С тех пор как молекулярно-генетическими методами в полости матки обнаружена резидентная микробиота [1], исследования микробиоты эндометрия являются одним из приоритетных направлений в области микробиома человека [2, 3]. При этом вышеуказанное, основополагающее исследование Mitchell с соавторами [1] было выполнено на матках после гистерэктомии, что гарантирует отсутствие контаминации вагинальной и цервикальной микробиотой и подтверждает наличие резидентных микроорганизмов именно в эндометрии. В последующих аналогичных исследованиях на экстирпированных матках было показано, что общее количество бактериальной ДНК в эндометрии примерно в 10 раз ниже [4] или сопоставимо с таковым в цервикальной слизи [5].

Очевидно, что в реальной клинической практике в исследованиях микробиома эндометрия практически всегда используют трансцервикальное взятие образцов из полости матки: катетером для интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов или переноса эмбрионов [6, 7], гистероскопически [8–10], зондами типа Пайпель-C1 (Пайпель-биопсия) и C2 (Эндобраш) [11–20] или схожей с зондом C2 конструкцией с наружным и внутренним проводниками [21, 22]. В большинстве исследований предпринимаются дополнительные меры для снижения риска контаминации, включая предварительную обработку влагалища/цервикаса физиологическим раствором или антисептиками и сравнительный анализ микробиоты разных отделов репродуктивного тракта [6, 7, 9–22]. Однако надежность этих подходов, особенно в контексте молекулярно-генетической диагностики, остается предметом дискуссий. По результатам исследования трансцервикально собранных образцов эндометрия были выявлены ассоциации между микробиотой эндометрия и невынашиванием беременности [23], хроническим эндометритом [24], эндометриальными полипами [10, 18], гиперплазией эндометрия [20], эндометриозом [25] и синдромом поликистозных яичников [26].

Из-за особенностей анатомии женского урогенитального тракта (УГТ) любой способ трансцервикального взятия биоматерила из полости матки сопровождается рисками контаминации образца вагинальной и особенно цервикальной микробиотой, тем более, что проба эндометрия содержит заведомо меньшее количество микроорганизмов [4]. Большая часть представленных работ не описывают возможного влияния данной контаминации на полученные результаты, что заставляет задуматься о реальном происхождении полученной микробиоты. Этот методологический пробел ставит под вопрос обоснованность заключений в части опубликованных данных о «микробиоме эндометрия», который может представлять собой смесь микробиоты цервикса и эндометрия или же артефакт, вызванный контаминацией. Помимо возможного искажения результатов микробиологического исследования, важно отметить, что трансцервикальное взятие материала из полости матки является инвазивной процедурой, сопровождающейся риском заноса патогенных микроорганизмов из нижних отделов УГТ.

Принимая во внимание вышеизложенные риски, нужно основательно взвешивать все возможности и потенциальные ограничения исследования микробиоты эндометрия в трансцервикально отобранных образцах, в том числе с использованием зондов типа Пайпель C1 и C2 как наиболее популярных инструментов, используемых с данной целью [11–20]. Для оценки данных возможностей и ограничений необходимо понимать реальную эффективность зондов типа Пайпель C1 и C2 в предотвращении контаминации эндометриальных образцов цервикальной микробиотой.

Цель исследования — экспериментально оценить эффективность урогенитальных зондов типов C1 и С2 в предотвращении контаминации цервикальной микробиотой образцов эндометрия, предназначенных для исследования микробиоты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Разработка экспериментальной модели шейки матки

Для экспериментальной оценки эффективности зондов была разработана in vitro модель, имитирующая прохождение через цервикальный канал, заполненный слизью с бактериями.

Изготовление анатомических моделей шейки матки

Модели цервикального канала двух типов создавали из 2%-й агарозы. Были разработаны два типа моделей: модель с цилиндрическим каналом (n = 18), имитирующая шейку матки нерожавшей женщины, и модель со щелевидным каналом (n = 18), имитирующая шейку матки рожавшей женщины.

В стерильные пробирки типа Эппендорф со срезанным дном и с отверстием диаметром 5 мм в крышке помещали формообразующие стержни: для цилиндрического канала — стержень диаметром 1,5 мм (внутренняя часть зонда С2), для щелевидного канала — пластиковую призму 3 × 0,5 мм. Пробирки заполняли агарозой и после полимеризации извлекали формовочные элементы. Оба отверстия пробирки (дно и крышка) герметизировали слоями стерильной парафиновой ленты. Непосредственно перед экспериментом цервикальные каналы моделей заполняли приготовленной модельной слизью и инкубировали при 37 °C. Фото готовых моделей представлены на рис. 1.

Приготовление модели цервикальной слизи

Непосредственно перед экспериментом готовили модель цервикальной слизи на основе нестерильного геля из желатина (желатин быстрорастворимый пищевой в гранулах 220 блюм, Тилло Желло, Таджикистан) и альгината натрия (порошок Альгината натрия пищевого вязкость 300–400, Qingdao Nanshan Yuanquan Seaweed Co., Ltd., Китай). Сначала готовили два отдельных раствора: 4%-й раствор желатина (40 мг в 1 мл стерильной воды с 20 мкл 10% CaCl₂) и 3%-й раствор альгината натрия (30 мг в 1 мл стерильной воды). Оба исходных раствора инкубировали при 60 °C в течение 30 мин в термостате «Гном» («ДНК-Технология», Россия) и тщательно перемешивали на вортексе.

Равные объемы (по 2 мл) приготовленных растворов переносили в отдельные шприцы, соединяли переходником Luer Lock и аккуратно перемешивали вручную в течение 2 мин, в результате получали финальный гель с концентрацией 2% желатина и 1,5% альгината натрия, растяжимостью 1–2 см. Для целенаправленной контаминации слизи в шприц с финальным гелем аспирировали 200 мкл смеси бактериальных культур, содержащей равные объемы клинических изолятов Lactobacillus acidophilus, Escherichia coli и Staphylococcus aureus (оптическая плотность 0,5 по Макфарленду для каждого). После добавления бактерий гель повторно перемешивали через переходник для равномерного распределения микроорганизмов. Для приготовления демонстрационных моделей с целью лучшей визуализации цервикального канала в слизь дополнительно вносили 0,3%-й водный раствор метиленового синего.

Использованные для отбора проб зонды

Для отбора проб использовали три типа зондов (рис. 2): универсальный урогенитальный зонд A2 («Медицинские изделия», Россия); зонд типа C «Пайпель», модель 1 («Юникорнмед», Китай); зонд типа C «Пайпель», модель 2 («Юникорнмед», Китай). Зонд A2 использовали для отбора проб цервикальной слизи из канала модели шейки матки, зонды типа «Пайпель» — для взятия пробы воздуха после прохождения цервикального канала моделей шейки матки (имитация стерильной полости матки).

Дизайн исследования и протокол взятия проб

В общей сложности использовали 36 моделей шейки матки: 18 с цилиндрическим и 18 с щелевидным каналом. Для каждого экспериментального запуска использовали по три модели с цилиндрическим и три модели со щелевидным каналом. Всего было проведено по три независимых повторных эксперимента для зондов типа C1 и для зондов типа C2. Протокол взятия проб включал два этапа.

На первом этапе универсальным зондом типа A2 забирали пробу слизи из цервикального канала с глубины 1–1,5 см и переносили ее в стерильный физиологический раствор.

На втором этапе, после взятия цервикальной пробы, зондом типа C1 или C2 полностью проходили цервикальный канал для забора пробы за пределами внутреннего зева (имитация полости матки). При использовании зонда C1 после выхода на 3 см за пределы канала аспирировали пробу воздуха. При использовании зонда C2 щетку раскрывали, совершали несколько поворотных движений и закрывали.

После взятия пробы зонд извлекали (C2, в закрытом состоянии), наружную поверхность обрабатывали 96%-м этанолом для удаления остатков цервикальной слизи и предотвращения контаминации пробы ее микробиотой, после чего пробу переносили в физиологический раствор. В качестве отрицательного контрольного образца (ОКО) в конце каждого эксперимента выполняли забор пробы воздуха зондами C1/C2 без предварительного прохождения через модельную систему.

Молекулярно-генетический анализ

Выделение тотальной ДНК из всех образцов проводили с использованием набора «Проба-НК-ПЛЮС» («ДНКТехнология», Россия). Количественный анализ микробиоты выполняли с помощью ПЦР-набора «Андрофлор» ( «ДНКТехнология», Россия) с детекцией следующих мишеней: общая бактериальная масса (ОБМ), Lactobacillus spp., Staphylococcus spp. и группы Enterobacteriaceae/Enterococcus (группа EE). Минимальный порог обнаружения для ОБМ и всех целевых групп микроорганизмов — 10³ геном-эквивалентов на образец (ГЭ/образец). Для каждого отобранного образца выполняли одну постановку в ПЦР. Амплификацию целевой ДНК и детекцию продуктов амплификации проводили в приборах ДТ-Прайм 5M с использованием штатного программного обеспечения производителя («ДНКТехнология», Россия). Результат представляли как медиану по всем экспериментальным образцам со значениями 1-го и 3-го квартилей.

Оценка эффективности зондов в предотвращении контаминации

Для оценки эффективности зондов в предотвращении контаминации цервикальной микробиотой для каждой модели рассчитывали процент переноса бактериальной ДНК из цервикальной слизи в свободную от бактериальной ДНК пробу полости матки по формуле:

формула

где % переноса — процент перенесенной ДНК-матрицы; ДНК_{МО, полость матки (C1/C2)} — количество ДНК целевого микроорганизма в пробе «стерильной полости матки», отобранной исследуемым зондом C1 или C2; ДНК_{МО, цервикальная слизь (A2)} — количество ДНК целевого микроорганизма в цервикальной слизи той же модели, отобранной универсальным зондом A2.

Статистический анализ

Статистическую обработку и визуализацию данных проводили в среде R версия 4.5.2 (R Foundation for Statistical Computing; Вена, Австрия). Количественные показатели представлены в виде медианы и значений 1-го и 3-го квартилей. Для сравнения двух независимых групп применяли непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исходный состав микробиоты моделей

Для оценки исходной контаминации цервикальной слизи отобрали образцы из всех 36 анатомических моделей шейки матки (18 с цилиндрическим и 18 с щелевидным каналом) с помощью универсального зонда типа A2. Микробные составы образцов, отобранных из моделей с цилиндрическим и щелевидным каналами, статистически значимо не различались (табл. 1). Медианные уровни бактериальной ДНК были сопоставимы между группами моделей по всем исследуемым параметрам: ОБМ (10^4,9 и 10⁵, p = 0,128), Lactobacillus spp. (10^3,5 и 10^3,7, p = 0,375), Staphylococcus spp. (10^3,4 и 10^3,6, p = 0,410) и группе EE (10^4,3 и 10^4,5, p = 0,199).

Эффективность зондов Пайпель-C1 и Пайпель-C2

Перед сравнительным анализом эффективности зондов C1 и C2 проводили проверку сопоставимости исходных моделей, предназначенных для их тестирования. Выявлено, что в группе моделей для зонда C1 исходное содержание Staphylococcus spp. было статистически значимо ниже (10^3,1 против 10^3,8, p < 0,001), а бактерий группы EE — значимо выше (10^4,6 против 10^4,4, p = 0,049), чем в группе для зонда C2. Уровни ОБМ (10⁵ и 10^4,9, p = 0,612) и Lactobacillus spp. (10^3,8 и 10^3,6, p = 0,526) между группами значимо не различались (табл. 2).

При использовании зондов Пайпель-C1 наблюдали значительный перенос бактериальной ДНК из цервикальной слизи в стерильные образцы «полости матки». Уровень переноса ОБМ варьировал от 14 до 172% (медиана — 81,6%, Q₁–Q₃: 54,4–107%; табл. 3). В 12 из 18 моделей перенос составил менее 100%, в шести пробах количество ОБМ в стерильных образцах полости матки превысило исходный уровень в цервикальной слизи. Уровень переноса ДНК специфичных групп бактерий составил для Lactobacillus spp. — 25,8% (0–38,7%), для группы EE — 27,6% (11,5–38,7%), для Staphylococcus spp. — 0% (0–0%), в 100% случаев ниже порога детекции (10³ ГЭ/образец).

При использовании зондов Пайпель-C2 отмечали перенос от 3,9 до 131% бактериальной ДНК (ОБМ) из цервикальной слизи в стерильные образцы полости матки (медиана — 29,8%, Q₁–Q₃: 14,8–56,3%, статистически значимо меньше, чем для типа C1, p = 0,009; табл. 3). В 12 из 18 моделей перенос составил менее 50%, в четырех пробах — от 50 до 100%, в двух пробах количество ОБМ в стерильных образцах полости матки превысило исходный уровень в цервикальной слизи. Уровень переноса для Lactobacillus spp. и группы EE был сопоставим с показателями зонда C1 и составил 36,2% (24,8–61,2%) и 19% (9,6–29,4%) соответственно. Уровень переноса Staphylococcus spp. оказался значимо выше, чем для зондов C1, и составил 14,8% (0–27,2%) (p = 0,004).

Влияние формы канала на эффективность зондов Пайпель-C1 и Пайпель-C2

Зонды C1 и C2 различались по эффективности в зависимости от формы цервикального канала и группы микроорганизмов (табл. 4).

Для зонда C1 в цилиндрических каналах наблюдали значительно меньший уровень контаминации Lactobacillus spp. (0% против 35,2%, p = 0,032) и группой EE (19,7% против 37,5%, p = 0,027). Для Staphylococcus spp. (0% против 0%, p = 0,350) и ОБМ (71,3% против 81,6%, p = 0,730) значимых различий между формами каналов не выявлено.

Для зонда C2, напротив, отмечена тенденция к лучшим показателям в щелевидных каналах по уровню контаминации ОБМ (17,2% против 50,8%, p = 0,052), тогда как для остальных параметров уровни контаминации были сопоставимы между моделями с цилиндрическим и щелевидным каналами: Lactobacillus spp. (41,5% против 33,8%, p = 0,309), Staphylococcus spp. (19,7% против 10%, p = 0,413) и группа EE (19,7% против 16,1%, p = 0,136).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В большинстве исследований микробиоты эндометрия перед трансцервикальным взятием пробы предпринимаются меры по снижению риска контаминации, включая визуальный контроль и обработку физиологическим раствором/ антисептиками [6, 7, 9–13, 15–22]. Однако вызывает сомнение эффективность антисептиков в деконтаминации в силу короткой экспозиции, особенно в случае молекулярногенетических исследований, которые детектируют ДНК как живых, так и погибших микроорганизмов. Скорее эффект антисептиков будет обусловлен только механическим удалением части микробных клеток. Авторы ряда работ дополнительно анализируют микробиоту влагалища и/или цервикального канала [6, 13, 14, 16, 17, 19, 22], что позволяет выявить грубые случаи контаминации из дистальных отделов, но не решает проблему смешения микробиот разных анатомических ниш.

Изначальное назначение зондов типа Пайпель C1/ C2 — взятие образцов эндометрия для гистологических или цитологических исследований [27, 28]. Аспирацию образца в случае использования зонда типа C1 производят только после прохождения цервикального канала [27]. Зонд типа C2 снабжен специальным защитным проводником, который предохраняет расположенную внутри него щетку от контакта со слизистой цервикального канала; щетка раскрывается только после введения в полость матки, а перед извлечением задвигается внутрь проводника. Данные конструктивные решения позволяют минимизировать попадание в образец клеток цервикального происхождения.

При использовании зондов C1/C2 для микробиологического исследования эндометрия предполагается, что их конструкция обеспечит защиту от контаминации цервикальной микробиотой. Однако в этом случае необходимо учитывать два критических нюанса: заведомо меньшее количество бактерий в полости матки по сравнению с цервикальным каналом [4] и невозможность дифференцировать происхождение бактерий в образце (в отличие от гисто- и цитологических исследований, где клетки цервикса и эндометрия различаются по морфологии).

Для оценки реального риска контаминации в полностью контролируемых условиях, исключающих ограничения клинических методов контроля, нами была разработана экспериментальная in vitro модель, имитирующая прохождение через цервикальный канал, заполненный слизью с бактериями (рис. 1). Растяжимость использованной в моделях цервикальной слизи составляла 1–2 см, что соответствовало средней растяжимости реальной цервикальной слизи в пролиферативную фазу менструального цикла [29]. Общее количество бактериальной ДНК (ОБМ) в образцах модельной слизи составляло 10⁵ ГЭ/образец, что соответствовало медианному уровню ОБМ в цервикальных образцах женщин при использовании аналогичной ПЦР тестсистемы в ранее проведенных нами исследованиях (неопубликованные данные). Возможное присутствие в геле нецелевой бактериальной ДНК не являлось препятствием для решения поставленной задачи, поскольку контаминацию оценивали по проценту микробной ДНК-матрицы, перенесенной в эндометриальную пробу из пробы цервикальной слизи той же модели.

Медианный уровень переноса бактериальной ДНК из цервикальной слизи в образцы полости матки составил 81,6% и 29,8% для зондов типа C1 и C2 соответственно (табл. 3). Обычно количество бактериальной ДНК в пробах из полости матки не превышает или ниже количества бактериальной ДНК в цервикальном канале [4, 5], поэтому такой перенос приводит к существенному или даже критическому искажению результатов. При использовании зондов C1 фактически вместо исследования эндометриального образца происходило повторное исследование пробы из цервикального канала. В шести из 18 случаев взятия зондами типа C1 и в двух из 18 случаев взятия зондами типа C2 концентрация бактериальной ДНК в эндометриальной пробе оказалась даже выше, чем в цервикальной пробе, что может быть связано с более эффективным взятием цервикальной слизи зондами C1/C2 по сравнению с зондом A2 для данных пар образцов.

Уровни переноса ДНК Lactobacillus spp. и группы EE значимо не отличались при использовании зондов C1 и C2: медианные уровни переноса составили 19–36,2%. Для Staphylococcus spp. уровень переноса для зондов C1 оказался значимо ниже, чем для зондов C2 (0% против 14,8%, p = 0,004). Однако эти различия, вероятнее всего, объяснимы исходно низким содержанием Staphylococcus spp. в моделях, использованных для тестирования зондов C1 (10^3,1 против 10^3,8 в моделях для зондов C2, p < 0,001) (табл. 2). Разница в исходных концентрациях, в свою очередь, вероятно, обусловлена разрушением стафилококков с деградацией их ДНК в исходной смеси микроорганизмов, которая хранилась в холодильнике в течение трех недель между сериями экспериментов (серия экспериментов с зондами C1 была проведена после получения результов экспериментов с зондами C2). При аналитической чувствительности использованной ПЦР тест-системы 10³ ГЭ/образец практически любое снижение от исходной концентрации 10^3,1 приводило к отрицательному результату для данной группы микроорганизмов.

Результаты исследования продемонстрировали зависимость между формой цервикального канала и уровнем переноса бактериальной ДНК (табл. 4). При использовании зондов C1 отмечен значимо больший перенос ДНК Lactobacillus spp. и группы EE в случае щелевидной формы каналов (типичная форма цервикального канала для рожавших женщин). Тогда как при использовании зондов типа C2 отмечали тенденцию к большему переносу ОБМ для моделей шеек матки с цилиндрической формой каналов (типичная форма цервикального канала у нерожавших женщин).

Следует отметить, что нам скорее всего не удалось полностью воссоздать реальные условия: сопротивление стенок цервикального канала, химический состав и точные реологические свойства слизи, возможный градиент микроорганизмов в цервикальном канале. Следовательно, полученные значения процента переноса бактериальной ДНК не могут быть напрямую экстраполированы на клиническую практику. Тем не менее, результаты убедительно демонстрируют, что взятие биоматериала из полости матки зондами типа Пайпель-C1 и Пайпель-C2 всегда сопровождается переносом части цервикальной микробиоты в эндометриальный образец. Основная контаминация при взятии пробы зондом C2, по всей видимости, происходит после прохождения цервикального канала — в момент раскрытия зонда в полости матки на щетку попадает цервикальная слизь, налипшая на защитный проводник во время прохождения цервикального канала (рис. 1Д, Е). Можно предположить, что аналогичная проблема возникает и при использовании других вариантов трансцервикального взятия образцов, поскольку любое устройство для взятия фиксирует на себе и проталкивает цервикальную слизь в полость матки. Более того, трансцервикальное взятие биоматериала в секреторную фазу, может приводить к еще большей контаминации из-за увеличения растяжимости слизи [29].

Установленный факт контаминации цервикальной микробиотой при использовании зондов типа Пайпель C1/C2, с одной стороны, ставит под сомнение эндометриальное происхождение микробиоты в подобных образцах, а с другой — подтверждает реальный риск ятрогенного заноса инфекции в полость матки при выполнении данной процедуры. В связи с принципиальной невозможностью разделения цервикальной и эндометриальной микробиоты в полученных образцах представляется логичной переориентация исследований с анализа «микробиоты эндометрия» на изучение совокупной цервикоэндометриальной микробиоты в общем образце, взятом одновременно из цервикального канала и полости матки.

ВЫВОДЫ

В проведенном исследовании урогенитальные зонды типа Пайпель-C1 и Пайпель-C2 не обеспечивали надежной защиты эндометриальных образцов от контаминации цервикальной микробиотой. Оба типа зондов пропускали значительное количество бактериальной ДНК: медианный уровень переноса составил 81,6% для C1 и 29,8% для C2. Хотя для зонда C2 отмечали 2,5–3-кратное превосходство в эффективности по сравнению с C1, уровень контаминации в 29,8% до сих пор является критическим, учитывая что у большинства пациенток количество микроорганизмов в полости матки заведомо ниже, чем в цервикальном канале. Эффективность зондов зависела от анатомической формы цервикального канала и исследуемой группы микроорганизмов: для зонда C1 эффективность значимо снижалась в щелевидных каналах для Lactobacillus spp. и Enterococcus/Enterobacteriaceae, тогда как для зонда C2 отмечена тенденция к ухудшению показателей в цилиндрических каналах по уровню общей бактериальной контаминации. Полученные данные заставляют переосмыслить результаты исследования микробиоты полости матки в образцах, полученных с помощью зондов типов Пайпель-C1 и Пайпель-C2, а также других способов трасцервикального отбора проб. В качестве конструктивной альтернативы представляется целесообразным переориентировать исследования с анализа микробиоты эндометрия на изучение совокупной цервико-эндометриальной микробиоты в общем образце, взятом одновременно из цервикального канала и полости матки, что позволит избежать методологических артефактов, связанных с контаминацией.