градации.

Корреляция Ki-67 с системами градации опухолей

Индексы пролиферации Ki-67 продемонстрировали более сильную корреляцию со степенью злокачественности опухолей, чем GLUT1, во всех системах градации. Наивысшая корреляция была отмечена с системой AFIP (rs = 0,55, p = 0,0005), за которой следует система Modified Healy (rs = 0,52, p = 0,001). Эти результаты подчеркивают эффективность Ki-67 как надежного маркера прогрессирования опухоли, особенно в рамках этих систем градации. Системы Brandwein (rs = 0,48, p = 0,002) и MSKCC (rs = 0,45, p = 0,003) также продемонстрировали умеренную корреляцию, но несколько слабее, чем системы AFIP и Modified Healy.

Сравнение систем градации

Среди четырех проанализированных систем градации система AFIP последовательно демонстрировала самую сильную корреляцию как с экспрессией GLUT1, так и с Ki-67, что позволяет предположить наиболее тесное соответствие биологии опухоли, отраженной этими маркерами. Система Modified Healy показала практически такие же результаты, особенно для Ki-67, что делает ее еще одной надежной основой для оценки агрессивности опухоли. Системы Brandwein и MSKCC продемонстрировали несколько более слабую корреляцию, особенно для GLUT1, что указывает на меньшее согласование с метаболической и пролиферативной активностью (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В данном исследовании изучали пролиферативную активность (Ki-67) и активность белка, транспортирующего глюкозу (GLUT1), различных компонентов МЭК, которые были обнаружены во всех клеточных компонентах. Высокий уровень экспрессии выбранных белков выявлен в эпидермоидных и промежуточных клетках МЭК, что указывает на рост и агрессивность опухолевого процесса. Полученные результаты схожи с данными, представленными ранее [15, 16], по которым экспрессия GLUT1 была выше в эпидермоидном компоненте и опухолях высокой степени злокачественности соответственно.

Индекс Ki-67 служит важнейшим биомаркером для определения степени злокачественности МЭК, что дополняет традиционные гистологические исследования. Так, у 46 пациентов низкий индекс Ki-67 коррелировал с благоприятным прогнозом, в то время как более высокий индекс указывал на повышенный риск агрессивного поведения при заболевании [17]. В отличие от более субъективной гистологической оценки, которая косвенно измеряет пролиферативную активность по доле солидных участков, индекс Ki-67 позволяет напрямую определить пролиферацию путем подсчета активно делящихся клеток. Такой прямой подход делает его более объективным и надежным маркером, позволяющим четко различать вялотекущую и агрессивную формы МЭК [14, 17]. Таким образом, использование индекса Ki-67 наряду с гистологической оценкой может значительно повысить точность прогнозирования клинического течения этих опухолей, обеспечивая бесценное руководство для целенаправленных терапевтических стратегий.

В основном такие системы изучения градации, как AFIP и MSKCC, склонны к консервативной градации, что подчеркивает низкие и промежуточные классификации, в то время как для системы Brandwein характерны более агрессивный подход и большая эффективность при работе с опухолями высокой степени злокачественности. Система Modified Healy более эффективна при работе с опухолями промежуточной степени. Эти вариации подчеркивают влияние критериев градации на классификацию опухолей и важность согласования системы градации с клиническими целями, такими как стратификация риска или планирование лечения.

ВЫВОДЫ

Данное исследование подчеркивает ключевую роль GLUT1 и Ki-67 в оценке метаболической и пролиферативной активности МЭК слюнных желез. Высокая экспрессия этих маркеров выявлена в эпидермоидных и промежуточных клетках и соответствовала следующим цифрам: низкая степень — Ki-67 менее 10%, интенсивность GLUT1 составляет 1–2; средняя степень — Ki-67 от 10 до 15%, интенсивность GLUT1 составляет 2; высокая степень — Ki-67 >15%, интенсивность GLUT1 составляет 3. Полученные данные коррелировали со степенью злокачественности опухоли, в то время как мукоциты продемонстрировали минимальную активность. GLUT1 и Ki-67 помогают эффективно различать опухоли низкой степени (G1) от средней (G2) и высокой (G3) степеней, при этом между степенями 2 и 3 наблюдается эффект плато. Среди четырех проанализированных систем градации система AFIP показала наиболее сильную корреляцию с этими биомаркерами, что указывает на ее соответствие биологическому поведению МЭК. Система Modified Healy также показала хорошие результаты, подходит для опухолей средней степени злокачественности, в то время как система Brandwein больше подходит для работы с высокоагрессивными низкодифференцированными опухолями, а система MSKCC кажется более консервативной. Эти результаты подчеркивают потенциальную полезность интеграции ИГХ-маркеров, таких как GLUT1 и Ki-67, в протоколы градации МЭК для повышения точности диагностики и прогностической оценки. Однако несоответствия между системами градации подчеркивают необходимость стандартизированных подходов. Для подтверждения этих результатов и изучения эффективности дополнительных маркеров в улучшении диагностики, градации и планирования лечения МЭК необходимы дальнейшие масштабные исследования.