Исследование влияния генетических особенностей матери на репродуктивную функцию и на процессы эмбриогенеза имеет большое значение для решения проблемы увеличения рождаемости. Беременность и роды требуют от клеток организма женщины способности эффективно отвечать на стресс и способности значительно увеличивать синтез белка в организме. Синтез белка — это центральное событие в функционировании эукариотической клетки, в том числе в ответ на стресс любой природы. Этот процесс, называемый трансляцией, осуществляется особыми молекулярными машинами — рибосомами. Рибосома человека состоит из двух компонентов — рибосомной РНК (рРНК) и 70–80 рибосомных белков [1]. Гены 28S, 5,8S и 18S рРНК (рДНК) в геноме человека представлены множественными копиями. Копии рДНК организованы в тандемные повторы длиной 43 т.п.н. на пяти парах акроцентрических хромосом. Каждая единица повтора включает транскрибируемую область длиной 13,3 т.п.н. (47S рРНК), содержащую гены 28S, 5,8S, 18S рРНК, транскрибируемые спейсеры (5´ETS и 3´ETS) и нетранскрибируемый межгенный спейсер (IGS). Вместе с копиями 5S рРНК (гены расположены на первой хромосоме) эти рРНК формируют рибосомы [2]. Основная функция рибосомных повторов — это синтез рРНК для рибосом. Транскрипция рДНК осуществляется РНКполимеразой I в особой клеточной структуре в составе ядра — в ядрышке (рисунок А).

Геном человека содержит приблизительно от 200 до 1000 копий тандемных рибосомных повторов [3–5]. Число копий рДНК в геноме клеток различного типа одного организма постоянно и не изменяется с возрастом или в условиях стресса. Число копий рДНК одинаково также в составе одной клеточной популяции. Иными словами, число копий рДНК можно отнести к стабильным генетическим признакам, которые не изменяются на протяжении жизни человека [3]. В последние годы появляется все больше работ, указывающих на роль количества копий рДНК в геноме в функционировании организма человека и на ассоциацию этого признака с патологией и старением. Показано, что число копий рДНК ассоциировано с уровнем хронического воспаления и заболеванием почек [6], с массой тела [7], а также с наличием моногенной патологии (муковисцидоз) или полигенной патологии (шизофрения) [3]. Малое число копий рДНК ассоциировано с развитием когнитивных нарушений в пожилом возрасте [8], с более замедленным метаболизмом и с низкой устойчивостью клеток человека к стрессу [7, 9]. Содержание рДНК в клетках крови долгожителей варьирует в узком диапазоне значений — приблизительно от 290 до 530 копий. До возраста 90 лет и старше не доживают люди с более низкими или более высокими значениями числа копий рДНК в геноме [10].

В ядрышке транскрибируется примерно треть всех копий рДНК, которые называют активными копиями. Эти копии не метилированы, в отличие от транскрипционно неактивных копий, в которых метилирована транскрибируемая область рДНК. Количество активных копий рДНК пропорционально общему числу копий в геноме [11]. Приводятся данные, согласующиеся с гипотезой о существовании стабилизирующего отбора, действующего на уровне зигот и/или раннего эмбриогенеза и направленного на поддержание количества активных копий рДНК в интервале от   94 до  ̴ 277̴ копий (за пределами указанных пороговых значений клетка нежизнеспособна). Определена величина зиготических потерь по данному признаку (примерно 10%) [11, 12]. Полученные данные позволяют предположить, что потери зигот/эмбрионов при недостатке или избытке активных копий рибосомных генов в геноме могут быть одним из факторов, определяющих сниженную плодовитость у некоторых супружеских пар [13].

Влияние числа копий рДНК в геноме женщины на репродуктивную функцию и на процесс эмбриогенеза пока изучено недостаточно. В литературе есть только данные авторов, которые выявили положительную ассоциацию между успешностью ЭКО и количеством копий рДНК в лейкоцитах женщин [14]. Показано также, что замершая беременность ассоциирована с выраженным дисбалансом по содержанию рДНК в геноме эмбриона и геноме матери. В большинстве случаев геном неразвивающегося эмбриона содержит достоверно меньше копий рДНК, чем геном матери и геномы других эмбрионов, развитие которых не прерывалось самопроизвольно [15].

Следует отметить, что широко применяемый в практике анализа генов метод количественной ПЦР мало применим к анализу многокопийных рибосомных повторов в силу ряда причин, которые подробно рассмотрены ранее [16]. Тандемный характер повторов, большое количество самокомплиментарных участков,  различный уровень метилирования копий, повышенная окислительная модификация множественных Gn-богатых участков рДНК приводят к тому, что рДНК является очень плохой матрицей для Taq-полимеразы. Мы наблюдали нелинейную зависимость эффективности реакции амплификации от концентрации и уровня окисления рДНК, в отличие от других последовательностей генома. Специально для количественного анализа рДНК был разработан метод нерадиоактивной количественной гибридизации (NQH), который не зависит от уровня метилирования, окисления и фрагментации ДНК, поскольку не предполагает использования ПЦР. Денатурированные щелочью фрагменты ДНК, иммобилизованные на фильтре, гибридизуются с длинным ДНК-зондом, меченным биотином. Несколько калибровочных образцов ДНК с известным содержанием рибосомного повтора используют в качестве стандартов. Результаты, полученные с помощью NQH при исследовании рДНК в выборке здоровых доноров, полностью подтвердились более поздними исследованиями авторов, применивших новый метод анализа длинных фрагментов ДНК, не предполагающий использование реакции амплификации (Оксфордовская нанопора  [17]).

Целью нашего исследования было оценить связь между числом копий рибосомных генов в геноме матери и риском развития различных осложнений беременности. Для этого мы определили число копий рДНК методом NQH в геномах лейкоцитов женщин с нормально протекающей беременностью и беременностью с осложнениями/ особенностями, которые вызваны различными причинами.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Образцы крови женщин с нормально протекающей беременностью и с осложненной беременностью, были получены в рамках совместной работы с Кафедрой акушерства и гинекологии Педиатрического факультета ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н. И. Пирогова.

Образцы венозной крови для анализа количества копий рДНК в лейкоцитах были взяты у 488 беременных женщин в возрасте 18–45 лет (средний возраст 32 ± 5 лет, срок гестации 25–39 недель), проживающих в г. Москве (РФ) в одинаковых социальных условиях. Кроме того, для сравнения были взяты опубликованные ранее данные, отражающие содержание рДНК в геномах долгожителей (n = 103, женщин 84%) возраста 91–101 год [3]. Были сформированы группы 1–8 (табл. 1).

Критерии включения: группа 1 (контрольная группа) — женщины с нормально протекающей беременностью без какой-либо выявленной патологии, родившие здоровых детей без признаков гипоксии и гипотрофии; группы 2–8 — женщины с проблемной беременностью, с диагнозами, указанными в табл. 1.

Критерии исключения: наличие у пациента хронических заболеваний (диабет, аутоиммунные болезни, сердечнососудистые, онкологические) и наследственной патологии; наличие острых инфекций на момент забора крови; табакокурение, употребление алкоголя, прием наркотических веществ или лекарств; предыдущие неудачные беременности.

Специальные исследования

Выделение ДНК из 1 мл крови проводили методом фенольной экстракции. Эритроциты крови лизировали (0,25% хлорид аммония), лейкоциты осаждали центрифугированием при 400 g в течение 10 мин, к осадку добавляли 1 мл лизирующего буфера (1% лаурилсаркозилат натрия, 0,02 M EDTA, рН 7) и обрабатывали РНКазой А с концентрацией 0,075 мг/мл (Sigma; США) в течение 45 мин (37 °C). Далее смесь обрабатывали протеиназой К 0,2 мг/мл (Promega; США) в течение 24 ч при 37 °C. После двух циклов экстракции с насыщенным фенольным раствором ДНК осаждали добавлением двух объемов этанола в присутствии 2 M ацетата аммония. Затем осадок дважды промывали 75%-м этанолом, высушивали и растворяли в воде.

Этап определения концентрации ДНК в образце является критичным для анализа. Концентрацию определяли двумя методами — спектрофотометрическим (регистрировали спектр поглощения на приборе Shimadzu UV-160A) и флуориметрическим. Использовали флуоресцирующий краситель PicoGreen (Sigma; США). Флуоресценцию регистрировали на приборе LS-55 (Perkin Elmer; США). 

Для определения числа копий рибосомного повтора в составе ДНК, выделенной из крови, применяли  метод нерадиоактивной количественной дот-гибридизации с биотинированными ДНК-зондами, который подробно описан ранее [16]. Денатурированные 0,1М NaOH пробы ДНК, набор калибровочных образцов ДНК с известным содержанием рДНК и отрицательный контроль на неспецифическое связывание  наносили в одинаковом количестве (20 нг) в нескольких повторах на нитроцеллюлозные фильтры и после температурной иммобилизации инкубировали с биотинированным ДНКзондом (рисунок А). Зонд p(5´ETS-18S) — клонированный в pBR322 плазмиду фрагмент рДНК, который включает участок рибосомного повтора от ‒515 позиции до 5321 по отношению к точке начала транскрипции (HSU 13369; GenBank accession No.U13369). Фрагмент содержит небольшой фрагмент нетранскрибируемого спейсера, внешний транскрибируемый спейсер (5´ETS) и часть гена 18S рРНК.  Зонд биотинировали, используя набор для никтрансляции Biotin NT Labeling Kit (Jena Bioscience GmbH, Jena, Германия).

После проведения гибридизации сигнал визуализировали при помощи конъюгата стрептавидин — щелочная фосфатаза (Merck) и колориметрического субстрата. Для количественного определения рДНК по интенсивности сигнала пятна использовали программу Imager 6, позволяющую вычислять интегральную интенсивность сигнала от каждого пятна. Сигналы от всех пятен, соответствующих одному и тому же образцу, суммировали и вычисляли среднее арифметическое и среднеквадратическую ошибку для каждого образца. Содержание копий рибосомного повтора рассчитывали по калибровочной кривой, которая отражает зависимость сигнала от числа копий рДНК в контрольных образцах ДНК, которые были нанесены на фильтр в том же количестве, что и анализируемые образцы ДНК. Относительная ошибка анализа составила 5 ± 3%.

Статистическая обработка

Описательная статистика для количественных переменных представлена в табл. 1 в формате среднего арифметического и стандартного отклонения (±SD), значений медианы и интервала варьирования (I), значений доверительного интервала (CI 95%) и коэффициента вариации (К_вар : среднеквадратичное отклонение, разделенное на среднее). Сравнение двух групп проводили методом непараметрической статистики Манна–Уитни (р). Для сравнения нескольких групп использовали тест Краскела– Уоллиса (Н, р). Распределения измеряемого параметра в группах сравнивали методом Колмогорова–Смирнова (D, α). За критическое значение уровня значимости брали 0,05. С использованием поправки Бонферрони на множественные тесты  различия признавали статистически значимыми при p ≤ 0,0062. Для расчета применили программу StatPlus2007 (http://www.analystsoft.com/).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего проанализировали 488 образцов ДНК, которые выделили из лейкоцитов крови беременных женщин в возрасте 18–45 лет. Число копий рДНК определено методом нерадиоактивной количественной гибридизации, который был специально разработан для анализа тандемных рибосомных повторов генома человека [16]. Для гибридизации использовали биотинированный ДНК-зонд, который гомологичен фрагменту рибосомного повтора длиной 5836 нуклеотидов (рисунок А). Количество рДНК представляли как число копий повтора на диплоидный геном.

Количественные данные для всей выборки, разбитой на восемь групп, представлены на рисунок Б. В табл. 1 даны характеристики групп и данные описательной статистики. На рисунок В приведены распределения образцов ДНК в группах по числу копий рДНК в геномах. В исследуемой выборке 488 образцов ДНК содержание рДНК варьирует от 226 до 800 копий на диплоидный геном. В том же диапазоне значений варьирует содержание рДНК в популяции практически здоровых людей без явной генетической патологии в возрасте до 70 лет [3].

Для сравнения на рисунок В дано распределение образцов ДНК по копийности рДНК в группе долгожителей (данные опубликованы ранее [3]). Число копий рДНК в геномах долгожителей варьирует в узком диапазоне значений от   ̴ 290 до  ̴ 520 копий. Этот диапазон представляет своеобразную адаптивную норму для популяции. Люди с большим числом копий рДНК (более 550) и с низким числом копий (менее 280) не доживают до возраста 90 лет и более. В более молодой выборке (от 3 до 75 лет) число образцов ДНК с копийностью рДНК вне диапазона долгожителей составляет около одной трети [3].   

Сравнение исследуемых восьми групп беременных женщин  по числу копий рДНК в геноме лейкоцитов крови с использованием непараметрической статистики Краскела–Уоллиса выявило достоверные различия между группами (Н = 30,2; p < 10–4 , n = 8). Далее с использованием непараметрической статистики Мана– Уитни мы сравнили группу 1 (женщины с нормально протекающей беременностью, без какой-либо выявленной патологии, родившие здоровых детей без признаков гипоксии и гипотрофии) с группами 2–8. Данные сравнения распределений (метод Колмогорова–Смирнова) и количеств рДНК в группах (метод Манна–Уитни) представлены в табл. 2.

Группа 2 (нарушение маточно-плацентарного кровотока и фетоплацентарная недостаточность) и группа 1 (контроль) с учетом поправки Бонферрони достоверно не различаются по числу копий рДНК (p > 0,006) и не различаются распределением этого параметра (D = 0,12, α = 0,29). Однако при анализе распределений (рисунок В) обнаружено, что группа 2 содержит в 2 раза больше низкокопийных вариантов рДНК (8%), чем группа 1 (4%).                                         

Группа 3 (врожденные пороки развития и хромосомные аномалии) и группа 4 (истмико-цервикальная недостаточность) также не отличаются от группы 1 по содержанию копий рДНК (p > 0,006) и по распределению образцов ДНК по величине параметра в группах. Однако в этих группах нет образцов ДНК с низким числом копий рДНК (менее 290), в отличие от групп 1 и 2.

Анализ методом Краскела–Уоллиса показал, что группы 1–4 не различаются по числу копий рДНК между собой (Н = 2,9, р = 0,41, n = 4).

Группы 5 (преждевременное созревание плаценты), 6 (дихориальная диамниотическая двойня), 7 (многоводие) и 8  (крупный плод)  не различаются по числу копий рДНК между собой (Н = 1,27; р = 0,74, n = 4). Каждая из групп 5–8 достоверно отличается по количеству копий рДНК и/или по распределению признака от контрольной группы 1. Группы содержат меньшие количества копий рДНК в ДНК по сравнению с контролем (табл. 2). Эти группы не содержат образцов ДНК с низкими значениями числа копий рДНК и не содержат образцов с высокими (более 600 копий) количествами рДНК. В группе 1 с нормальной беременностью число таких образцов составляет соответственно 12 и 18%.

Группы 5–8 по содержанию рДНК в геноме и по распределению этого параметра  наиболее близки к адаптивной норме числа копий рДНК в группе долгожителей (рис.1; табл. 1 и 2). Для этих групп характерны относительно низкие значения параметра, низкие коэффициенты вариации (0,12–0,19) по сравнению с группой 1 (К_вар = 0,25) и отсутствие низкокопийных (менее 290 копий на геном) вариантов рДНК.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Рибосомные повторы человека, расположенные в р-районах пяти пар акроцентрических хромосом, характеризуются выраженным количественным полиморфизмом. Диапазон варьирования рДНК в изученной нами выборке составил 595 копий, что подтверждает ранее полученные данные о вариабельности рибосомных повторов [3, 5, 11]. Число копий рДНК у человека — это стабильный, одинаковый во всех клетках организма, генетический признак, который не изменяется в процессе жизни и при действии факторов стресса [3]. Наступление беременности, по-видимому, также не изменяет общее число копий рДНК в геноме лейкоцитов крови женщины.

Мы исследовали вариацию числа копий рДНК  в группе женщин с нормально протекающей беременностью (группа 1; табл. 1) по сравнению с женщинами, беременность которых сопровождалась различными осложнениями. Вся выборка разделилась на две части после анализа количества копий рДНК в геноме.

Нарушение маточно-плацентарного кровотока и фетоплацентарная недостаточность (группа 2), врожденные пороки развития и хромосомные аномалии (группа 3), и истмико-цервикальная недостаточность (группа 4) — эти осложнения не ассоциированы с изменениями в количестве копий рДНК в геномах женщин по сравнению с геномами женщин с нормальной беременностью без осложнений (группа 1). Однако для групп 3 и 4 был обнаружен один нюанс, который не сказался на общем анализе. В этих группах отсутствовали образцы ДНК с очень низким (менее 290 копий) содержанием рДНК. В группах 1 и 2 таких образцов было 4 и 8%.

Группы 5–8, которые включают женщин с преждевременным созреванием плаценты, дихориальной диамниотической двойней, многоводием и крупным плодом, также не содержат низкокопийных вариантов рДНК, в отличие от группы контроля и группы 2 (рисунок В). Это может говорить о том, что для реализации процесса эмбриогенеза, осложненного причинами, которые указаны для групп 3–8, геном матери должен содержать более 290 копий рДНК. Организм женщины с более низким числом копий рДНК, по-видимому, не способен обеспечить приемлемый уровень биогенеза рибосом для ответа на стресс, индуцируемый отягощенной беременностью.

В пользу этого говорят данные об ассоциации числа копий рДНК с результативностью процедуры ЭКО. Женщины с низким количеством копий рДНК в геноме (среднее 305 ± 57) не смогли забеременеть после нескольких попыток, в то время как женщины с большим количеством копий рДНК (499 ± 62) успешно забеременели с первой попытки [14].

Мы полагаем, что отсутствие низкокопийных вариантов рДНК  в геноме женщин в группах 3–8 ассоциировано с отбором на ранней стадии эмбриогенеза. Наличие патологии/особенности у эмбриона, возможно, требует от генома матери повышенного уровня биогенеза рибосом для реализации развития эмбриона. Низкое количество рДНК в геноме матери, возможно, ассоциировано с остановкой развития эмбриона с патологией/особенностью на ранней стадии. Поэтому на 25–39-й неделе беременности не встречаются низкокопийные варианты в группах 3–8. Кроме того, низкое количество копий рДНК у матери может наследоваться эмбрионом, особенно если в отцовском геноме число копий тоже не велико. Показано, что эмбрионы с низким числом копий рДНК достоверно чаще не развиваются (замершая беременность) по сравнению с эмбрионами с нормальным числом копий рДНК [15]. Отрицательная роль малого числа копий рДНК в отцовском геноме была показана ранее [18]. Авторы установили, что общее число копий рДНК в сперматозоидах коррелирует с уровнем метилирования рДНК и, следовательно, с количеством транскрипционно активных копий рДНК, которые обеспечивают нужный уровень биогенеза рибосом. Сперматозоиды мужчин с идиопатическим бесплодием содержали достоверно меньшее общее число копий рДНК, а значит, и меньшее количество активных копий, чем сперматозоиды мужчин с нормальной фертильностью.

Интересно отметить, что низкое число копий рДНК в геноме ассоциировано не только с недостаточным уровнем биогенеза рибосом. Функции рибосомных повторов в составе ядрышек не ограничиваются продукцией субъединиц для рибосом [19, 20]. Ядрышко — это центр, в котором происходит координация синтеза рибосом, прогресса клеточного цикла и ответа клеток на различные виды стресса. Исследования показали, что эпигенетический статус рибосомных генов и целостность структуры ядрышка могут модулировать гомеостаз клетки [21–23]. Открытие структурных и функциональных связей между ядрышком и остальным геномом клетки позволили высказать предположение, что ядрышко играет ключевую роль в организации архитектуры ядра. Малое количество копий рДНК дестабилизирует гетерохроматин и повышает вероятность хромосомных перестроек [24]. Вариации в числе копий рибосомных повторов изменяют ответ клеток на повреждение ДНК. Клетки с низким содержанием рДНК более чувствительны к различным факторам стресса [25].

Парадоксальным кажется тот факт, что в группах с патологией/особенностью беременности среднее содержание рДНК в геноме снижено по сравнению с контрольной группой, несмотря на отсутствие низкокопийных вариантов рДНК (рисунок Б, В; табл. 1). В этих группах наряду с отсутствием низкокопийных снижено и число высококопийных образцов ДНК. Интервал варьирования и коэффициент вариации для этих групп значительно снижены по сравнению с группой 1 (нормальная беременность). Казалось бы, большое число копий рДНК в геноме должно обеспечить большее количество рибосом и лучший ответ на стресс, ассоциированный с патологией. Для ответа на этот вопрос мы привлекли данные о вариации числа копий рДНК при генетической патологии и в группе долгожителей, которые опубликованы ранее [3]. Согласно этим данным, большое число копий рДНК в геноме человека ассоциировано с наличием  генетической патологии. Геном эмбриона в процессе эмбриогенеза требует более интенсивного синтеза белков для ответа на стресс, индуцируемой этой патологией. Если количество рДНК недостаточно для поддержания приемлемого для реализации генома уровня биогенеза рибосом, то эмбриогенез не происходит. Большое число копий рДНК обнаружили в геномах больных с моногенной патологией (муковисцидоз) и с полигенной патологией (наследственные формы шизофрении) [3], а также в геномах людей с почечной недостаточностью и с хроническим воспалением [6]. Таким образом, большое число копий рДНК в геноме — это своеобразный маркер наличия в этом геноме мутаций/ полиморфных вариантов последовательности ДНК, которые влияют на многие процессы в организме, на продолжительность жизни и, вероятно, на успешную реализацию репродуктивной функции. 

У людей, которые дожили до возраста долгожителей (старше 90 лет) число копий рДНК варьирует в узком диапазоне значений и немного снижено по сравнению с популяцией людей в возрасте до 70 лет. Геномы долгожителей не содержат ни высококопийных, ни низкокопийных вариантов рДНК [3]. Интересно отметить, что распределение образцов ДНК по числу копий рДНК в группах 5–8 не отличается от распределения в группе долгожителей (табл. 2). По-видимому, только геном, который содержит достаточно большое количество рДНК для нормального уровня биогенеза рибосом и не содержит каких-либо вредных для нормального функционирования клеток вариантов последовательности ДНК (маркер — аномально высокое содержание рДНК), позволяет женщине выносить плод, несмотря на преждевременное созревание плаценты, многоводие, наличие двойни и крупного плода.

Ограничения исследования

Необходимо отметить, что выводы по группам с малым количеством женщин (5, 6 и 8; n < 20) являются предварительными и требуют проверки на более крупных когортах.

ВЫВОДЫ

Диапазон числа копий рДНК от   300 до  ̴ 500 в геноме ̴ женщины (адаптивная норма, характерная для долгожителей), по-видимому, является оптимальным с точки зрения успешного завершения беременности, даже если возникают осложнения. Низкое число копий рДНК в геноме женщины ассоциировано с невозможностью реализации эмбриогенеза при наличии патологии/особенности плода. Большое содержание рДНК указывает на наличие в геноме женщины генетических вариантов, которые могут препятствовать протеканию осложненной беременности.

Определение числа копий рДНК в геномах и женщин и мужчин может быть полезным для планирования и прогнозирования течения беременности. Этот подход требует дальнейшего изучения  для возможного внедрения в медицинскую практику.