Рак молочной железы (РМЖ) остается одной из наиболее серьезных проблем современной онкологии из-за своей высокой распространенности, высокой смертности и частого метастазирования. Недавние достижения в области методов жидкостной биопсии открыли новые возможности для разработки подходов, позволяющих точнее прогнозировать клиническое течение заболевания. Среди наиболее перспективных объектов исследования — циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК), представляющие собой опухолевые клетки, отделившиеся от первичной опухоли и циркулирующие в кровотоке. Повышенный уровень ЦОК в периферической крови часто коррелирует с неблагоприятным прогнозом, что делает их ценным инструментом для стратификации пациентов и оптимизации стратегий лечения [1]. Однако клиническое применение ЦОК сталкивается с рядом проблем, включая их низкую концентрацию в крови и технические трудности обнаружения [2]. Большинство исследований ЦОК основаны на методах определения экспрессии EpCAM [3]. Это предпочтение во многом обусловлено доступностью коммерчески сертифицированных систем, предназначенных для обнаружения EpCAM-позитивных ЦОК [4]. Хотя опухолевые клетки, экспрессирующие EpCAM, традиционно считали основными драйверами метастазирования, все больше данных подчеркивает важную роль субпопуляций, не экспрессирующих EpCAM [5]. Потеря экспрессии мембранного EpCAM часто связана с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП) — процессом, при котором эпителиальные клетки теряют полярность и межклеточную адгезию, приобретая мезенхимальные черты, такие как повышенная подвижность и устойчивость к апоптозу [6]. При прогрессировании опухоли ЭМП способствует подвижности опухолевых клеток, их инвазии, интравазации, выживанию в кровотоке и образованию метастазов после экстравазации в отдаленные органы [7]. Следовательно, ЦОК представляют собой гетерогенную популяцию, включающую клетки с различными эпителиальными и мезенхимальными фенотипами, а также свойствами, подобными свойствам стволовых клеток, что может лежать в основе их метастатического потенциала.

В контексте исследования гетерогенности ЦОК значительный интерес представляют хемокиновые рецепторы CXCR4 и CXCR7, активируемые их общим лигандом SDF-1 (CXCL12). Наиболее хорошо изученной функцией оси CXCR4–SDF-1 является опосредование направленной миграции клеток-предшественников костного мозга и иммунных клеток к местам воспаления. Хорошо известно, что CXCR4 и CXCR7 часто сверхэкспрессированы в опухолевых клетках, а их взаимодействие с SDF-1 играет решающую роль в прогрессировании рака и метастазировании [8]. Опухолевые клетки с повышенной экспрессией CXCR4 демонстрируют повышенную пролиферацию, обусловленную активацией сигнальных путей MAPK и PI3K/Akt, в то время как повышенные уровни антиапоптотических белков и сниженная экспрессия рецепторов клеточной гибели способствуют выживанию клеток [9]. Первоначально CXCR7 считали рецептором-ловушкой, который секвестрирует CXCL12, тем самым ослабляя активность CXCR4 [10]. Однако последние данные показывают, что CXCR7 может передавать сигнал через неканонический путь β-аррестина, что приводит к активации внутриклеточных каскадов, включая пути протеинкиназы B (AKT) и JAK/STAT, которые дополнительно стимулируют пролиферацию и миграцию опухолевых клеток [11]. Согласно литературным данным, высокая экспрессия CXCR4 коррелирует с повышенным риском метастазирования РМЖ в лимфатические узлы и отдаленные органы, а также со снижением безрецидивной и общей выживаемости [12]. Подводя итог, можно сказать, что, хотя паттерны экспрессии CXCR4 и CXCR7 в первичных опухолях молочной железы были подробно описаны, число исследований, изучающих их экспрессию в ЦОК, остается крайне ограниченным.

Целью данного исследования было изучить экспрессию хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 в субпопуляциях ЦОК с положительной (EpCAM⁺) и отрицательной (EpCAM⁻) экспрессией EpCAM у больных РМЖ, а также оценить их связь с клинико-патологическими параметрами и прогностической значимостью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

В исследование включены 65 пациенток с инвазивной протоковой карциномой молочной железы неспецифического типа, проходившие лечение в клинике НИИ онкологии Томского национального исследовательского медицинского центра (табл. 1, табл. 2). Исследование ЦОК выполняли до всех видов лечения. Пациенты получали лечение в полном объеме согласно клиническим рекомендациям Министерства здравоохранения РФ. Период наблюдения составил 6 лет.

Проточная цитометрия

Для выявления ЦОК использовали образцы венозной крови, полученные от больных РМЖ. Клеточные концентраты готовили методом седиментации с последующим сбором слоя лейкоцитов на границе раздела между осадком эритроцитов и отделенной плазмой, а также всей надосадочной жидкости по методу, описанному Р. А. Поспеловой [13].

Образцы для проточной цитометрии готовили следующим образом. Клеточный концентрат промывали добавлением 1 мл раствора CellWASH (BD Biosciences, США) и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин. Для лизирования эритроцитов добавляли 500 мкл буфера OptiLyse C (Beckman Coulter, Франция), образцы промывали 2 мл раствора CellWASH в течение 10 мин при 300 g, после чего надосадочную жидкость удаляли. После блокирования неспецифического связывания Fc-рецепторов с помощью раствора для блокирования Human TruStain FcX™ (BioLegend, США) к клеточному концентрату добавляли 5 мкл следующих моноклональных антител: BV570 против человеческого CD45 (клон HI30; Sony Biotechnology, США), BV650 против человеческого CD326 (EpCAM) (клон 9C4; Sony Biotechnology, США), BV510 против человеческого CD44 (клон G44-26; BD Horizon, США), PerCP/Cy5.5 против человеческого CD24 (клон ML5; Sony Biotechnology, США), BV421 против человеческого CXCR4 (клон 12G5; Sony Biotechnology, США), BV421 против человеческого CXCR7 (клон 10D1; BD Biosciences; США) и PE/Cy7 против человеческого N-кадгерин (клон 8C11; Sony Biotechnology, США). Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.

После инкубации пробы промывали 2 мл раствора CellWASH в течение 10 мин при 300 g, удаляя надосадочную жидкость. Для внутриклеточного окрашивания к каждому неокрашенному и окрашенному образцу добавляли 250 мкл раствора BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, США) с последующей инкубацией в темноте при 4 °C в течение 20 мин. Затем образцы дважды промывали в 1 мл буфера BD Perm/Wash (BD Biosciences, США) путем центрифугирования при 300 g в течение 6 мин. Затем к каждому образцу добавляли 50 мкл буфера BD Perm/Wash и 5 мкл следующих антител: AF647-anti-human CK7/8 (клон CAM5.2; BD Pharmingen, США), AF488-anti-human Snail1 (клон 20C8; eBioscience, США) и AF750-anti-human Vimentin (R&D Systems, США). Образцы инкубировали при 4 °C в течение 20 мин.

Затем каждый образец промывали в 1 мл буфера CellWASH (BD Biosciences; США) центрифугированием при 300 g в течение 6 мин. На заключительном этапе к осадку добавляли 100 мкл буфера для окрашивания клеток (Sony Biotechnology; США) и ресуспендировали образец. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Novocyte 3000 (ACEA Biosciences; США) с использованием программы NovoExpress 1.3.0 (ACEA Biosciences; США). Концентрацию циркулирующих клеток рассчитывали на 1 мл крови.

Статистический анализ проводили с использованием пакета Prism 10.4.1 (GraphPad Software; США). Для анализа независимых групп использовали критерий Краскела‒Уоллиса, а для анализа двух независимых групп — критерий Манна‒Уитни. Для оценки прогностической ценности точности прогноза использовали ROC-анализ. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Транскриптомное секвенирование единичных ЦОК

Для изучения транскриптомного профиля EPCAM^– и EPCAM⁺ ЦОК был использован набор данных РНК- секвенирования 20 пациентов с РМЖ (T1-4N0-3M0, все молекулярные подтипы), полученный в нашем предыдущем исследовании [14], доступный через BioProject под регистрационным номером PRJNA776403.

Для контроля качества и анализа данных секвенирования РНК отдельных клеток использовали программный пакет Seurat версии 4.0.4 [15]. Дуплеты клеток идентифицировали с помощью DoubletFinder [16] и затем удаляли из каждого набора данных. Была проведена интеграция 20 наборов данных с параметрами по умолчанию. Агрегированные данные прошли предварительную обработку с исключением клеток с числом уникальных признаков менее 200 и процентом митохондрий более 25. Необработанные значения UMI РНК в агрегированных данных были нормализованы, после чего был проведен анализ главных компонент (PCA). Набор данных был визуализирован и исследован с помощью метода равномерного многообразия аппроксимации и проекции (UMAP), нелинейного метода редукции размерности.

Анализ данных пространственной транскриптомики ткани опухоли молочной железы

Набор данных пространственной транскриптомики, созданный в нашем предыдущем исследовании [17] и доступный в базе данных GEO под регистрационным номером GSE242311, был использован для исследования экспрессии генов в EPCAM^– и EPCAM⁺ опухолевых клетках в первичной опухоли пяти пациентов с РМЖ (инвазивная карцинома неспецифического типа, люминальные A и B, стадии I^–IIA, степень злокачественности 2^–3). Данные были отфильтрованы для исключения генов с ненулевой экспрессией менее чем в 10 регионах ткани и регионы ткани с менее чем 200 отфильтрованными генами. Первичные значения были нормализованы с помощью функции SCTransform [18] с параметрами по умолчанию. Затем к нормализованным с помощью SCTransform значениям был применен метод аппроксимации и проекции равномерного многообразия (UMAP) с использованием первых 30 главных компонент, определенных с помощью анализа главных компонент (PCA). Результаты визуализировали с помощью пакета Seurat.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Связь между количеством EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК, экспрессирующих CXCR4 и CXCR7, и клиническими параметрами у пациентов с РМЖ

Количество EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК оценивали в периферической крови пациентов с РМЖ. EpCAM⁺ ЦОК определялись как клетки, экспрессирующие EpCAM, но не экспрессирующие пан-лейкоцитарный антиген CD45, независимо от экспрессии цитокератинов 7/8. EpCAM^– ЦОК определялись как CD45-отрицательные клетки без экспрессии EpCAM, но позитивные по цитокератинам 7/8. Анализ показал, что количество EpCAM⁺ ЦОК было значительно выше, чем количество EpCAM^– ЦОК (p = 0,0237). Медиана количества EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК составила 0,00 (0,00^–1,25) и 0,83 (0,00^–3,32) кл./мл соответственно.

EpCAM⁺ ЦОК демонстрировали значительно более высокую экспрессию хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 по сравнению с EpCAM^– ЦОК (25/45 против 6/45; p < 0,001). В частности, среди EpCAM⁺ ЦОК преобладали клетки, позитивные по CXCR4/7, тогда как среди EpCAM^– ЦОК чаще встречались клетки, негативные по CXCR4/7. Медианное количество CXCR4/7⁺ клеток составило 0,83 (0,00^–2,12) кл./мл для EpCAM⁺ ЦОК и 0,00 (0,00^–0,00) кл./мл для EpCAM^– ЦОК. Напротив, медианное количество CXCR4/7^– клеток составило 0,00 (0,00^–0,00) кл./мл для EpCAM⁺ ЦОК и 0,00 (0,00^–0,83) кл./мл для EpCAM^– ЦОК. Более того, количество ЦОК, экспрессирующих CXCR4/7, было значительно выше среди EpCAM⁺ ЦОК по сравнению с EpCAM^– ЦОК (p < 0,001), с медианными значениями 0,83 (0,00^–2,12) кл./мл и 0,00 (0,00^–0,00) кл./мл соответственно.

Анализ количества EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК, экспрессирующих CXCR4/7, в зависимости от клинико-gатологических параметров не выявил значимых ассоциаций с клиническими параметрами (Приложение, рис. 1A–Г).

В течение шестилетнего периода у трех пациентов наблюдали прогрессирование заболевания: у одного — рецидив опухоли, а у двух — отдаленные метастазы. Эти пациенты были отнесены к группе с прогрессированием, остальные — к группе без прогрессирования. Сравнительный анализ количества EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК, экспрессирующих CXCR4 и CXCR7, выявил значительное увеличение общей популяции EpCAM^– ЦОК, а также EpCAM^– CXCR4/7⁺ и EpCAM^–CXCR4/7^– субпопуляций у пациентов с прогрессированием (p = 0,0007, p = 0,0184 и p = 0,0013 соответственно) (рис. 1A). Значимых различий в количестве EpCAM⁺ ЦОК, независимо от экспрессии CXCR4/7, между пациентами с признаками прогрессирования и без них в течение периода наблюдения выявлено не было (p > 0,05) (рис. 1Б).

ROC-анализ количества EpCAM^– ЦОК с учетом экспрессии CXCR4/7 у пациентов с прогрессированием в течение 6 лет наблюдения продемонстрировал прогностическое значение как параметров EpCAM^–, так и EpCAM^–CXCR4/7^– (рис. 2). Количество EpCAM^– ЦОК >2,23 кл./мл периферической крови предсказывало прогрессирование со 100,0% чувствительностью и 95,1% специфичностью (AUC = 0,96, 95% ДИ: 0,91^–1,00; p = 0,008).

Аналогично, количество EpCAM^– CXCR4/7^– ЦОК >1,25 кл./мл предсказывало прогрессирование со 100,0% чувствительностью и 85,7% специфичностью (AUC = 0,96, 95% ДИ: 0,89^–1,00; p = 0,009). Эти результаты свидетельствуют о том, что популяция EpCAM^–CXCR4/7^– ЦОК имеет прогностическое значение, тогда как клетки EpCAM^–CXCR4/7⁺ нет (AUC = 0,80, 95% ДИ: 0,47^–1,00; p = 0,089).

Анализ маркеров стволовых клеток и ЭМП в EpCAM^– CXCR4/7^– ЦОК, ассоциированных с прогрессированием опухоли, выявил наличие признаков стволовых клеток, основанных на экспрессии маркеров CD44/CD24, CD133 и ALDH1A1. Количество EpCAM^–CXCR4/7^–CD44⁺CD24^– CD133⁺ALDH1A1⁺ ЦОК было значительно выше у пациентов с прогрессированием в течение периода наблюдения по сравнению с пациентами без прогрессирования (p = 0,003). Медиана количества ЦОК с фенотипом CD44⁺CD24^–CD133⁺ALDH1A1⁺ составила 0,00 (0,00^–0,00) кл./мл у пациентов без прогрессирования и 1,66 (0,00^–1,68) кл./мл — у пациентов с прогрессированием. При оценке особенностей ЭМП выявлена экспрессия N-кадгерина и Snail (p = 0,003). Медиана числа ЦОК с фенотипом N-сadherin⁺Snail⁺Vimentin^– у пациентов без признаков прогрессии и с их наличием составила 0,00 (0,00^–0,00) и 2,24 (0,00^–4,98) кл./мл соответственно.

Ассоциация экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 с признаками стволовых клеток среди EpCAM⁺ и EpCAM^– CTC

Для оценки связи между признаками стволовости и экспрессией хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 были проанализированы частота и количество ЦОК, экспрессирующих маркеры стволовости CD44/CD24, CD133 и ALDH1, среди EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК с учетом экспрессии CXCR4/7. Среди EpCAM⁺ ЦОК наибольшая частота наблюдалась для клеток с фенотипом CD44⁺CD24^– CD133⁺ALDH1⁺. В частности, частота встречаемости этих клеток составляла 51,1% (23/45) при экспрессии CXCR4/7 по сравнению с 11,1% (5/45) в отсутствие CXCR4/7. Таким образом, встречаемость клеток CD44⁺CD24^– CD133⁺ALDH1⁺ была значительно выше в EpCAM⁺ ЦОК, экспрессирующих хемокиновые рецепторы CXCR4/7 (p < 0,0001). Наибольшее количество клеток также характеризовалось фенотипом CD44⁺CD24^–CD133⁺ALDH⁺, независимо от экспрессии CXCR4/7 (рис. 3А). Количество клеток с этим стволовым фенотипом было выше среди EpCAM⁺CXCR4/7⁺  ЦОК (p < 0,0001). Медиана CD44⁺CD24^– CD133⁺ALDH⁺ среди EpCAM⁺CXCR4/7⁺ЦОК составила 0,56 (0,00^–1,67) кл./мл и 0,00 (0,00^–0,00) кл./мл среди EpCAM⁺CXCR4/7^– ЦОК. Среди EpCAM^–CXCR4/7⁺ЦОК частота встречаемости и количество клеток с вариантами стволовости не различались (p > 0,05) (рис. 3Б).

Частота встречаемости EpCAM^–CXCR4/7^– ЦОК была крайне низкой. Наиболее распространенным фенотипом среди этих клеток был CD44^–CD24^–CD133^–ALDH^– (12 из 45 случаев), в то время как частота всех остальных фенотипов не превышала 2 из 45 (p = 0,02). Кроме того, количество клеток CD44^–CD24^–CD133^–ALDH^– было значительно выше по сравнению с другими фенотипами, уровни значимости указаны на рисунке выше. Медианное количество клеток с этим фенотипом составило 0,00 (0,00^{– –}0,70) кл./мл (рис. 3Б). Оценка экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 в EpCAM⁺ ЦОК с различными фенотипами стволовых клеток показала, что доля клеток CD44⁺CD24^–CD133⁺ALDH1⁺, экспрессирующих CXCR4/7, значительно выше (p < 0,0001) (рис. 4A). Напротив, количество ЦОК с экспрессией CXCR4/7 и без нее достоверно не различалось среди клеток с другими фенотипами стволовых клеток (p > 0,05).

Анализ экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 в EpCAM^– ЦОК с учетом признаков стволовости не выявил значимых различий в экспрессии CXCR4/7 среди ЦОК с признаками стволовости (рис. 4Б). Однако значительно большее количество клеток, лишенных признаков стволовости, характеризующихся фенотипом CD44^–CD24^–CD133^–ALDH^–, были отрицательными по экспрессии CXCR4/7 (p = 0,0011).

Ассоциация экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 с признаками ЭМП в EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК

В EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК оценивали экспрессию раннего маркера ЭМП Snail, который подавляет эпителиальные маркеры и стимулирует экспрессию мезенхимальных маркеров, а также поздних маркеров ЭМП N-кадгерина и виментина. Среди EpCAM⁺CXCR4/7⁺ ЦОК наибольшая частота наблюдалась в клетках, экспрессирующих поздние маркеры ЭМП N-кадгерин и виментин, что составило 35,6% (16/45). Более того, количество клеток N-cadherin⁺Snail^–vimentin⁺ было достоверно выше, чем у N-cadherin⁺Snail^–vimentin^– и N-cadherin^–Snail^–vimentin^– ЦОК (p = 0,0003 и p = 0,0009 соответственно) (рис. 5A). Напротив, среди EpCAM⁺ ЦОК, не экспрессирующих CXCR4/7, распределение клеток с различными фенотипами ЭМП достоверно не различалось (p > 0,05). При этом среди CXCR4/7^– ЦОК практически не встречались клетки с фенотипом N-cadherin⁺Snail^– Vimentin⁺; их количество было выше среди CXCR4/7⁺ ЦОК (p < 0,0001) (рис. 5Б).

Анализ экспрессии ранних и поздних маркеров ЭМП в EpCAM^– ЦОК с учетом экспрессии CXCR4/7 не выявил значимых различий (p > 0,05) (рис. 6A). Примечательно, что среди EpCAM^– субпопуляции, экспрессирующей CXCR4/7, не было обнаружено клеток, коэкспрессирующих все три анализируемых маркера ЭМП.

Среди EpCAM^– ЦОК, лишенных N-кадгерина и экспрессирующих Snail, независимо от статуса виментина, значительно большее количество клеток были отрицательными по экспрессии CXCR4/7 (p = 0,0061 и p = 0,0189 соответственно) (рис. 6Б).

Экспрессия генов CXCR4 и CXCR7 в EPCAM⁺ и EPCAM^– ЦОК

В 20 проанализированных образцах пациентов с РМЖ было идентифицировано 239 ЦОК. EPCAM^– ЦОК были определены как клетки, в которых отсутствовала экспрессия генов PTPRC (CD45) и EPCAM, но наблюдалась положительная экспрессия генов цитокератина (KRT7, KRT8 или KRT18). Напротив, EPCAM⁺ ЦОК были охарактеризованы как клетки без экспрессии PTPRC (CD45) и с уровнем экспрессии гена EPCAM выше нуля, независимо от экспрессии цитокератинов. Следовательно, группы EPCAM⁺ и EPCAM^– ЦОК включали 11 и 228 клеток соответственно. Частота экспрессии генов рецепторов хемокинов SDF-1 — CXCR4 или CXCR7 — достоверно не различалась между клетками EPCAM⁺ и EPCAM^– и составляла 54,5% (6/11) и 53,5% (122/228) соответственно.

Анализ дифференциальной экспрессии генов между клетками EPCAM⁺ с экспрессией CXCR4/7 и без нее не выявил значимых различий (p > 0,05). Напротив, при сравнении внутри EPCAM^– субпопуляции различия были выявлены. Наиболее сверхэкспрессированные гены в EPCAM^– CXCR4/7⁺ ЦОК включали POSTN (p = 6,63 × 10^–13), FN1 (p = 5,24 × 10^–14), COL3A1 (p = 1,08 × 10^–11), VIM (p = 2,33 × 10^–19), S100A6 (p = 4,60 × 10^–9) и CD74 (p = 1,11 × 10^–7). Активированные сигнальные пути в клетках EPCAM^–CXCR4/7⁺ показаны на рис. 2 Приложения. Согласно базе данных KEGG 2021 Human, наибольшее количество сверхэкспрессированных генов было связано с метаболизмом рибосом (p = 2,365 × 10^–143), тогда как база данных MSigDB Hallmark 2020 определила путь Myc Targets V1 как наиболее активированный (p = 7,59 × 10^–11) (Приложение, рис. 2A).

В популяции EPCAM^–CXCR4/7^– ЦОК наблюдалась повышенная экспрессия множества генов, причем наиболее выражена сверхэкспрессия была у PF4 (p = 1,33 × 10^–24), PPBP (p = 5,40 × 10^–23) и TUBB1 (p = 1,62 × 10^–20) и др. Согласно базе данных KEGG 2021 Human, наибольшая группа генов с повышенной экспрессией была связана с путем ферроптоза (p = 3,315 × 10^–7), в то время как база данных MSigDB Hallmark 2020 выявила значительное обогащение сигнального пути андрогеновых рецепторов (p = 8,0 × 10^–5) (Приложение, рис. 2Б). Сравнение профилей транскрипции EPCAM⁺ и EPCAM^– ЦОК, экспрессирующих CXCR4/7, не выявило значимых различий (p > 0,05).

В период наблюдения, начавшегося в 2020 г., прогрессирование заболевания наблюдалось у четырех из 20 пациентов. У троих из них развились метастазы в отдаленные органы, а у одного пациента — в регионарные лимфатические узлы. Распределение субпопуляций ЦОК в образцах, полученных от отдельных пациентов, представлено в Приложении, табл. 1.

Значимых различий в частоте и количестве EPCAM⁺ и EPCAM^– ЦОК, экспрессирующих гены хемокиновых рецепторов CXCR4/7, между пациентами с различными результатами лечения в течение шестилетнего периода наблюдения выявлено не было (p > 0,05). Кроме того, был проведен дифференциальный анализ экспрессии генов в EpCAM^–CXCR4/7^– ЦОК у пациентов с прогрессированием заболевания и без него в течение периода наблюдения. В группе пациентов с прогрессированием опухоли экспрессия трех генов была значительно повышена: HBB (p = 1,34 × 10^–5), IGLC2 (p = 7,49 × 10^–6) и IGHM (p = 1,05 × 10^–5). Напротив, среди пациентов без прогрессирования была значительно повышена экспрессия только гена MALAT1 (p = 1,52 × 10^–2).

Пространственный транскриптомный анализ EPCAM⁺ и EPCAM^– опухолевых клеток в зависимости от экспрессии генов CXCR4 и CXCR7

Была проведена ручная аннотация регионов в пяти образцах РМЖ для выявления регионов, содержащих опухолевые клетки. Регионы, состоящие исключительно из стромальных клеток, или регионы, в которых количество стромальных клеток превышало количество опухолевых, были исключены из анализа. Впоследствии с помощью инструмента Gene Filter все регионы были разделены на две группы в зависимости от уровня экспрессии гена EPCAM. Участки с экспрессией EPCAM ≤ 2 единиц были обозначены как EPCAM^–, пятна с экспрессией EPCAM ≥ 3 единиц были классифицированы как EPCAM⁺. В каждой группе EPCAM⁺ и EPCAM^– регионов оценивали экспрессию генов хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7, что привело к выявлению кластеров, включающих регионы, отрицательные по обоим генам (CXCR4/7^–), и кластеров, содержащих регионы, экспрессирующие по крайней мере один из двух генов (CXCR4/7⁺). Транскрипционные профили регионов EPCAM⁺, экспрессирующих CXCR4 и/или CXCR7, сравнивали с профилями регионов, не экспрессирующих CXCR4/7. Регионы EPCAM⁺CXCR4/7⁺ демонстрировали значительное количество дифференциально экспрессируемых генов, большинство генов с повышенной экспрессией были связаны с сигнальными путями эстрогена (p = 0,0039) и процессами клеточной адгезии (p = 0,0039) (Приложение, рис. 3A). В то время как регионы EPCAM⁺CXCR4/7^– демонстрировали активацию эндоцитоза (p = 0,0359) и раннюю реакцию на эстроген (p = 1,435 × 10^–7) (Приложение, рис. 3Б).

Сравнение EPCAM^– регионов, основанное на экспрессии генов хемокиновых рецепторов CXCR4/7, выявило значительную активацию ЭМП (p = 1,6223 × 10^–58) и путей деградации и абсорбции белка (p = 5,723 × 10^–13) в EPCAM^–CXCR4/7⁺ участках (Приложение, рис. 4A). Кроме того, в участках EPCAM^–CXCR4/7⁺ наибольшее количество сверхэкспрессированных генов было связано с ранним ответом на эстроген (p = 1,442 × 10^–13) (Приложение, рис. 4Б).

Мы также сравнили транскрипционные профили EPCAM⁺ и EPCAM^– регионов, экспрессирующих CXCR4 и/или CXCR7 (Приложение, и ). Анализ выявил активацию контрольной точки G2-M в EPCAM⁺CXCR4/7⁺ в опухолевых регионах (p = 1,086 × 10^–8) (Приложение, рис. 5A). EPCAM^–CXCR4/7⁺ опухолевые регионы характеризовались активацией сигнатуры деградации и абсорбции белков (p = 4,231 × 10^–16) и ЭМП (p = 3,952 × 10^–30) (Приложение, рис. 5Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты данного исследования позволили выявить выраженную гетерогенность ЦОК у пациентов с РМЖ с различными фенотипическими и транскрипционными характеристиками, которые коррелируют с клиническими исходами. Объединив данные проточной цитометрии и транскриптомики, мы расширили представление о субпопуляциях ЦОК в зависимости от экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 и их функционального значения.

В литературе относительно мало исследований, посвященных экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 в ЦОК. В частности, в одной из работ была выделена ЦОК из периферической крови с использованием CD45- негативной селекции и последующей ОТ-ПЦР для оценки экспрессии целевых генов [19]. Авторы идентифицировали ЦОК, экспрессирующие эпителиальные маркеры (KRT19), а также мезенхимальные маркеры (TWIST1, SNAIL1, SLUG и ZEB1), и дополнительно охарактеризовали экспрессию генов различных хемокиновых рецепторов в этих популяциях. Результаты исследования показали, что эпителиальные KRT19⁺ ЦОК демонстрируют более высокий уровень экспрессии рецептора CXCR4 и его лиганда SDF-1 по сравнению с мезенхимальными ЦОК. В нашем исследовании анализ методом проточной цитометрии позволил выявить четкую дихотомию в экспрессии CXCR4/7 между различными субпопуляциями эпителиальных ЦОК. В то время как CXCR4/7⁺ ЦОК преобладали среди EpCAM⁺ ЦОК, популяция EpCAM^– была обогащена CXCR4/7^– клетками. Такая сегрегация позволяет предположить, что эти маркеры определяют отдельные субпопуляции эпителиальных ЦОК с различными биологическими характеристиками.

Важно отметить, что в литературе опухолевые клетки, экспрессирующие CXCR4, часто ассоциируются с опухолевыми стволовыми клетками [20]. Действительно, CXCR4⁺ опухолевые клетки демонстрируют ключевые характеристики стволовых клеток, включая высокую скорость пролиферации, устойчивость к традиционным методам лечения и повышенный метастатический потенциал [21]. В нашем исследовании не выявлена корреляция между признаками стволовости и экспрессией хемокиновых рецепторов CXCR4/7 ни в популяциях EpCAM⁺, ни в EpCAM^– ЦОК. Однако выявлены признаки стволовых клеток, характерные для субпопуляций EpCAM⁺ и EpCAM^– ЦОК. EpCAM⁺ ЦОК преимущественно характеризовались фенотипом стволовых клеток, определяемым как CD44⁺CD24^–CD133⁺ALDH⁺, тогда как EpCAM^– ЦОК в основном состояли из клеток, не имеющих маркеров стволовости (CD44^–CD24^–CD133^–ALDH^–). Анализ экспрессии ранних (Snail) и поздних (N-кадгерин и виментин) маркеров ЭМП выявил ассоциацию между экспрессией N-кадгерина и виментина и наличием хемокинового рецептора CXCR4/7 в клетках EpCAM^– ЦОК. Фенотип N-кадгерин⁺Snail^–виментин⁺ преимущественно наблюдался в субпопуляции EpCAM^– CXCR4/7⁺ ЦОК. Это согласуется с существующими данными, указывающими на то, что активация сигнальной оси CXCL12/CXCR4 может индуцировать ЭМП в клетках рака молочной железы посредством стимуляции сигнальных путей Wnt/β-катенин и mTOR [22].

Наши результаты подчеркивают необходимость выхода за рамки обнаружения ЦОК на основе EpCAM. Анализ экспрессии белка CXCR4/7 в ЦОК позволил идентифицировать связь между EpCAM^–CXCR4/7^– и прогрессированием опухоли, что свидетельствует о потенциальной прогностической ценности этой субпопуляции. Хотя клетки, экспрессирующие EpCAM, традиционно считали основным драйвером метастазирования, накапливающиеся данные подчеркивают важность EpCAM^– субпопуляции [5]. Потеря экспрессии EpCAM часто связана с ЭМП, при этом гибридный фенотип ЭМП, характеризующийся одновременной экспрессией эпителиальных и мезенхимальных маркеров, считается наиболее агрессивным и метастатическим [23]. В соответствии с этим, EpCAM^– CXCR4/7^– популяция, выявленная в нашем исследовании, характеризовалась наличием экспрессии маркеров ЭМП N-кадгерин и Snail. Удивительно, но субпопуляция EpCAM^– CXCR4/7^–, а не ожидаемая популяция CXCR4/7⁺, оказалась наиболее прогностически значимой, что указывает на то, что метастатический потенциал может не зависеть от путей распространения, управляемых хемокиновыми рецепторами.

Факт отсутствия прогностической ценности у EpCAM^– CXCR4/7⁺ ЦОК (несмотря на статистическую значимость в тестах Манна-Уитни) поднимает важные вопросы. Эти клетки могут находиться в транзиторном или спящем состоянии, когда сигнализация CXCR4/7 способствует выживанию в кровотоке, но не напрямую стимулирует опухолевую диссеминацию. Напротив, EpCAM^–CXCR4/7^– субпопуляция может содержать более агрессивные, ускользающие от иммунного надзора клоны, которые обходят традиционные методы обнаружения, но при этом стимулируют прогрессирование. Уточнение признаков стволовости и ЭМП в выявленной популяции ЦОК показало, что прогрессирование ассоциировано с клетками, характеризующимися стволовостью по экспрессии маркеров CD44/CD24, CD133 и ALDH1A1, а также с фенотипом ЭМП — N-сadherin⁺Snail⁺vimentin^–. Полученные результаты согласуются с данными мировой литературы, свидетельствующими о высоком метастатическом потенциале опухолевых клеток с признаками стволовости и ЭМП [24].

Транскриптомный анализ ЦОК выявил разительные различия между субпопуляциями. EPCAM^–CXCR4/7⁺ ЦОК демонстрировали выраженную сверхэкспрессию генов, связанных с ремоделированием внеклеточного матрикса и активацией стромы (POSTN, FN1, COL3A1, VIM, S100A6, CD74), что указывает на роль в формировании преметастатической ниши. Напротив, EPCAM^–CXCR4/7^– ЦОК демонстрировали повышенную экспрессию генов PF4, PPBP и TUBB1, связанных с динамикой тромбоцитов и микротрубочек, что потенциально указывает на альтернативные механизмы диссеминации. В частности, у пациентов с прогрессированием опухоли HBB, IGLC2 и IGHM были значительно сверхэкспрессированы, что, возможно, отражало иммунный процесс уклонения или клональную селекцию, тогда как MALAT1 был единственным геном, повышенным у пациентов без прогрессии в периоде наблюдения, что согласуется с его известной ролью в подавлении опухоли. Ген HBB, кодирующий бета-глобин (ключевой компонент гемоглобина), играет сложную и контекстно-зависимую роль в развитии РМЖ. Хотя экспрессия HBB традиционно ассоциируется с эритроцитами, он также был обнаружен в клетках РМЖ, где его функция, по-видимому, двойственна. В некоторых исследованиях сообщается, что повышенная экспрессия HBB коррелирует с повышенной агрессивностью опухоли, повышенным метастатическим потенциалом и неблагоприятным прогнозом для пациента [25]. Другие исследования, напротив, позволяют предположить, что HBB может оказывать опухолесупрессивное действие при определенных типах рака [26]. Два других идентифицированных дифференциально экспрессируемых гена связаны с синтезом иммуноглобулинов. Ген IGLC2 кодирует константную область легкой цепи иммуноглобулина λ, которая участвует в связывании антигена. На сегодняшний день единственное доступное исследование, связывающее экспрессию IGLC2 с РМЖ, указывает на его роль как предиктора благоприятного клинического исхода при подтипе трижды негативного РМЖ [27]. Напротив, в настоящее время нет данных относительно ассоциации экспрессии IGHM, который кодирует константную область тяжелой цепи иммуноглобулина М, с ростом или прогрессированием опухоли. В группе пациентов без признаков прогрессирования была обнаружена сверхэкспрессия только гена MALAT1. MALAT1 представляет собой длинную некодирующую РНК, ассоциированную с метастазами при аденокарциноме легких. Ее функция связана с регуляцией подвижности клеток и инвазивного потенциала [28]. Сообщалось также о том, что MALAT1 подавляет метастазирование РМЖ [29]. В частности, исследование показало, что MALAT1 может связываться с прометастатическим фактором транскрипции TEAD, инактивируя его и тем самым ингибируя миграцию и инвазию опухолевых клеток. Кроме того, авторы наблюдали, что экспрессия MALAT1 часто снижается при более агрессивных и метастатических формах РМЖ, что подтверждает его роль как супрессора метастазирования.

Пространственная транскриптомика первичных опухолей молочной железы дополнительно подтвердила эти результаты, показав, что регионы EPCAM^–CXCR4/7⁺ были обогащены генами, связанными с внеклеточным матриксом (COL1A1, COL3A1, FN1, POSTN, SPARC, BGN), что указывает на фиброзное, иммуномодулированное микроокружение. Напротив, регионы EPCAM^–CXCR4/7^– сверхэкспрессировали широкий спектр генов, среди которых STC2, TFF3, NPNT и CD24 были наиболее функционально значимыми, по нашему мнению, что указывает на особенности, связанные с агрессивным фенотипом. Несмотря на противоречивую связь с прогнозом, по последним данным, STC2, секретируемый ауто- или паракринно, функционирует как лиганд, способствуя выживанию клеток путем смягчения окислительного стресса [30]. Экспрессия фактора Trefoil 3 (TFF3) в опухолевой ткани считается прогностическим индикатором покоящегося ER⁺ рака молочной железы, при этом TFF3 функционирует как эпигенетически регулируемый драйвер поведения, связанного с покоем [31]. Эксперимент продемонстрировал, что подавление NPNT снижает адгезию раковых клеток к остеобластам, что подтверждает его роль в метастазировании в кости при РМЖ [32]. Несколько генов в регионах EPCAM^–CXCR4/7^– (CDH1, CRABP2, THSD4, SERPINA1, SERPINA3, HSPB1, KRT8, CD9, NUPR1, AZGP1) связаны с подавлением миграции и инвазии. Однако, существование механизмов интравазации, не требующих инвазии, и вышеизложенные данные могут указывать на функциональный метастатический фенотип, характерный для этой популяции. Вероятно, этот фенотип способен противостоять воздействию агрессивной среды, оставаясь в состоянии покоя и адаптируясь в преметастатической нише.

Эти результаты ставят под сомнение общепринятые представления о биологии ЦОК, поскольку субпопуляция EpCAM^– оказалась ключевым предиктором прогрессирования. Примечательно, что EpCAM^–CXCR4/7⁺ ЦОК демонстрируют способность к ремоделированию внеклеточного матрикса, тогда как EpCAM^–CXCR4/7^– субпопуляция может содержать более агрессивные клоны. Необходимы дальнейшие функциональные исследования для выяснения механистической роли этих субпопуляций ЦОК в метастазировании и резистентности к терапии.

Несмотря на значимые результаты, данное исследование имеет ряд существенных ограничений. Основной целью была характеристика ЦОК на основе экспрессии хемокиновых рецепторов CXCR4 и CXCR7 и их роли в рецептор-опосредованных путях распространения. Однако проспективный дизайн исследования ограничил набор пациентов с прогрессией, в результате чего было выявлено только три случая прогрессирования заболевания. Хотя небольшой размер выборки не позволяет сделать окончательные выводы, полученные результаты служат ценной основой для будущих исследований, направленных на выявление патогенетически значимых субпопуляций ЦОК. В частности, наш повторный анализ транскриптомных данных отдельных клеток подтвердил функциональные профили ЦОК, связанные с прогрессированием. Дополнительное подтверждение этому дают данные пространственной транскриптомики, которые выявили гетерогенность, связанную с CXCR4/7, в первичной опухоли, что согласуется с нашими результатами, полученными на материале ЦОК, и подчеркивает их биологическую значимость. Важно подчеркнуть, что данное наблюдательное исследование выявляет ассоциации между фенотипами ЦОК и клиническими исходами, однако требуют механистической валидации in vitro и in vivo. Кроме того, пространственная транскриптомика, хотя и информативна в отношении микроокружения опухоли, имеет ограниченное разрешение (~55 мкм), что может привести к усреднению сигнала по разным типам клеток. Эти ограничения не умаляют значимости полученных результатов, а, напротив, подчеркивают необходимость дальнейших исследований с более крупными когортами, с использованием анализа отдельных клеток и функциональных экспериментов для подтверждения выявленных закономерностей. Полученные данные создают прочную основу для расширенных исследований роли ЦОК, экспрессирующих CXCR4/7, в прогрессировании РМЖ.

ВЫВОДЫ

Принимая во внимание ограничения данного исследования, в частности, небольшой размер выборки пациентов с прогрессированием заболевания в период наблюдения, можно сделать несколько выводов. Прогрессирование опухоли, характеризующееся диссеминацией опухолевых клеток в отдаленные органы, может быть напрямую не связано с наличием рецепторов CXCR4 и CXCR7 в ЦОК. В то же время популяция EpCAM^– ЦОК, по-видимому, имеет патогенетическое значение для прогрессирования опухоли. Количество EpCAM^– ЦОК, независимо от экспрессии CXCR4 и CXCR7, было выше у пациентов с прогрессированием в период наблюдения. Этот факт подчеркивает необходимость смещения фокуса исследований ЦОК с EpCAM⁺, которые на протяжении более двух десятилетий демонстрировали ограниченную прогностическую ценность при раннем РМЖ, на EpCAM^– субпопуляцию. Транскриптомный анализ EPCAM^–CXCR4/7^– ЦОК выявил различные профили экспрессии генов; однако их точная роль в прогрессировании РМЖ остается недостаточно изученной. Учитывая как количественные, так и качественные изменения в этих клетках, вполне вероятно, что пациенты с неблагоприятным прогнозом характеризуются не только повышенным количеством EPCAM^–CXCR4/7^– ЦОК, но и изменениями их функциональных свойств.

Доступность данных

Наборы данных, проанализированные в данном исследовании, доступны в базе данных Gene Expression Omnibus (GEO) под номером доступа GSE242311 и в BioProject под номером доступа PRJNA776403.