В 2008 г. в плазме крови было экспериментально обнаружено присутствие некоторых форм микро-РНК в стабильной форме, исключающей воздействие РНКаз, что послужило началом их исследования в качестве биомаркеров воспалительного процесса [1–5]. Стабильность обусловлена дисрегуляцией клеточной экспрессии микроРНК, что можно наблюдать при инфекции, кроме того, клетка способна высвобождать некоторые формы во внеклеточное пространство. Дальнейшие исследование показали наличие биомаркеров не только в плазме крови, но и в слюне, моче, желчи, грудном молоке и других жидкостях организма [6]. На сегодняшний день имеются данные о специфических изменениях профиля экспрессии микроРНК при различных патологических состояниях, например, при онкологии, заболеваниях сердца и сосудов, воспалении, старении организма и др. [7–8].

Прогресс, наступивший в изучении взаимосвязи различных генов, их продуктов и факторов окружающей среды, привел к очевидности роли эпигенетической изменчивости, состоящей в изменении экспрессии генов, которые не влияют на структуру ДНК, но способны передаваться в ряду поколений. Есть три уровня эпигенетической регуляции — геномный (метилирование ДНК), протеомный (отвечает за модификацию гистонов), а также транскриптомный (регуляция РНК). МикроРНК представляют собой большой класс малых некодирующих информацию РНК-молекул длиной 18–25 нуклеотидов, регулирующих экспрессию генов за счет комплементарного взаимодействия с 3'-нетранслируемыми участками мРНК, что приводит к разрушению молекулы РНК или угнетению процессов трансляции [9].

Известно большое количество микроРНК, которые специфичны для каждого патологического состояния и дают возможность начать наиболее раннюю диагностику с целью начала своевременного лечения.  По последним данным, в патогенезе воспалительных заболеваний задействованы микроРНК miR21 и miR146а [10]. Выяснена роль miR146а в регуляции клеточного цикла, процессов апоптоза, пролиферации и дифференцировке клеток, роль в патогенезе инфекционных заболеваний [11–13].

За последние 10 лет выявлена роль микроРНК в качестве специфических факторов остеоартроза и ревматических заболеваний [14–18]. Обнаружение miR146а в синовиальной жидкости и плазме при остеоартрите является потенциальным диагностическим и прогностическим маркером [19]. Повышение уровня miR146а в плазме крови свидетельствует о развитии и прогрессировании гонартроза, который в подавляющем большинстве случаев сочетается с наличием избыточной массы тела [20]. МiR146a считают маркером ожирения, и повышение его уровня в плазме крови является признаком его развития и прогрессирования. Физическая активность способствует снижению массы тела, в результате чего снижается уровень экспрессии miR146a [21].

Использование при лечении гонартроза нестероидных и стероидных противовоспалительных средств (например, целекоксиба, ибупрофена, дексаметазона, метотрексата и др.) способствует подавлению синтеза провоспалительных цитокинов и miR-146a за счет усиления экспрессии miR149-5p и miR-let-7c-5p [22, 23]. Среди глюкокортикостероидов для лечения воспалительных заболеваний суставов, в том числе и остеоартроза, одним из наиболее часто применяемых препаратов является дексаметазон [24]. По данным метаанализа за 2018 г., уровень экспрессии miR146a выше у пациентов с ревматоидными артритом и остеоартрозом, чем у здоровой группы пациентов, поскольку он служит регулятором первичного иммунного ответа и участвует в патогенезе остеоартроза [22]. Остается недостаточно изученным уровень экспрессии miR146a на фоне ожирения, сочетанного с артрозом, на фоне коррекции глюкокортикостероидами.

Исследование уровня экспрессии miR146a у крыс на фоне ожирения и остеоартроза дает возможность понять патогенетические механизмы развития заболевания и разработать оптимальные схемы лечения. Целью данного исследования было разработать патогенетическую схему лечения остеоартроза, сочетанного с ожирением на фоне применения дексаметазона с учетом уровня экспрессии miR146a, дать оценку влияния различных доз дексаметазона (1 нг/мл, 10 нг/мл и 100 нг/мл) на уровень экспрессии miR-146a у крыс с экспериментальной моделью ожирения и гонартроза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент был проведен на базе Научноисследовательского центра «Аск-Хэлс» (Болгария) и ФГБОУ ВО «ЛГМУ им. Свт. Луки» МЗ РФ  Для проведения эксперимента было отобрано 180 белых лабораторных крыс-самцов линии Вистар, возрастом 8–10 недель, массой 200–250 г. Животных содержали в условиях вивария при температуре 22 ± 2 °C и 12-часовом цикле дня и ночи при свободном доступе к воде и пище. Путем случайного отбора животные были разделены на пять групп (n = 36). Особям первой (контрольной) группы вводили внутримышечно 1,0 мл физиологического раствора хлорида натрия, второй (ожирение + гонартроз) — 1,0 мл физиологического раствора хлорида натрия, третьей, четвертой и пятой (ожирение + гонартроз) — 1,0 нг/мл, 10 нг/мл и 100 нг/ внутримышечно раствора дексаметазона соответственно.

Дозы дексаметазона подбирали из такого расчета: 1 нг/мл — низкая, отражает минимально эффективную концентрацию с целью моделирования минимального противовоспалительного эффекта без выраженной иммуносупрессии; 10 нг/мл — терапевтическая доза, которую применяют с целью подавления цитокининдуцированного воспаления у крыс; 100 нг/мл — высокая доза, использована с целью моделирования возможного «парадоксального» эффекта при гиперэкспозиции глюкокортикоидов. Диапазон доз подбирали с целью оценки дозозависимых ответов miR146a от минимальной до супертерапевтической. Физиологический раствор и дексаметазон вводили внутримышечно 1 раз в сутки ежедневно на протяжении 10 дней. На 3, 5 и 10 сутки проводили забор крови из хвостовой вены с последующим центрифугированием с целью получения сыворотки для определения динамики экспрессии miR146a. Такая схема полностью соответствует ранее опубликованным работам по моделированию противовоспалительного эффекта дексаметазона у лабораторных крыс [24]. Побочные эффекты дексаметазона оценивали на основе поведенческой активности (тест «открытое поле»), массы тела, и индекса Ли, состояния шерсти и кожных покровов, уровня глюкозы крови (выраженных дозозависимых побочных эффектов при введении 1 и 10 нг/мл не наблюдалось, при 100 нг/мл наблюдали признаки гипергликемии и снижение активности, что согласуется с известными побочными эффектами высоких доз глюкокортикостероидов).

Ожирение на животных моделировали с помощью высококалорийной диеты путем добавления в рацион повышенного количества жиров (45%) растительного и животного происхождения и углеводов (35%) на протяжении 8 недель. Для оценки результата использовали индекс Ли (Ли = 1000 × (масса тела (г)) / (длина от кончика носа до ануса (см)). О наличии ожирения свидетельствовал показатель более 310 и повышение массы тела на 25–40% по сравнению с исходной величиной, что свидетельствует о средней степени ожирения [25]. Гонартроз был смоделирован по авторской методике путем многократного повреждения суставного хряща малоинвазивным методом с последующей иммобилизацией на протяжении 2–4 недель с использованием авторского устройства до достижения достоверных рентгенологических признаков артроза при помощи высокочастотного портативного стоматологического рентген-аппарата Posdion Rextar X, 70 кВ (Posdion, Южная Корея).

Определение микроРНК (miR146a) проводили методом количественной обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в режиме реального времени. Сыворотку получили путем центрифугирования 1,0 мл венозной крови крыс, отобранной из хвостовой вены, при 12 000 об./мин, на протяжении 15 мин при температуре 4 °C. Полученные образцы были подвергнуты немедленному замораживанию при температуре –80 °C до момента исследования.

Выделение тотальной РНК проводили с использованием набора miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen, Германия; № 217184) в соответствии с протоколом производителя. Контроль эффективности экстракции проводили путем добавления внешнего синтетического контроллера (cel-miR-39, Qiagen, Германия), РНК очищали на силикагелевых колонках и путем элюирования в объеме 14 мкл без-RNase воды. Для синтеза кДНК использовали реагенты TaqMan™ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, США; № 4366596) совместно со специфическими штаммами праймеров TaqMan™ MicroRNA Assays (США) для miR146a (№ 000468).

Выполнение количественной ПЦР проводили на 96-луночных планшетах на амплификаторе QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием реагентов TaqMan™ Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG, США, № 4324018). В качестве референсной РНК использовали U6 snRNA, уровень экспрессии которой оставался стабильным во всех исследуемых группах.

Для выполнения каждой реакции использовали три технических повторности, для оценки относительной экспрессии микроРНК применяли метод Ливака (2^-ΔΔCt).

Статистическая обработка результатов

После получения цифрового материала рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение, статистически анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в пакете программ SPSS (v.16.0 для Windows, 2007; SPSS, Inc., Чикаго, Иллинойс). Значимые различия обозначены как p < 0,05, при подсечете процентного соотношения данные первой группы принимали за 100%. Для проверки одномерности распределения результатов использовали диаграммы по типу «ящик с усами» [26]. Статистическую обработку и построение диаграмм и графиков проводили с помощью программы Statistica10.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате проведенного исследования установлена зависимость экспрессии микроРНК miR146a на фоне ожирения, гонартроза и применения дексаметазона. В организме miR146a принимает участие в регуляции иммунного ответа и воспалительного процесса путем подавления последнего. МiR146a приводит к снижению продукции провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-8 и TNFα), принимает активное участие в регуляции дифференцировки Т-клеток, в нейровоспалительных процессах.

Исследованием установлено возрастание miR146a в группе 2, что дает право предполагать развитие воспаления в организме, которое вызывают цитокины, продуцируемые адипоцитами, и дополнительно провоцируемое гонартрозом. Использование в эксперименте дексаметазона приводит к снижению показателей miR146a в плазме крови во всех исследуемых группах на фоне его длительного применения в качестве противовоспалительного средства с целью лечения гонартроза, сочетанного с избыточной массой тела (табл. 1).

По результатам исследования установлено повышение показателя miR146a на третьи сутки в группе 2 на 188,6% (p < 0,05), на пятые сутки — на 184,5% (p < 0,05), на 10 сутки — на 146,6% (p < 0,05), в сравнении с группой 1, что может отражать развитие ответной реакции организма на воспаление, к которому приводит ожирение, сочетанное с гонартрозом. В группе 3 наблюдали снижение показателя miR146a в сравнении с группой 2, однако показатель оставался высоким. На третьи сутки miR146a выросла на 151,1% (p < 0,05), на пятые — на 156,7% (p < 0,05), спустя 10 суток эксперимента наблюдали повышение на 146,6% (p < 0,05) в сравнении с группой 1. При сравнении показателей групп 1 и 3 установлено повышение уровня miR146a на 151,5% (p < 0,05) на третьи сутки, на 156,7% (p < 0,05) — на пятые сутки, на 146,6% (p < 0,05) — 10 сутки.

При динамическом анализе экспрессии miR146a в группе 1 на пятые сутки увеличения не произошло, на 10 сутки уровень повысился на 106,1% (p < 0,05). В группе 2 на пятые сутки наблюдалось снижение miR146a на 2,2% (p < 0,05), на 10 сутки — на 3,3% (p < 0,05) в сравнении с третьими сутками и на 1,2% (p < 0,05) при сравнении с пятыми сутками эксперимента. В группе 3 на пятые сутки в сравнении с третьими сутками произошло повышение на 103,4% (p < 0,05), на 10 сутки — на 102,7% (p < 0,05) в сравнении с третьими сутками и снижение на 0,7% (p < 0,05) в сравнении с пятыми сутками. 

Введение в организм 10 нг/мл дексаметазона оказало более выраженный противовоспалительный эффект в группе 3 по сравнению с остальными. Показатель микроРНК miR146a был достоверно выше в сравнении с группой 1, но наблюдали его снижение по отношению к группе 2 (табл. 2).

Экспериментально установили повышение уровня экспрессии miR146a на третьи сутки эксперимента на 112,3% (p < 0,05), на пятые сутки — на 108,2% (p < 0,05), а на 10 сутки — на 113,5% (p < 0,05) в сравнении с группой 1, что было статистически меньше, чем в группе 2. При сравнении уровня экспрессии miR146a в группе 4 с показателями группы 2 установлено снижение на 40,5% (p < 0,05) на третьи сутки, на 41,4% (p < 0,05) — на пятые сутки, на 39,9% (p < 0,05) — на 10 сутки.

Динамический анализ показателя в пределах группы 4 дает понять четкую тенденцию к снижению уровня экспрессии miR146a на пятые сутки на 3,7% (p < 0,05) в сравнении с третьими сутками, на 10 сутки уровень вырос на 107,3% (p < 0,05) в сравнении с третьими сутками и на 111,4% (p < 0,05) в сравнении с пятыми сутками.   

Иной результат наблюдали при повышении дозы дексаметазона до 100 нг/мл. Показатель микроРНК miR146a был достоверно выше, чем в группе 1. В сравнении с группой 2 показатели незначительно отличались, но были достоверно ниже (табл. 3).

Наблюдали достоверное повышение показателя miR146a в группе 5 на третьи сутки на 176,2% (p < 0,05) в сравнении с группой 1. При исследовании микроРНК в плазме крови животных из группы 5 на пятые сутки показатель увеличился на 178,3% (p < 0,05) по отношению к группе 1. На 10 сутки эксперимента наблюдали достоверное повышение концентрации miR146a в  группе 5 на 159,2% (p < 0,05) в сравнении с группой 1. При сопоставлении показателей в группе 5 с группой 3 установили снижение концентрации на фоне введения дексаметазона, на третьи сутки на 6,6% (p < 0,05), на пятые сутки — на 3,4% (p < 0,05), на 10 сутки — на 5,7% (p < 0,05).

Динамика показателя внутри группы 5 продемонстрировала изменение уровня экспрессии miR146a на фоне введения дексаметазона, на пятые сутки показатель вырос на 101,1% (p < 0,05) в сравнении с третьими сутками, на 10 сутки он снизился на 2,4% (p < 0,05) в сравнении с третьими сутками и на 3,5% (p < 0,05) в сравнении с пятыми сутками.

Динамика изменения miR146a в плазме крови во всех исследуемых группах представлена на рисунок.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенного исследования установлено повышение концентрации микроРНК miR146a в плазме крови крыс во всех группах под действием дексаметазона в сравнении с группой контроля. У животных  группы 2 показатель был максимален, что свидетельствует в пользу воспалительного процесса, вызываемого группой цитокинов, выделяемых адипоцитами, и одновременным развитием, а также последующим  прогрессированием гонартроза [27]. Это обстоятельство подтверждается повышением экспрессии miR146a у животных группы 3. На фоне введения дексаметазона в дозе 1 нг/мл наблюдалось снижение уровня экспрессии miR146a у животных группы 3 в сравнении с группой 2, что указывает на противовоспалительные свойства дексаметазона даже в минимальной дозе. Уровень экспрессии miR146a в группе 3 оставался высоким по отношению к группе 1, что дает возможность предполагать низкую эффективность 1 нг/мл дексаметазона в отношении анализируемого показателя на протяжении всего периода исследования в сравнении с дозой в 10 нг/мл [28].

В группе 4 на фоне введения дексаметазона наблюдали более выраженное снижение уровня экспрессии miR146a, что можно также объяснить ингибированием цитокинов, угнетением воспаления, которое вызывает ожирение и избыточную массу тела [24]. Максимальный результат в этой группе наблюдался на пятые сутки эксперимента, что может свидетельствовать о накопительном эффекте препарата за счет его ежедневного использования или о блокировке рецепторов клеток, чувствительных к цитокинам [29]. На 10 сутки при сохранении противовоспалительного эффекта уровень экспрессии miR146a незначительно повышается, что может быть связано со снижением восприимчивости рецепторов к препарату или повышенным его метаболизмом.

В группе 5 на фоне применения дексаметазона не наблюдали значительного изменения показателей miR146a в сравнении с группой 2, что говорит в пользу низкой эффективности дозы 100 нг/мл дексаметазона на протяжении всего периода эксперимента. Подобное может свидетельствовать о гибели рецепторов к дексаметазону за счет его высокой концентрации или невосприимчивости к нему в высокой дозе, несмотря на противовоспалительные свойства препарата [30].

ВЫВОДЫ

В процессе исследования установлено, что максимальный положительный эффект был достигнут в группе 4, о чем говорит стойкое и наиболее значимое снижение уровня экспрессии miR146a. Данное обстоятельство дает возможность рекомендовать дозу 10 нг/мл в качестве патогенетически обоснованного лечения гонартроза, сочетанного с ожирением на протяжении длительного периода времени. Незначительный положительный эффект от введения дексаметазона наблюдался в группе 3, поскольку дексаметазон приводил к снижению уровня экспрессии miR146a, однако показатель оставался высоким по отношению к группе 1. Дексаметазон в дозе 1 нг/мл может быть рекомендован в качестве патогенетической терапии болевого синдрома или при наличие минимального воспалительного процесса, а также при лечении гонартроза, не сочетанного с ожирением. Установлено, что доза 100 нг/мл дексаметазона не проявляет эффективность на протяжении всего периода введения и не приводит к выраженному снижению уровня экспрессии miR146a в группе 5: уровень оставался высоким, колебания показателя были незначительны на протяжении всего периода эксперимента. В связи с этим нельзя говорить о дозозависимом эффекте дексаметазона 100 мг на показатель miR146a, что требует дальнейшего клинического изучения. Перспектива дальнейших исследований состоит в изучении эффекта от применения других разновидностей микроРНК плазмы крови на фоне гонартроза, сочетанного с ожирением, а также уровня глюкозы крови на фоне применения дексаметазона, функции рецепторов клеток к дексаметазону и концентрации провоспалительных цитокинов, состояния коры надпочечников. Вызывает интерес дальнейшее изучение и подбор дозы дексаметазона в зависимости от уровня экспрессии miR146a в клинической практике.