В настоящее время ишемический инсульт (ИИ) занимает второе место среди причин смертности и третье место среди причин инвалидизации населения в мире [1]. В РФ ежегодно регистрируется более 450 тыс. случаев инсульта в год, при этом летальность варьирует от 17,6 до 20,7% [2]. Патогенез ИИ многофакторный и включает такие механизмы, как нейровоспаление, глутаматергическая эксайтотоксичность и окислительный стресс, приводящие к гибели нейронов в очаге ишемического повреждения [3]. Существующие патогенетические подходы в лечении ИИ демонстрируют ограниченную эффективность и безопасность в связи с наличием узкого терапевтического окна, высокого риска геморрагической трансформации, низкой проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для нейропротекторов, а также наличием скудных представлений о их фармакокинетике и достаточно частых побочных эффектах, что подчеркивает необходимость разработки новых терапевтических стратегий, направленных на нейроптекцию [4]. В связи с этим интерес представляет мелатонин (МТ), обладающий плейотропными эффектами, включая антиоксидантный, противоспалительный, вазоактивный, антиапоптический [5–7]. В ряде работ продемонстрировано нейропротективное действие МТ при ИИ,  реализующееся  посредством  прямого его связывания со свободными радикалами, повышения активности ключевых антиоксидантных ферментов (глутатионпероксидазы, каталазы), ингибирования каспазы-3 и пути NF-κB, а также снижения экспрессии AQP4 и усиления синтеза SIRT-1 в очаге ишемического повреждения головного мозга и как следствие уменьшения объема инфаркта головного мозга с последующим улучшением неврологического дефицита [8–10]. Однако применение МТ как потенциального нейропротектора в виде пероральных лекарственных форм может быть существенно ограничено постинсультной дисфагией, которая наблюдается в 81% случаев у пациентов, перенесших ИИ [11]. Альтернативное применение инъекционных лекарственных форм позволяет обойти проблему постинсультной дисфагии, однако сопряжено с постоянной ретравматизацией пациента при выполнении инъекций, высоким риском микробной контаминации и др. [12]. Ректальные суппозитории с МТ представляют собой перспективную лекарственную форму, обеспечивающую атравматичный путь введения и низкий риск микробной контаминации. В РФ  отсутствуют разрешенные ректальные лекарственные формы с МТ, предназначенные для нейропротекторной терапии ИИ, которые могли бы эффективно доставлять лекарственное средство и оказывать системное воздействие на очаг ишемического повреждения головного мозга, минимизируя риск травматизации и инфекционных осложнений. В связи с потенциальными преимуществами атравматичного пути введения и низкого риска инфекционных осложнений актуальны разработка и изучение ректальных суппозиториев с МТ при ИИ. Цель исследования — в экспериментальных условиях in vivo изучить влияние мелатонина в составе оригинальных ректальных суппозиториев на неврологический статус и микроциркуляцию в очаге ишемического повреждения головного мозга при экспериментальной острой ишемии головного мозга.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполняли на 30 половозрелых крысах — самцах линии Wistar массой 220–240 г, полученных из экспериментально-биологической клиники ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России, в весенне-летний период. Животных содержали при естественном освещении, температуре 20–22 °С и относительной влажности воздуха 60–70%. Методом простой рандомизации всех крыс разделили на три группы по 10 особей: группа 1 — ложнооперированные животные (ЛО), группа 2 — животные с экспериментальной острой ишемией головного мозга (ЭОИГМ), группа 3 — животные с ЭОИГМ, которым вводили оригинальные ректальные суппозитории массой 100 мг, содержащие 2,5 мг МТ, каждые 24 ч на протяжении 7 суток [13].

 Моделирование ЭОИГМ выполняли с использованием модифицированной методики на основе метода Chen S. T. под комбинированным золетил-ксилазиновым наркозом [14, 15]. Животным групп 2 и 3 выполняли рассечение кожи между левой ушной раковиной и левым глазом длиной до 2 см. В области разреза расслаивали мягкие ткани до костей черепа и наносили фрезевое отверстие диаметром 5 мм с помощью высокоскоростного бора (20 000 об./мин) под постоянным ирригационным охлаждением. Производили селективную диатермокоагуляцию пиальных сосудов головного мозга (15 В, 3 с) в зоне коркового представительства средней мозговой артерии под операционным микроскопом при увеличении ×10. Все методические аспекты исследования соответствовали современным стандартам экспериментального моделирования церебральной ишемии [16, 17]. Животным группы 1 выполняли все последовательные оперативные вмешательства, исключая селективную диатермокоагуляцию пиальных сосудов головного мозга.

Из дальнейшего исследования было исключено три особи (две из группы 2 и одна из группы 3), погибшие в первые 6 ч после оперативного вмешательства. Таким образом, было сформировано три группы животных: группа 1 (n = 10), группа 2 (n = 8), группа 3 (n = 9).

На 3 и 7 сутки во всех группах оценивали неврологический статус с помощью  шкалы Garcia J. H, Placing test, Bederson test [18, 19, 20]. Результаты каждого отдельного теста выражали в виде баллов.

Микроциркуляцию в очаге ишемического повреждения головного мозга оценивали методом лазерной допплеровской флуометрии в течение 5 мин  с использованием прибора «ЛААК — 01» (НПП «ЛАЗМА», Россия). Показатели обрабатывали с помощью комплекта программ ООО «Лазма» (Россия) и рассчитывали ПМ по формуле: ПМ = Nэр + Vср, где  Nэр — концентрация эритроцитов  в зондируемом объеме тканей, Vср — усредненная скорость эритроцитов. Величину ПМ выражали в перфузионных единицах (пф. ед).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета IBM SPSS Statistics 19. Для оценки нормальности распределения количественных показателей применяли критерий Шапиро–Уилка. Поскольку большинство исследуемых параметров не подчинялось нормальному закону распределения, анализ проводили с помощью непараметрических методов. Для межгрупповых сравнений использовали критерий Краскела–Уолиса (при сравнении трех и более групп), U-критерий Манна–Уитни (для попарного сравнения групп). При оценке внутригрупповой динамики (сравнение показателей на 3-и и 7-е сутки) применяли  парный критерий Вилкоксона (для связанных выборок), для анализа корреляционных взаимосвязей — коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r). Данные представляли в виде медианы (Me) и нижнего и верхнего квартиля (Q₁; Q₃). Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При ЭОИГМ на 3 и 7 сутки регистрировали очаговый неврологический дефицит в виде правостороннего гемипареза, статолокомоторных нарушений. У животных с ЭОИГМ  по сравнению с ЛО  фиксировали значимое снижение баллов по шкале Gаrcia J. H. на 58,3% (p = 0,001), по Placing test — на 57,9% (p = 0,002) и значимое увеличение баллов по  Bederson test; на 7 сутки фиксировали значимое снижение баллов по шкале Gаrcia J. H. на 75% (p < 0,001), по Placing test — на 78,9% (p < 0,001) и значимое увеличение баллов по Bederson test. У животных с ЭОИГМ на 7 сутки в сравнении с 3 сутками регистрировали значимое снижение баллов по шкале Gаrcia J. H на 40% (p = 0,008), Placing test — на 50,0% (p = 0,003), значимое увеличение баллов по Bederson test — на 100% (p = 0,001) (табл. 1).

При исследовании микроциркуляции у животных с ЭОГИМ по сравнению с ЛО ПМ на  3 сутки снижался на 30%  (p = 0,02), на 7 сутки на 38% (p = 0,005). У животных с ЭОИГМ  7 сутки по сравнению с 3 сутками фиксировалось значимое снижение ПМ на 11% (p = 0,03)  (табл. 2).

Таким образом, у животных с ЭОИГМ  на 3 и 7 сутки были зарегистрированы очаговый неврологический дефицит и снижение церебрального кровотока в очаге ишемического повреждения головного мозга, что подтверждалось значимым снижением баллов по шкале Gаrcia J. H., Placing test и увеличением баллов по Bederson test, а также снижением ПМ.

Применение ректальных суппозиториев с МТ на 3 и 7 сутки приводило к  уменьшению глубины правостроннего гемипареза и статолокомоторных нарушений.  У животных, получавших МТ, по сравнению с животными с ЭОИГМ на 3 сутки регистрировалось значимое увеличение баллов по шкале Gаrcia J. H. на 53.3% (p = 0.008 ), по Placing test на 50% (p = 0.016) и значимое снижение баллов по  Bederson test на 50% (p = 0,029);  на 7 сутки фиксировалось значимое увеличение баллов по шкале Gаrcia J. H. на 233% (p < 0,0001),  по  Placing test на 325% (p < 0,0001) и значимое cнижение баллов по  Bederson test на 100% (p < 0,0001). При введении МТ на 7 сутки, по сравнению с введением на 3 сутки, у животных регистрировалось значимое увеличение баллов  по шкале Gаrcia J. H. на 30,4% (p = 0,004 ),  Placing test на 41,7% (p = 0,002), значимое снижение баллов по Bederson test на — 100% (p = 0,003) (табл. 1).

При оценке микроциркуляции у животных, получавших МТ, по сравнению с животными с ЭОИГМ  ПМ на 3 сутки повышался  на  12,5%  (p = 0,016 ), на 7 сутки на 43,9% (p = 0,005). При введении МТ 7 сутки по сравнению с 3 сутками у животных фиксировали значимое повышение ПМ на 13,8% (p = 0,028)  (табл. 2).

У животных, получавших МТ, по сравнению с ЛО на 3 сутки было зафиксировано снижение баллов по шкале Gаrcia J. H. на 36,1%  (p < 0,001), по Placing test — на 36,8% (p < 0,001) и значимое увеличение баллов по Bederson test — на 100% (p = 0,002); на 7 сутки снижение баллов по шкале Gаrcia J. H. — на 16,7% (p < 0,008), по Placing test на 10,5% (p < 0,038) и значимое увеличение баллов по Bederson test на 0% (p = 0,157) (табл. 1).

Проведенный корреляционный анализ результатов по шкале Gаrcia J. H., Placing test и ПМ на 3 и 7 сутки выявил наличие положительной связи, а между показателем Bederson test и ПМ наличие отрицательной связи: уменьшение неврологического дефицита у животных с ЭОИГМ в условиях применения ректальных суппозиториев с МТ ассоциировано с повышением ПМ в очаге ишемического повреждения головного мозга (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Можно предположить, что зафиксированный нами неврологический дефицит при ЭОИГМ обусловлен локальным критическим снижением церебрального кровотока в веществе головного мозга и активацией каскада патохимических реакций, включая митохондриальную дисфункцию с последующим энергодефицитом нейронов, активацию окислительного стресса, глутаматергическую эксайтотоксичность, нейровоспаление, приводящие к повреждению нейронов в очаге ишемического повреждения [21]. Применение ректальных суппозиториев с МТ приводило к частичному восстановлению неврологического статуса и церебрального кровотока в очаге ишемического повреждения, что может быть обусловлено его фармакологическими особенностями и плейотропными эффектами, включая нейропротективный и вазоактивный эффекты. Относительно низкая молекулярная масса МТ (232 г/моль), умеренная степень растворимости в липидах (Log p = 3), а также умеренная биодоступность при ректальном пути введения (54–72%) могут обеспечивать его проникновение через гематоэнцефалический барьер и оказывать системное действие на очаг ишемического повреждения и потенциальное проникновение [22, 23]. Полагаем, что МТ, входящий в состав ректальных суппозиториев, проникал в системный кровоток и достигал очага ишемического повреждения головного мозга, оказывая нейропротективное действие. Плейотропные эффекты МТ, обусловливающие его возможный нейропротективный эффект, могут быть связаны с опосредованным действием через специфические мембранные и ядерные рецепторы (МТ1, МТ2, ROR), а также  за счет прямого действия [24]. Связывание МТ с МТ-рецепторами клеток микроглии через ингибирование пути STAT3 способствовало уменьшению синтеза провоспалительных цитокинов в очаге ишемического повреждения и редукции нейровоспаления [25]. Кроме того, МТ мог приводить к подавлению активности NADPH-редуктазы и усилению синтеза глутатионпероксидазы, снижая активность процессов окислительного стресса в очаге ишемического повреждения головного мозга [26]. МТ через фосфорилирование ERK1 усиливал активность 90RSK, которая приводила к инактивации проапоточеского белка Bad, тем самым способствуя повышению выживаемости нейронов в зоне ишемического повреждения [27].  Повышение ПМ в очаге ишемического повреждения головного мозга может быть связано с вазоактивным эффектом МТ, который через  повышение активности эндотелиальной NOсинтазы усиливал синтез  NO в эндотелиоцитах и повышал церебральный кровоток [28]. Результаты проведенного исследования убедительно свидетельствуют о клинической перспективности применения ректальных суппозиториев с МТ в качестве дополнительной терапии ИИ, особенно у пожилых пациентов и пациентов, находящихся в тяжелом состоянии, где стандартные методы терапии часто имеют ограниченную эффективность. Полученные данные создают прочную основу для дальнейших исследований, направленных на углубленное изучение механизмов нейропротективного действия МТ через мониторинг динамики биохимических маркеров (MDA, S100β) и их корреляции с клиническими исходами. Перспективными направлениями научного поиска могут быть следующие: разработка дифференцированных алгоритмов дозирования МТ с учетом индивидуальных особенностей пациентов; оценка отдаленных результатов терапии в период от 6 до 12 месяцев наблюдения; изучение возможностей комбинированной терапии с другими нейропротекторными агентами. Для успешного внедрения данной методики в широкую клиническую практику необходимо проведение масштабных многоцентровых рандомизированных исследований с использованием стандартизированных протоколов оценки. Особое значение приобретает разработка персонализированных подходов к терапии, учитывающих возрастные особенности, коморбидный фон и индивидуальные характеристики церебральной гемодинамики пациентов.

ВЫВОДЫ

Селективная диатермокоагуляция пиальных сосудов головного мозга на 3 и 7 сутки приводила к критическому снижению церебрального кровотока с последующим развитием неврологического дефицита в виде правостороннего гемипареза и стато-локомоторных нарушений, что выражалось в прогрессирующем снижении баллов по шкале Garcia J. H, Placing test, увеличении баллов по Bederson test и снижении ПМ в очаге ишемического повреждения головного мозга. Применение оригинальных ректальных суппозиториев  массой 100 мг, содержащих 2,5 мг  МТ,  каждые 24 ч на протяжении 7 суток  приводило к частичному восстановлению неврологического дефицита, что выражалось в повышении баллов по шкале Gаrcia J. H, Placing test, снижении баллов по Bederson test и увеличению ПМ в очаге ишемического повреждения головного мозга, которые не достигали показателей ЛО. Проведенный корреляционный анализ установил ассоциацию между показателями неврологического статуса и ПМ: уменьшение неврологического дефицита у животных с ЭОИГМ в условиях применения ректальных суппозиториев с МТ ассоциировано с  повышением ПМ в очаге ишемического повреждения головного мозга.